葛根(Pueraria lobata,PL)为豆科植物野葛(Pueraria lobata Willd. Ohwi)的根部,含有异黄酮、葛根素、生物碱等生物活性成分[1],具有抗氧化、抗炎、扩血管[2]、降血压、降血糖等作用。葛根是国家卫生部首部批准的药食同源植物,目前已被列入《按照传统既是食品又是中药材的物品名录》中。葛根经过挑选、去皮、切片、粉碎等工艺后可进一步加工为葛根粉,近年来被广泛应用于功能性保健品的制备[3-4]。然而葛根粉存在着一些固有缺陷,例如溶解度较低、透明度较小、热水冲泡易团聚结块及稳定性较差等[5-6],影响了其在食品和药品领域的应用。因此,开发新的方法来对葛根粉进行处理改善其应用是非常有必要的。
淀粉是葛根粉的主要成分,新鲜葛根粉中的淀粉含量约为35%~60%[7]。淀粉经改性后其溶解度、稳定性、膨胀势等天然特性会发生改变,能够进一步扩大其应用范围[8-9]。例如通过物理加热、化学交联和酶解[10-12]等方法处理制备的改性淀粉可用作乳液的稳定剂以及新型药物载体等[13-14]。其中普鲁兰酶是一类常用的淀粉类脱支酶,它能够定向水解淀粉分支和链结构中的α-1,6 糖苷键,增加淀粉中的直链淀粉含量[15]。微波热处理则是一种通过微波辐照穿透淀粉基质引起分子间振动从而引发物质发生物理化学变化的改性方法。它能够通过摩擦产生热量使得处理的时间大幅缩短[16-17]。研究证明,采用微波处理淀粉能够使其产生更多的网状结构,从而有利于淀粉类脱支酶的进一步作用[18-19]。近年来通过微波处理以及单一酶法对淀粉进行改性的研究已有相关报道,但通过二者协同处理改性的研究却鲜有报道。
因此,本研究参考葛根淀粉的改性方式,选择微波协同普鲁兰酶酶解法对葛根粉进行处理,并研究其结构和性质上的变化,探究这一方法的可行性,以期为改性葛根粉在功能食品的生产和开发以及应用等方面提供参考。
葛根:安徽康美药业股份有限公司,经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定为豆科植物野葛的干燥根;普鲁兰酶(100 U/g):上海麦克林生化科技股份有限公司;抗性淀粉含量检测试剂盒(JL-T0956):上海江莱生物科技有限公司;盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、碳酸氢二钠、无水乙醇(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。
电子恒温不锈钢水浴锅(HHS-6S):上海虞龙仪器设备有限公司;真空干燥箱(D2F-6050):上海博迅实业有限公司;电子分析天平(FA-1604):上海舜宇恒平科学仪器有限公司;冷冻干燥机(FD-1A-50):上海比朗仪器制造有限公司;激光粒度分析仪(Mastersizer3000)、微电脑微波化学反应器(WBFY-201):上海牧佐实业有限公司;全自动酶标分析仪(Spectra Max190):美国MD公司;偏光显微镜(XP-330C):上海蔡康光学仪器有限公司;荧光显微镜(DM2000):德国Leica 公司;扫描电子显微镜(SU-8100):日本Hitachi 公司;流变仪(DHR):上海锐翱贸易有限公司;紫外可见分光光度计(UV-900):青岛海特尔环保科技有限公司;离心机(DL-5B):上海安亭科学仪器厂。
1.3.1 葛根淀粉样品的制备和微波法处理参数筛选
葛根经过粉碎、过20 目筛后得到葛根粉,采用强碱法对葛根粉末中的淀粉成分进行提取制备葛根淀粉[20],通过测定微波-酶法改性葛根淀粉样品中的抗性淀粉(resistant starch,RS)含量对微波参数进行初步筛选。首先称取葛根淀粉样品,重复过100 目筛2 次使颗粒均匀。将其分散在pH5.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制备成浓度为5%、10%、15%、20%、25% 的淀粉乳,搅拌均匀后用保鲜膜封口避免水分损失,再置于微波功率为210 W 的微波炉中进行微波辐照处理,微波糊化时间分别为30、60、90、120、150 s。微波处理结束后将淀粉乳搅拌均匀并倒入烧杯中,参考文献[21]的方法以100 U/g 葛根淀粉的普鲁兰酶用量对其进行8 h 的振摇温育,反应结束后用4% 的NaOH 溶液将pH 值调至中性停止反应。搅拌冷却至室温后,用超纯水洗涤混合溶液至中性,室温5 000 r/min 离心10 min,将沉淀物冷冻干燥即得经过微波协同酶解处理的葛根淀粉样品。
