蓝靛果（Lonicera caerulea）又名蓝靛果忍冬、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等，是忍冬科忍冬属植物，属于蓝果忍冬的变种[1]。蓝靛果为蓝黑色楔形果实，果皮带有白粉，果肉为酒红色，多汁，稍带苦涩味[2]。蓝靛果富含花青素（150~340 mg/100 g），花青素不仅可以作为食品的着色剂，在降血压、抗氧化、降血糖、抗癌等方面同样表现出较好的活性[3-6]。植物花青素的开发符合人们对天然、健康、安心食品原料追求的理念，成为近些年研究的热点。
花青素是黄酮醇类的水溶性天然植物色素，是花色苷水解而得的有颜色的苷元[7]，已发现的花青素有20 多种。花青素具有较强的清除自由基能力，表现出较好的抗氧化活性[8]。黑果枸杞花青素可以保护HepG2 细胞的H2O2 损伤，降低乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活力和丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶的活力，提高肝细胞的抗氧化活力[9]。花青素可提高细胞核内核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）表达，激活Nrf2-Keap1-ARE 通路，发挥抗氧化活性[10]。
Nrf2-Keap1-ARE 通路是抗氧化的关键通路，在机体氧化应激过程中被激活[11]。Nrf2 是Kelch 样ECH关联蛋白1（recombinant kelch Like ECH associated protein 1，Keap1）的负调节剂，激活Nrf2 可抑制Keap1，激活机体的防御系统，清除自由基，血红素加氧酶l（heme oxygenase，HO-1）和醌羟基氧化还原酶l（quinone oxidoreductase 1，NQO1）是Nrf2-Keap1-ARE 通路重要的细胞保护因子和中央调节剂，在机体氧化应激中发挥重要作用[12-14]。目前，关于蓝靛果花青素提取、纯化及抗氧化作用的研究较多，但关于调控Nrf2-Keap1-ARE 通路的抗氧化机制研究较少，探究蓝靛果花青素调控Nrf2-Keap1-ARE 通路的分子机制，确定其作用靶点，可为蓝靛果花青素的开发与利用奠定理论基础。
因此，本研究对蓝靛果花青素的体外抗氧化作用进行评价，并从细胞水平探讨蓝靛果花青素对H2O2 诱导Caco-2 损伤的保护作用，从Nrf2-Keap1-ARE 通路的关键酶和细胞因子调控上探讨蓝靛果花青素的抗氧化机制，以期为蓝靛果花青素在食品领域的更广泛应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
蓝靛果（‘加洛奇卡’，成熟度100%）：长白朝鲜族自治县三江源土特产有限公司。
1.1.2 试剂
1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：东京化成工业株式会社；2，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate acid），ABTS]：合肥博美生物技术有限公司；人结肠腺癌细胞（Caco-2）株：北京中科质检生物技术有限公司；细胞培养液（dulbecco′s modified eagle medium/nutrient mixture F-12，DMEM/F12）、特丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，t-BHQ）：美国Sigma 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性测定试剂盒、丙二醛含量测定试剂盒、总抗氧化能力测定试剂盒（total antioxidant capacity assay kit，T-AOC）：南京建成生物工程研究所有限公司；PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒、Recombinant DNase I 试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司；无水乙醇、硫酸亚铁（均为分析纯）：北京化工厂；水杨酸（分析纯）：天津市北辰区方正试剂厂；高硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
SPECTRA MAX 190 酶标仪：美国Molecular Devices 公司；CB150 型CO2 培养箱：德国BINDER 公司；Mx3000p 实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Agilent 公司；XM-3200UVF智能静音超声波清洗机：小美超声仪器（昆山）有限公司；TDL-5A 大容量离心机：常州市亿能实验仪器厂；722SP 型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；FD-1A-50 冷冻干燥机：上海豫明仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蓝靛果花青素的提取
按照前期优化的蓝靛果花青素提取工艺条件制备蓝靛果花青素。将蓝靛果解冻打浆，果浆调至pH5.0，复合酶（纤维素酶∶果胶酶=3∶1，质量比）添加量为0.6%，于50 ℃酶解50 min，过滤；滤渣用体积比为60%的乙醇超声浸提两次，超声浸提条件为料液比1∶15（g/mL）、浸提时间20 min、浸提温度60 ℃。合并滤液，4 000 r/min离心20 min，浓缩后冷冻干燥备用。
