我国是海藻养殖生产大国，养殖地主要分布在福建、山东等沿海地区[1]。根据《2022 年全国渔业经济统计公报》中国渔业年鉴统计，2022 年我国的海藻养殖产量高达272.39 万t，藻类总产量增幅较大[2]。海藻中含有丰富的营养成分及活性成分[3-4]，然而，其常含有一定量的重金属，可能存在食品安全隐患[5-6]。
海带（Laminaria japonica Aresch）又名纶布、昆布、江白菜，是我国重要的经济类海藻，其富含膳食纤维、矿物质、蛋白质、脂肪酸等各种营养成分和生理活性成分[7]，是一种具有食用、药用、工业、农业等价值的大型藻类[8]。其养殖面积占全国藻类养殖面积的30%~40%[9]。近年来，海带中重金属残留问题引起了研究者关注[10]。
目前，去除重金属和砷的方法主要有氧化还原法、沉淀絮凝法、吸附法、膜分离法、溶剂萃取法、离子交换法等物理化学法和生物技术法。如樊琳等[11]利用柠檬酸脱除海带中的镉、铬、铅；杨茜等[12]采用天然低共熔溶剂去除坛紫菜中铅、镉、铬和铜；Wang 等[13]采用高压辅助法脱除海带中的镉和铅。其中物理化学法适用于处理重金属浓度偏低的物质，但由于某些吸附剂价格偏高，制约了物理化学法的使用[14]。而微生物吸附法对比其他方法具有吸附效率较高、对环境影响较小和运行成本较低等特点，是研究脱除重金属的新技术领域[15]。
相关研究表明，脱除重金属的微生物种类主要包括细菌和真菌[16]。如Naseem 等[17]研究发现黑曲霉能有效吸附银离子；李明春等[18]研究发现假丝酵母菌能对铜、镉、镍进行有效吸附；徐鹏飞[19]利用酿酒酵母吸附水溶液中的铜离子，铜离子含量明显下降；Chvrmurthy 等[20]将酿酒酵母固定在4% 海藻酸钠珠中作为去除镉的吸收剂，发现镉的吸附量随金属浓度的增加而增加，随pH 值的降低而减少。目前研究者对重金属的脱除研究主要集中在水体，对海藻中重金属的脱除研究还比较少，尚未系统研究微生物对海藻中重金属的脱除规律[21]。基于此，本研究以海带为试验原料，对比研究食品发酵常用的菌种，包括酿酒酵母、植物乳杆菌和两种菌混合发酵对海带中重金属脱除效果的影响，以期为降低海带食品重金属残留的研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄官一号海带（未经处理的晒干海带）：福建省天源水产集团有限公司；酿酒酵母（酿酒低糖型）、植物乳杆菌（食品级乳酸菌粉）：河南洲洋生物科技有限公司；白砂糖（优级）：厦门古龙食品有限公司。
1.2 仪器和设备
HH-4 型恒温水浴锅、ZXRD-B511O 型恒温鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-150 型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GL 1241-1SCN型电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FW 100 型高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；ICAP-RQ 型电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）仪：天津瑞利光电科技有限公司；Multiwave PRO 型微波消解仪：安东帕（上海）商贸有限公司；DB-3 型不锈钢电热板：常州国华电器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 海带预处理
干海带加水至没过海带浸泡2 h 后，清洗泥沙和其他杂质，沥水后切成约15 cm×3 cm 片状，置于室外晾干备用。
1.3.2 酵母菌发酵
参考邵悦春等[22]方法，将2 g 菌种加入到50 mL 2%灭菌糖水中，在28 ℃下活化培养1 h。将300 g 干海带和3%灭菌糖水，以料液比为1∶15（g/mL）放入发酵容器，加入1 mL 活化后的酵母菌液，混合均匀，密封后于30 ℃发酵8 d 然后取样，在60 ℃下烘干12 h 后粉碎过100 目筛，装袋备用。
1.3.3 植物乳杆菌发酵
参考邵悦春等[22]方法，将300 g 干海带和3%灭菌糖水以料液比为1∶15（g/mL）放入发酵容器，加入1 g植物乳杆菌粉，混合均匀，密封后于30 ℃发酵8 d 然后取样，在60 ℃下烘干12 h 后粉碎过100 目筛，装袋备用。
1.3.4 酵母菌与植物乳杆菌混合发酵
参考邵悦春等[22]方法，将300 g 干海带和3%灭菌糖水以料液比为1∶15（g/mL）放入发酵容器，加入1 mL活化酵母菌液和1 g 乳酸菌粉，混合均匀，密封后于30 ℃发酵8 d 然后取样，在60 ℃下烘干12 h，粉碎过100 目筛，装袋备用。
1.3.5 重金属元素测定