1.3.2 抗性淀粉含量测定
参照抗性淀粉含量检测试剂盒说明书,通过检测葡萄糖含量来测定RS 含量。具体步骤如下:首先精密称取10 mg 改性葛根粉末样品,加入α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合液,水平放置于振荡培养箱中振荡16 h。孵育结束后,取出加入等体积的无水乙醇终止反应。向沉淀中加入50% 乙醇溶液涡旋混匀。底部残留絮状物即为改性葛根粉末样品中的抗性淀粉。在冰浴条件下缓慢加入0.2 mL 的KOH 溶液,振荡直至沉淀完全溶解。取出后用醋酸盐缓冲液将溶液调至中性,混匀后50 ℃孵育30 min,测定510 nm 处的吸光值。每组样品均平行3 组进行检测。抗性淀粉含量(Y,mg/g)的计算公式如下。
式中:A0、A1、A2 分别为空白样品、标准品和样品的吸光值;W 为样本质量,g;D 为稀释倍数,未稀释即为1;0.9 为淀粉与葡萄糖之间的转换系数。
1.3.3 微波-酶法制备改性葛根粉
根据1.3.1 所测定的RS 含量选择浓度为10%、15%的葛根粉样品乳,放置于微波炉中进行微波功率为210 W,处理时间分别为60、120 s 的微波辐照处理。微波处理结束后将样品乳搅拌均匀并倒入烧杯中,以100 U/g 葛根淀粉的普鲁兰酶用量进行8 h 的振摇温育。反应结束后用4% 的NaOH 溶液将pH 值调至中性停止反应。搅拌冷却至室温后,以5 000 r/min 离心10 min 取沉淀物冷冻干燥即得经过复合改性的葛根粉样品(compound modified Pueraria lobata,CM-PL),样品分别记为CM-PL10-1、CM-PL10-2、CM-PL15-1、CM-PL15-2。
1.3.4 改性葛根粉的结构及性质研究
1.3.4.1 改性葛根粉的颗粒形貌分析
光学显微镜分析:取适量经过改性的葛根粉末样品加水配制成混悬液滴于载玻片上,放置在荧光显微镜下观察,以未经过任何处理的葛根粉作为对照。
偏光显微镜分析:取适量样品加水配制成混悬液滴在载玻片上,盖上盖玻片,在偏光显微镜下对样品的偏光十字进行观察,并拍摄照片。
扫描电子显微镜分析:取适量样品附着于载物台上并置于离子溅射仪上喷金后,通过扫描电子显微镜观察颗粒的微观结构。
1.3.4.2 改性葛根粉的粒度分布测定
称取适量葛根粉与改性葛根粉末样品,少量多次加入超纯水配制成质量分数为1% 的混悬液,涡旋3 min 后取上清液。通过激光粒度分析仪测定其粒径分布情况,记录样品的D10、D50、D90 特征值(D10、D50、D90分别代表该样品累积粒度分布百分数达到10%、50%、90%时对应的粒径值)。
1.3.4.3 改性葛根粉的吸水率测定
称取1 g 葛根粉与改性葛根粉末样品,加入20 mL的超纯水中,搅拌并涡旋15 min;之后5 000 r/min 离心10 min,记录湿颗粒样品质量。每组样品均平行3 组进行测定并按照下列公式计算吸水率(Y,%)[22]。
式中:M0 为样品总质量,g;M1 为湿颗粒样品质量,g。
1.3.4.4 改性葛根粉的透光率测定
称取葛根粉与改性葛根粉末样品,配成质量分数为1%的样品溶液,室温下静置20 min,再将样品溶液移入25 mL 具塞量筒,摇匀静置。吸取样品溶液的上清液用紫外可见分光光度计测定样品在620 nm 波长下上清液的透光率。
1.3.4.5 改性葛根粉的溶解度及膨胀势测定
参考文献[23]的方法测定葛根粉与改性葛根粉末样品的溶解度和膨胀势,并稍作修改。首先称取适量葛根粉与改性葛根粉末样品,配制成质量分数为1%的改性葛根粉样品浆。在不同温度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)下加热30 min,将样品浆冷却后4 000 r/min离心20 min,上清液倒入培养皿中在65 ℃烘箱中干燥24 h。每组样品均平行3 组进行测定。按照下列公式计算溶解度(Y,%)和膨胀势(Z,%)。
式中:Wi 为样品初始质量,g;Wss 为湿颗粒样品质量,g;Wws 为干燥颗粒样品质量,g。
1.3.4.6 改性葛根粉的流变学行为测定与分析