1.3.2 蓝靛果花青素的纯化
按照前期优化的蓝靛果花青素纯化工艺条件制备蓝靛果花青素纯化样品。将预处理的XR6702 大孔树脂装填于层析柱中（Φ3.5 cm×50 cm），以蓝靛果花青素上样浓度为2.5 mg/mL，pH4.0，上样体积为15 mL 进行吸附；以60%乙醇水溶液（pH4.0）进行洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min，收集编号为30~60 试管的波峰，真空浓缩，冷冻干燥得到纯化蓝靛果花青素，采用pH 差示法测定花青素的含量，其纯度为77.6%。
1.3.3 蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除作用
参考Wang 等[15]的方法，以维生素C（vitamin，VC）为对照组，DPPH 自由基的清除率（H，%）计算公式如式（1）所示。
式中：B 为加入样品的反应体系吸光度；C 为样品阴性对照组吸光度；A 为未加样品的反应体系吸光度。
1.3.4 蓝靛果花青素对ABTS+自由基的清除作用
参考付亚玲等[16]的方法，以VC 为对照组，ABTS+自由基的清除率（M，%）计算公式如式（2）所示。
式中：E 为加入样品的反应体系吸光度；F 为样品阴性对照组吸光度；D 为未加样品的反应体系吸光度。
1.3.5 蓝靛果花青素对羟自由基的清除作用
参考范艳丽等[17]的方法，以VC 为对照组，羟自由基清除率（N，%）计算公式如式（3）所示。
式中：J 为样品阴性对照组吸光度；K 为加入样品的反应体系吸光度；G 为未加样品的反应体系吸光度。
1.3.6 蓝靛果花青素总抗氧化能力的测定
根据试剂盒操作说明测定蓝靛果花青素与抗坏血酸的总抗氧化能力（T，U/mg）[18]，计算公式如式（4）所示。
式中：X 为对照组吸光度；Y 为样品组吸光度；V 为反应液体积，mL；S 为取样量，mg；W 为样品浓度，mg/mL。
1.3.7 蓝靛果花青素对H2O2 诱导Caco-2 损伤的保护机制
1.3.7.1 蓝靛果花青素对H2O2 诱导Caco-2 损伤保护作用
Caco-2 细胞分化复苏后[19]，取对数期细胞接于12 孔板，24 h 后，以H2O2（7.5 mmol/L）处理24 h，对照组不用H2O2 处理，阳性对照组加入特丁基对苯二酚（t-BHQ）（50 µmol/L），蓝靛果花青素组（LA）浓度分别为50 mg/mL（低剂量，LA-L）、100 mg/mL（中剂量，LA-M）和250 mg/mL（高剂量，LA-H），培养24 h，按试剂盒说明书测定细胞MDA 含量和CAT、SOD 活性。
1.3.7.2 蓝靛果花青素对Caco-2 损伤保护机制
细胞总RNA 的提取：细胞培养结束，除去培养液，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗1~2 次，利用Recombinant DNase I 试剂盒提取细胞总RNA[20]。
cDNA 制备：利用PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行反转录。
反转录定量聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-qPCR）：Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、CAT、GSH-Px 引物设计委托北京中科亚光生物科技有限公司，序列如表1 所示。按TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书，选用20µL 反应体系，RT-qPCR 条件为95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；扩增40 个循环，95 ℃，15 s。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称Keap1 Nrf2 HO-1 NQO1 SOD CAT GSH-Px GAPDH上游引物（5′-3′）CCTTCAGCTACACCCTG GAG AGACAAACATTCAAGCC GCT CAGTCTTCGCCCCTGTCT AC AGTGCAGTGGTGTGATC TCG GAAGGTGTGGGGAAGCA TTA ACATGGTCTGGGACTTC TGG AACCAGTTTGGGCATCA GG GACCCCTTCATTGACCTC AAC下游引物（3′-5′）AACATGGCCTTGAAGA CAGG CCATCTCTTGTTTGCTG CAG GCTGGTGTGTAGGGGA TGAC GGTGGAGTCACGCCTG TAAT ACCACAAGCCAAACGA CTTC CTTGGGTCGAAGGCTAT CTG GTTCACCTCGCACTTCT CG CATACCAGGAAATGAG CTTG
1.4 数据处理
数据分析软件采用SPSS 19.0，绘图软件采用Origin 8.5，回归分析运用Design Expert 8.06 软件。
2 结果与分析
2.1 蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除作用
蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除作用如图1所示。