参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[23]的方法进行测定。准确称取0.5 g 海带粉加入5 mL 硝酸，混匀后于微波消解内罐中进行消解，设置电感耦合等离子体质谱仪的工作参数为发生器功率1 600 W、雾化器气流量0.98 L/min、辅助气流量1.20 L/min、等离子体气流量18.0 L/min。然后将混合标准溶液注入ICP-MS 仪中进行测定，待测定完成后，在仪器中输入标准系列的具体浓度值，通过内标液校正补偿，以待测元素的浓度为横坐标，待测元素与所选内标元素响应信号值的比例为纵坐标，绘制标准曲线。将空白溶液和试样溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素的信号响应值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度。
试样中待测元素含量计算公式如下。
式中：x 为试样中待测元素含量，mg/kg；P 为试样溶液中被测元素质量浓度，µg/L；P0 为试样空白液中被测元素质量浓度，µg/L；v 为样消化液定容体积，mL；f为试样稀释倍数；m 为试样称取质量，g；1 000 为换算系数。
1.4 数据处理
每个试验重复3 次，用IBM SPSS Statistics 26.0 和Origin 9.1 软件对试验数据进行整理和图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同发酵方式对海带中铅含量的影响
酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铅含量的影响见图1。
图1 酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铅含量的影响
Fig.1 Effects of S.cerevisiae and L.plantarumon fermentation on lead content in kelp
由图1 可知，未发酵的海带与酵母菌发酵、植物乳杆菌发酵及二者混合发酵海带的铅含量相比具有显著差异。未发酵的海带中铅含量为1.85 mg/kg，酵母菌发酵的海带铅含量为0.79 mg/kg（脱除率为57%），酵母菌和植物乳杆菌混合发酵的海带铅含量为1.23 mg/kg（脱除率为34%）。Lin 等[21]从雅安泡菜水中筛选出7 株具有较强吸附Pb2+作用的乳酸菌，在单一重金属离子体系下，乳酸菌对Pb2+的吸附率最高达82.25%。樊琳等[11]采用柠檬酸脱除海带中重金属，铅脱除率最高达70.97%。Wang 等[13]研究发现，在乙酸浓度为60%、压力188 MPa 的条件下对海带进行处理，铅的脱除率为67.09%。本研究发现酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带中的铅离子具有显著的脱除效果，这与同类研究中微生物可吸附水中的铅离子结果相似。同时，本研究发现酵母菌发酵比植物乳杆菌发酵更有利于脱除海带中的铅离子，说明酵母菌和植物乳杆菌对海带中铅离子的作用影响存在差异。
2.2 不同发酵方式对海带中镉含量的影响
酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带镉含量的影响见图2。
图2 酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带镉含量的影响
Fig.2 Effects of S.cerevisiae and L.plantarumon fermentation on cadmium content in kelp
由图2 可知，酵母菌发酵及其与植物乳杆菌混合发酵对海带中镉离子具有显著的脱除作用，而仅仅用植物乳杆菌发酵未显现显著的脱除效果，说明酵母菌和植物乳杆菌对海带中镉离子的作用存在差异。未发酵的海带中镉含量为0.80 mg/kg，酵母菌和植物乳杆菌混合发酵的海带镉含量为0.54 mg/kg（脱除率为33%）；酵母菌发酵的海带镉含量为0.57 mg/kg（脱除率为29%）。樊琳等[11]采用柠檬酸脱除海带中重金属，镉脱除率达到61.14%。Wang 等[13]研究发现在乙酸浓度为60 %、压力188 MPa 下处理海带，镉脱除率为60.47%。陈露等[24]以1.5% 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）作为脱除剂，在料液比1∶30（g/mL）、时间4 h、温度30 ℃的工艺条件下，对镉的脱除率为87.4%。
2.3 不同发酵方式对海带中铜含量的影响
酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铜含量的影响见图3。
图3 酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铜含量的影响
Fig.3 Effects of S.cerevisiae and L.plantarum on fermentation on copper content in kelp