静态流变学分析:称取葛根粉与改性葛根粉末样品,充分涡旋配成质量分数为5% 的样品溶液。将样品放入流变仪上进行测定,测定瓶口加上盖板,并在空隙处涂抹适量硅油防止水分蒸发。探头直径设定为40 mm,测定平台与夹具间隙为1 mm,测定样品的流变学特性。在25 ℃条件下,研究待测样品的表观黏度及剪切应力随着剪切速率递增过程中的变化[24]。
动态流变学分析:在温度为25 ℃、应变为1% 下进行0.1~100 rad/s 的角频率扫描,记录分析弹性模量(G′)和黏性模量(G″)的变化情况[25]。
通过SPSS 26.0 软件对数据进行单因素方差分析,每组试验均重复3 次,结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2018 进行绘图。
微波协同普鲁兰酶酶解处理葛根淀粉的RS 含量测定结果如图1 所示。
图1 微波-酶法处理葛根淀粉的抗性淀粉含量
Fig.1 Resistant starch content of pueraria starch treated by microwave-enzyme method
图1 结果表明当淀粉乳浓度为15%时RS 含量达到最高;当微波糊化时间为60 s 时样品中的RS 含量最高,120 s 时含量最低。这可能是由于微波处理方法用在淀粉改性时,会使淀粉受到辐射后发生分子间氢键的断裂[26]。同时在冷却阶段相邻的直链淀粉间又再次形成氢键发生老化现象,有利于酶的进一步作用。且普鲁兰酶一方面可通过切下绝大部分支链淀粉分支使得直链淀粉含量增加[27],另一方面在脱支后使得短直链分子深入支链结构与直链分支重排生成更加致密的结晶,从而使得抗性淀粉的含量增加。因此为了进一步研究微波处理参数对葛根粉末的影响,选择淀粉乳浓度为10%、15%以及微波糊化时间为60、120 s 的处理参数与普鲁兰酶酶解法组合进行后续改性葛根粉样品的制备,研究这两种方法的协同作用对葛根粉结构及性质的影响。
葛根与改性葛根粉的显微镜图像以及微观结构形态如图2 所示。
图2 葛根粉与改性葛根粉的显微形态图
Fig.2 Micrographs of P.lobata powder and modified P.lobata powder
由图2 可知,PL 呈现出大小不一的不规则半球形形状,且表面较为光滑没有明显的裂纹或沟壑现象。与PL 相比,在经过改性处理后,葛根粉的颗粒表面变得粗糙,部分颗粒表面出现凹陷、裂纹和孔洞现象,内部结构发生不同程度的团聚或改变。由图2B 可知,PL 颗粒偏光十字清晰可见,改性葛根粉的偏光十字较弱但仍有偏光性存在,而经过微波处理较长时间的组别偏光十字几乎消失。说明了微波及酶解处理导致反应体系中的水分子振动使得颗粒发生膨胀从而导致颗粒间发生团聚直至形态结构发生改变。
PL 与改性葛根粉的粒径分布结果如表1 所示。
表1 改性葛根粉的粒径分布
Table 1 Particle size distribution of modified P.lobata powder
注:同列不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
样品PL CM-PL10-1 CM-PL10-2 CM-PL15-1 CM-PL15-2 D10/µm 4.78±0.32d 8.78±0.13c 9.66±0.57b 8.57±0.12c 12.31±0.51a D50/µm 12.15±1.99d 67.06±1.19c 80.95±7.57b 72.89±1.65bc 110.63±5.79a D90/µm 91.19±19.69d 181.97±1.16c 217.77±12.41b 193.11±6.49c 241.87±12.57a
由表1 可知,与PL 相比,CM-PL 样品颗粒粒径变化明显,D10、D50、D90 均有不同程度的增加,且经过微波处理时间的延长样品的粒径明显增大。扫描电子显微镜结果也呈现了类似的情况,可能是由于葛根粉在经过微波及酶解处理后颗粒间发生团聚,部分淀粉颗粒热处理后吸水发生溶胀从而导致颗粒粒径增大。
PL 与改性葛根粉的吸水率变化如图3 所示。
图3 改性葛根粉吸水率变化
Fig.3 Changes in the water absorption rate of modified P.lobata powder