图1 蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除作用
Fig.1 Scavenging effects of anthocyanins from Lonicera caerulea on DPPH free radicals
由图1 可知，随着蓝靛果花青素浓度的增大，DPPH自由基的清除率逐渐增加，最大为92.48%，此时蓝靛果花青素浓度为1.6 mg/mL。VC浓度为1.6 mg/mL 时，清除率达到最高，为94.17%。低浓度时VC 对DPPH 自由基的清除效果优于蓝靛果花青素；高浓度时，DPPH自由基的清除率差异不显著，蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除率优于紫薯花青素[21]。蓝靛果花青素与VC的回归方程分别为y=1.647 4x+5.964 6 与y=0.431 7x+6.418 8，IC50 值分别为0.26 mg/mL 和0.000 5 mg/mL。
2.2 蓝靛果花青素对ABTS+自由基的清除作用
蓝靛果花青素对ABTS+自由基的清除作用如图2所示。
图2 蓝靛果花青素对ABTS+自由基的清除作用
Fig.2 Scavenging effects of anthocyanins from Lonicera caerulea on ABTS+free radicals
由图2 可知，蓝靛果花青素浓度在0.04~0.40 mg/mL时，ABTS+自由基清除率增加迅速；浓度超过0.4 mg/mL时，趋于平缓，最大清除率为99.82%，VC 的最大清除率为99.79%，与蓝靛果花青素的清除率无显著差异。蓝靛果花青素对ABTS+自由基的清除率高于黑莓花青素[22]。蓝靛果花青素与抗坏血酸对ABTS+自由基的清除率回归方程分别为y=3.291 7x+8.459 4 与y=1.149 2x+8.343 6，IC50 值分别为0.089 mg/mL 和0.001 mg/mL。
2.3 蓝靛果花青素对羟自由基的清除作用
蓝靛果花青素对羟自由基的清除作用如图3所示。
图3 蓝靛果花青素对羟自由基的清除作用
Fig.3 Scavenging effects of anthocyanins from Lonicera caerulea on hydroxyl radicals
由图3 可知，随着蓝靛果花青素浓度的增大，羟自由基的清除率逐渐增大，蓝靛果花青素浓度为3.0 mg/mL 时最高，为95.67%，低于同浓度VC 的清除率。蓝靛果花青素对羟自由基的清除率弱于VC，但高于黑夏葡萄花青素[23]。蓝靛果花青素和VC 对羟自由基清除率的回归方程分别为y=0.911 7x+6.400 5 与y=2.107 6x+8.278 7，IC50 值 分 别 为0.105 mg/mL 和0.028 mg/mL。
2.4 蓝靛果花青素总抗氧化能力的测定
蓝靛果花青素的总抗氧化能力如图4 所示。
图4 蓝靛果花青素的总抗氧化能力
Fig.4 Total antioxidant capacity of anthocyanins from Lonicera caerulea
由图4 可知，蓝靛果花青素浓度为1.2 mg/mL 时，总抗氧化能力达到186.62 U/mg，相同浓度VC 的总抗氧化能力为188.85 U/mg。蓝靛果花青素与VC 的总抗氧化能力相当。
2.5 蓝靛果花青素对H2O2 诱导Caco-2 损伤细胞保护作用
2.5.1 蓝靛果花青素对MDA 含量的影响
MDA 累积是氧化损伤的重要评判指标之一[24]。蓝靛果花青素对MDA 含量的影响如图5 所示。
图5 蓝靛果花青素对MDA 含量的影响
Fig.5 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on MDA in Caco-2 cells
由图5 可知，模型组较对照组的MDA 含量极显著增高（p<0.01），表明成功建立了H2O2 诱导的Caco-2细胞损伤模型。蓝靛果花青素各剂量组的MDA 含量较模型组极显著减小（p<0.01），高剂量组和阳性对照组（t-BHQ）表现出相同的降低细胞MDA 含量的特性，减少细胞氧化应激过程的损伤。
2.5.2 蓝靛果花青素对CAT 活性的影响
蓝靛果花青素对CAT 活性的影响如图6 所示。
图6 蓝靛果花青素对CAT 活性的影响
Fig.6 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on CAT in Caco-2 cells
由图6 可知，模型组的CAT 活性与对照组相比无显著差异（p>0.05），蓝靛果花青素各剂量组的CAT 活性较模型组极显著增大（p<0.01）。高剂量组和阳性对照组（t-BHQ）表现出相同的增加细胞CAT 活性的能力，可提高损伤细胞的防御能力。
2.5.3 蓝靛果花青素对SOD 活性的影响
SOD 具有较好的防御氧化损伤作用[25]。蓝靛果花青素对SOD 活性的影响如图7 所示。
图7 蓝靛果花青素对SOD 活性的影响
Fig.7 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on SOD in Caco-2 cells
由图7 可知，模型组的SOD 活性较对照组相比极显著增大（p<0.01），表明损伤细胞启动自我防御系统，分泌更多抗氧化酶；与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组的SOD 活性极显著增大（p<0.01），高剂量组和阳性对照组表现出相同的提高细胞SOD 活性特征，激活抗氧化酶抵抗细胞氧化损伤。