由图3 可知，未发酵的海带中铜含量为3.34 mg/kg，酵母菌发酵的海带中铜含量为1.86 mg/kg（脱除率为44%）；植物乳杆菌发酵的海带铜含量为2.30 mg/kg（脱除率为31%）。杨茜等[12]采用天然深层共晶溶剂脱除紫菜中的重金属，铜的脱除率为24.11%~68.79%；徐鹏飞[19]利用酿酒酵母吸附水溶液中的铜离子，铜离子的最高脱除率达到92.80%。本研究发现酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带中铜具有显著的脱除效果，这与同类研究中微生物可吸附水中重金属的结论具有一定的相似性。同时，本研究发现酵母菌发酵比植物乳杆菌发酵更有利于去除海带中的铜离子，可能由于这两种微生物对铜离子的吸附脱除作用存在差异。
2.4 不同发酵方式对海带中铁含量的影响
酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铁含量的影响见图4。
图4 酵母菌和植物乳杆菌发酵对海带铁含量的影响
Fig.4 Effects of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum on the ferrum content in kelp
由图4 可知，未发酵的海带中铁含量为0.47 mg/kg，酵母菌发酵的海带铁含量为0.26 mg/kg（脱除率为45%）；酵母菌与植物乳杆菌混合菌发酵的海带铁含量为0.30 mg/kg（脱除率为36%）；单独使用植物乳杆菌发酵的海带铁含量为0.32 mg/kg（脱除率为32%）。目前关于微生物发酵对海藻中铁离子含量的影响尚未见研究报道。本研究发现，酵母菌发酵、植物乳杆菌发酵及二者混合发酵对海带铁含量均具有显著的脱除作用，进一步说明了微生物发酵对海藻营养成分的影响。
2.5 微生物吸附重金属作用机制
微生物吸附重金属的作用机制包括细胞外部沉淀、细胞表面吸附和细胞内部解毒3 种，主要吸附机制见图5。
图5 微生物对重金属的主要吸附机制
Fig.5 The main adsorption mechanism of heavy metals by microorganisms
细胞外部沉淀是指微生物通过分泌某些物质到环境中，通过改变环境或与金属离子络合使重金属离子发生沉淀。细胞表面吸附是指重金属离子被微生物细胞壁上的某些官能团所吸附从而被固定在细胞表面，包括离子交换、表面络合、氧化还原、无机微沉淀等。细胞内部解毒机制是指微生物将金属离子转运到细胞内，通过甲基化作用使高毒性的重金属转化为低毒性。
相关研究表明，不同微生物具有不同的重金属吸附机制。如刘磊等[14]研究发现，乳酸菌的细胞壁会对水溶液中的Cu2+、Fe3+进行络合；Scott 等[25]用节杆菌和假单胞菌脱除Cd2+时发现，Cd2+会沉淀在微生物表面；魏小凡等[26]研究表明细菌细胞表面的羟基、羧基、酰胺基和苯酚类等官能团都能与As 离子发生化合反应，从而达到吸附As 离子的目的；张丰生[27]发现，酵母菌吸附铅的主要部位在细胞壁上蛋白质酰胺Ⅰ带与酰胺II 带的—C—N—、—NH 和—OH、磷酸类基团（
—HPO42-）、—COOH 等，同时还发现Mg 元素在和酵母菌吸附Pb2+的过程中起离子交换的作用。Brady等[28]研究发现，酵母菌会对Cu+进行吸附，且在吸附过程中会使细胞中的K+和Mg2+释放出来，说明此过程发生了离子交换作用；Chen 等[29]利用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）研究发现Cu2+通过离子交换或静电相互作用与酵母菌表面的官能团结合后，会被转运到细胞膜内，最后与细胞质结合。李丽杰[30]研究发现，酵母菌可通过细胞外部沉淀、细胞表面吸附以及细胞内部积累等多种机制共同作用对铅离子进行吸附。
3 结论
本研究系统对比了酿酒酵母和植物乳杆菌对重金属的脱除规律，发现酿酒酵母、植物乳杆菌及二者混合发酵能使海带中的重金属产生不同程度的降低，同时，不仅发酵菌种的不同可以产生不同的重金属脱除效果，且同一种发酵方式对不同种类的重金属的脱除效果也有所差异。根据显著性差异比较，酵母菌发酵对海藻中铅、镉、铜和铁都具有良好的脱除效果，而植物乳杆菌或两种菌的混合发酵对铅、铜和铁的综合脱除效果没有单独用酵母菌发酵好。酵母菌发酵对铅、镉、铜和铁的脱除率大小依次为铅>铁>铜>镉；植物乳杆菌对重金属的去除效果依次为铁>铜>铅>镉；混合发酵对重金属的去除效果依次为铁>铅>镉>铜。研究结果不仅证明了不同微生物对重金属的脱除效率差异，其主要原因是不同微生物具有不同的脱除重金属机制；同时研究还发现同种微生物对不同元素的吸附脱除作用也不同，其可能原因是金属离子价态不同。本研究为降低海带食品重金属残留的研究提供了技术参考和理论依据，对海藻开发利用及海洋经济发展具有重要意义。
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