由图3 可知,改性葛根粉样品的吸水率要明显高于PL 样品,且CM-PL10-1 与CM-PL10-2 样品的吸水率要高于CM-PL15-1 与CM-PL10-2 样品。这可能是因在微波协同酶解处理葛根粉后颗粒表面结构被破坏,且扫描电子显微镜图像中也可看出颗粒表面出现的凹陷、裂纹和孔洞可能会使得其吸水率升高。同时体系中的水分子在微波热处理时会发生剧烈振动从而使其与水分子结合的能力增加,使得样品的吸水率升高。
PL 与改性葛根粉的透光率变化如图4 所示。
图4 改性葛根粉透光率变化
Fig.4 Changes in the light transmittance of modified P.lobata powder
由图4 可知初始时PL 样品上清液透光率明显低于改性葛根粉样品;同时所有样品上清的透光率均随时间的延长有不同程度的增加,其中CM-PL10-1 以及CM-PL10-2 样品的透光率增加速率较快,且所有试验组4 h 后透光率逐渐趋向平缓。可能是由于微波热处理以及普鲁兰酶酶解过程中产生的热量使得葛根粉末样品中的颗粒膨胀和分子链断裂从而产生较多的短直链分子,而在颗粒冷冻干燥过程后表面形成较多的孔洞结构又有助于分子链片段的重组所致[28]。
PL 与改性葛根粉的溶解度变化如图5 所示。
图5 改性葛根粉的溶解度变化曲线
Fig.5 Solubility curves of modified P.lobata powder
从图5 中可以明显发现,PL 的溶解度在温度达到90 ℃时达到最大,其中CM-PL15-2 样品的溶解度明显大于其他样品组,并且CM-PL 各组整体溶解度高于PL组。溶解度的升高可能是来自样品中淀粉颗粒的溶解,这是由于微波协同酶解处理可能会导致直链淀粉成分发生迁移从而增加直链淀粉的溶出使得溶解度增加[29]。
PL 与改性葛根粉的膨胀势变化如图6 所示。
图6 改性葛根粉的膨胀势变化曲线
Fig.6 Swelling potential curves of modified P.lobata powder
从图6 中可以看出,PL 与改性葛根粉末样品的膨胀势与溶解度的变化趋势相似,且在温度达到80~90 ℃时其膨胀势明显。CM-PL 各组样品间的膨胀程度较为相似,且均高于PL 样品。结果表明,微波协同酶解处理改变了葛根颗粒的结构,导致其淀粉分子链发生断裂形成较小的片段从而使得膨胀势升高。
PL 与改性葛根粉的静态流变曲线图如图7 所示。
图7 改性葛根粉的静态流变曲线
Fig.7 Static rheological curves of modified P.lobata powder
从图7 中可以看出,PL 及改性葛根粉样品的表观黏度均随着剪切速率的增加而减小,呈现出剪切稀化现象,表明样品溶液均为假塑性流体,说明微波协同酶解改性处理并没有改变葛根粉的流体类型。同样从图7中可以发现各样品剪切应力的变化情况与剪切速率之间并未呈现出一种线性关系,也间接证实了该样品溶液为非牛顿流体。
PL 与改性葛根粉的动态流变曲线如图8 所示。
图8 改性葛根粉的动态流变曲线
Fig.8 Dynamic rheological curves of modified P.lobata powder
由图8 可知,PL 及与改性葛根粉末样品弹性模量和黏性模量均随着角频率的增大而增高,且在相同的角频率情况下样品的弹性模量均大于黏性模量。说明了样品具有弹性性质和黏性性质,且以弹性为主[30]。
本研究通过微波协同普鲁兰酶酶法对葛根粉进行处理,发现经过改性后的葛根粉从微观形态上看各颗粒间发生大小程度不一的崩解,部分颗粒表面出现团聚和孔洞现象及偏光十字的消失;且改性葛根粉的粒径、吸水率、透光率与原葛根粉相比均有显著增加;其溶解度与膨胀势在温度达到90 ℃时上升速率达到最高;流变学研究也表明改性后的葛根粉黏度及弹性发生了改变。上述试验均表明微波-酶法处理方式使葛根粉存在的一些固有缺陷得到了一定程度的改善,无论从溶解度增加还是黏弹性的增强,对于葛根粉作为保健饮品以及作为主料辅助其他有效成分开发葛根复合型功能饮品都有着一定的参考价值。
葛根作为一味产地资源丰富且营养价值高的药食同源中药材具有很大的发展潜力,因此开发和研究新的处理方式能够进一步充分利用葛根药材资源,同时也为葛根在发酵制品以及保健产品类的生产与开发提供新的借鉴思路,对于改性葛根粉的应用与开发具有重要意义。
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