2.5.4 蓝靛果花青素对GSH-Px 活性的影响
蓝靛果花青素对GSH-Px 活性的影响如图8 所示。
图8 蓝靛果花青素对GSH-Px 活性的影响
Fig.8 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on GSH-Px in Caco-2 cells
由图8 可知，模型组的GSH-Px 活性较对照组极显著增大（p<0.01），表明氧化损伤细胞大量分泌抗氧化酶，抵御细胞损伤；与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组的GSH-Px 活性极显著增大（p<0.01），高剂量组和阳性对照组（t-BHQ）表现出相同的提高GSH-Px 活性的能力，可抵御细胞氧化带来的破坏。
蓝靛果花青素表现出与金丝桃苷、芦丁和原儿茶素相同的抗氧化特征[26-28]，通过激活细胞CAT、SOD 和GSH-Px 的活性，增强自身防御功能，减少细胞氧化中MDA 的积聚，发挥抗氧化作用。
2.6 蓝靛果花青素对Caco-2 损伤细胞保护机制
2.6.1 蓝靛果花青素对Nrf2 和Keap1 mRNA 表达量的影响
蓝靛果花青素对Nrf2 和Keap1 mRNA 表达量的影响如图9 所示。
图9 蓝靛果花青素对Caco-2 Nrf2 和Keap1 mRNA 表达量的影响
Fig.9 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on Nrf2 and Keap1 mRNA levels in Caco-2 cells
由图9 可知，模型组Nrf2 的表达量较对照组极显著下降（p<0.01），表明细胞发生氧化损伤；与模型组相比，蓝靛果各剂量组可极显著减低Keap1 的mRNA 表达量，增加Nrf2 的mRNA 表达量，通过抑制Keap1 的mRNA 表达量，维持细胞氧化还原平衡，调控损伤细胞修复，抵御细胞氧化损伤。
2.6.2 蓝靛果花青素对HO-1 和NQO1 mRNA 表达量的影响
蓝靛果花青素对HO-1 和NQO1 mRNA 表达量的影响如图10 所示。
图10 蓝靛果花青素对Caco-2 HO-1 和NQO1 mRNA 表达量的影响
Fig.10 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on HO-1 and NQO1 mRNA levels in Caco-2 cells
由图10 可知，模型组HO-1 和NQO1 的mRNA 表达量较对照组极显著升高（p<0.01），表明细胞启动自修复系统；蓝靛果各剂量组的HO-1 和NQO1 mRNA的mRNA 表达量较模型组极显著增大（p<0.01），说明蓝靛果花青素可减少细胞过氧化物沉积，清除自由基，保护细胞氧化损伤。
2.6.3 蓝靛果花青素对SOD、GSH-Px 和CAT mRNA表达量的影响
蓝靛果花青素对SOD、GSH-Px 和CAT mRNA 表达量的影响如图11 所示。
图11 蓝靛果花青素对Caco-2 SOD、CAT 和GSH-Px mRNA 表达量的影响
Fig.11 Effect of anthocyanins from Lonicera caerulea on SOD，CAT，and GSH-Px mRNA levels in Caco-2 cells
由图11 可知，模型组SOD、GSH-Px 和CAT mRNA 表达量较对照组极显著升高（p<0.01），说明氧化损伤激活细胞体内的过氧化物酶的活性；与模型组比较，蓝靛果各剂量组可极显著提高SOD、GSH-Px 和CAT 的mRNA 表达量，表现出与阳性对照组（t-BHQ）相同的调控特性，说明蓝靛果花青素可提高细胞抗氧化酶的表达，发挥抗氧化功能。
综上，Nrf2 在Nrf2-Keap1-ARE 通路中是重要的中心调控因子，可调控下游细胞抗氧化因子的表达[29]，启动机体自防御系统，清除过氧化物沉积，保护氧化损伤，蓝靛果花青素可提高HO-1 和NQO1 mRNA 表达量，提高SOD、GSH-Px 和CAT 的活性，下调Keap1 因子mRNA 表达量，上调Nrf2 因子mRNA 表达量，具有与丹酚酸、黄芪多糖相同的调控细胞氧化应激损伤的功能[30-31]。
3 结论
为评价蓝靛果花青素的体外抗氧化活性，从Nrf2-Keap1-ARE 通路关键因子的调控角度探讨蓝靛果花青素的抗氧化机制。试验结果表明，蓝靛果花青素对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基的清除率分别为92.48%、99.82% 和95.67%，总抗氧化能力最高为186.62 U/mg。蓝靛果花青素可提高H2O2 诱导Caco-2细胞损伤的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低MDA 水平，上调Nrf2-Keap1-ARE 通路中的关键因子Nrf2 的mRNA 表达量，下调Keap1 mRNA 表达量，上调HO-1和NQO1 mRNA 表达量，激活细胞抗氧化酶活性，发挥氧化损伤的保护作用，提高机体的抗氧化活性。蓝靛果花青素表现出与VC 和t-BHQ 相同的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂广泛应用于功能食品行业中。
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