亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase，NiR）广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO 或NH3[1]。在食品工业生产的过程中，亚硝酸盐被添加到肉制品中，有助于肉品发色，但由于其存在潜在的致畸致癌性[2-4]，引起了广大消费者的担忧。为了增加市售肉制品的安全性，需要寻找有效的亚硝酸盐替代方法。一些微生物被广泛应用于食品发酵，且其中普遍拥有一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因[5]，其表达蛋白NOS 可催化L-精氨酸产生一氧化氮（nitric oxide，NO）和瓜氨酸。NO与肉制品中的肌红蛋白结合能产生具有典型红色泽的亚硝基肌红蛋白（nitrosomyoglobin，NO-Mb）[6]。NOS较早被发现于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等细菌中[7-9]。近年来，有研究者接种发酵乳杆菌（Lactobacillus fermenturm）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、小牛动物球菌（Mammaliicoccus vitulinus）至香肠或肉糜中，在没有亚硝酸盐添加的情况下，均有效提升了肉体系的红色泽，且检测出体系NO-Mb 的存在[10-13]。这种无亚硝酸盐条件下NO-Mb 的产生被推测是L-精氨酸转化形成的NO 作用于肌红蛋白的结果，然而，这种通过NOS 类酶作用产生的NO-Mb 却远弱于亚硝酸钠添加的效果[12-14]。因此，需要了解NOS 活性变化规律来调控肉制品的颜色。细菌NOS 与哺乳动物NOS 在结构上有所不同，它们普遍缺乏哺乳动物NOS 中存在的还原酶结构域，因此在细菌体内，该酶的催化过程还需要一些宿主还原酶参与电子的传递[15]。由于细菌NOS 蛋白结构和催化过程复杂，在研究过程中酶活性的检测存在难度。
目前，研究过程中对细菌NOS 活性检测的方法均是通过添加底物和辅因子进行反应后，对催化产物含量的测定判断的，主要分为3 种：第一种是检测NOS催化产物瓜氨酸的含量；第二种是使用针对NO 的特异性荧光探针，通过在细胞中装载探针，测定体系中荧光强度值来反映NOS 的活性；第三种是通过检测亚硝酸盐的含量即可准确测定NOS 活性。NO 作为一种还原性较高的自由基，极易被氧化成亚硝酸盐，所以第三种是目前NOS 酶活测定主要的方法[16-17]。然而在含有nos 基因的细菌中，大部分也含有nir 基因。NiR 能够降解亚硝酸盐生成NO 或其他产物[1]，严重影响了测定NOS 活性的准确性。为消除这种影响，需要敲除实验菌株的nir 基因。基因敲除是用含有一定已知序列的DNA 片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA 导入技术，可以令特定的基因功能丧失作用。Cre-loxP 基因敲除系统是目前普遍使用的一种基因敲除方法。该敲除系统首先通过同源重组方式将待敲除基因位点置换为两端具有同向排列的loxP序列的选择性标记基因，再运用Cre 重组酶将两个loxP 间的全部序列切除，以达到基因的敲除目的[18-21]。B. subtilis 168 菌株的NiR 由3 个基因编码[22]，分别为nasB、nasD 和nasE。本研究分别对这3 个基因进行敲除，对敲除基因后B.subtilis 168 菌株的表型进行鉴定，为消除宿主菌中NiR 对NOS 活性测定的影响，提供了有效途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
琼脂糖、4S green 核酸染色剂、50×TAE 缓冲液、卡那霉素、壮观霉素、氯霉素、DNA 分子量标准marker、水解酪蛋白、5×Taq PCR Master Mix、甘油：上海生工生物工程股份有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、二水柠檬酸三钠、葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙：国药集团化学试剂有限公司；PrimeSTAR Max DNA 聚合酶：宝日医生物技术（北京）有限公司；5×DNA 上样缓冲液：天根生化科技（北京）有限公司；博莱霉素：北京索莱宝生物科技有限公司；酵母粉：赛默飞世尔科技公司；胰蛋白胨：合肥白鲨生物科技有限公司。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物：南京擎科生物科技有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.1.2 菌株和质粒信息
本研究所用菌株信息如表1 所示，质粒信息如表2 所示。
表1 菌株信息
Table 1 Strains information
菌株名称BSU ΔnasB BSU ΔnasD BSU ΔnasE BSU遗传特征B.subtilis 168 野生型BSU 衍生菌株，ΔnasB：：zeo BSU 衍生菌株，ΔnasD：：spc BSU 衍生菌株，ΔnasE：：cm来源中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室保藏本研究本研究本研究
表2 质粒信息
Table 2 Plasmids information
质粒名称P7s/P43 P7z/P43 P7c/P43遗传特征壮观霉素抗性博来霉素抗性氯霉素抗性来源中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室保藏中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室保藏中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室保藏
1.1.3 培养基
LB 肉汤培养基（用于B.subtilis 168 的活化与传代培养）、LB 琼脂培养基（添加抗生素后用于敲除基因后的B.subtilis 168 抗性筛选）：青岛海博生物技术有限公司。GM 培养基母液：10×最低盐溶液、50% 葡萄糖、5%水解酪蛋白、10%酵母汁、钙镁离子溶液。水解酪蛋白在无菌洁净工作台中通过无菌过滤膜除菌，其余溶液组分于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。100 mL 10×最低盐溶液：用蒸馏水溶解18.34 g K2HPO4·H2O、6.0 g KH2PO4、2.0 g（NH4）2SO4、1.0 g 二水柠檬酸三钠、0.2 g MgSO4·7H2O，并定容至100 mL。20 mL 钙镁离子溶液：用蒸馏水溶解2.03 g MgCl2·6H2O、0.22 g CaCl2，并定容至20 mL。5 mL GM I 培养基：500µL 10×最低盐溶液、50µL 50% 葡萄糖溶液、20µL 5% 水解酪蛋白溶液、50µL 10% 酵母汁和4.38 mL 无菌水。90 mL GM II 培养基：8.8 mL 10×最低盐溶液、900µL 50% 葡萄糖溶液、72µL 5% 水解酪蛋白溶液、36µL 10% 酵母汁、450µL 钙镁离子溶液和79.742 mL 无菌水。培养基中选择性地添加卡那霉素、博莱霉素、壮观霉素和氯霉素，工作浓度分别为100、20、50、5µg/mL。
1.1.4 试剂盒
一氧化氮检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；DiaSpin 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒：上海生工生物工程股份有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外分光光度计（6000PC）：上海元析仪器有限公司；高速冷冻离心机（CT14RD）：上海天美生化仪器设备工程有限公司；振荡培养箱（BSD-250）：上海博迅实业有限公司；洁净工作台（AlphaClean 1300）：力康精密科技有限公司；压力蒸汽灭菌器（YX280A）：上海三申医疗器械有限公司；超低温冰箱（902GP）：美国赛默飞世尔科技公司；凝胶成像仪（1600）：上海天能科技有限公司；PCR 仪（T100）、电泳仪（Power Basic）：伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 B.subtilis 168 感受态的制备
取斜面保藏的B. subtilis 168，无菌环境下使用接种环挑取菌株于5 mL GM I 培养基中活化，于37 ℃振荡（200 r/min）条件下培养13 h。取1 mL GM I 培养液加入到9 mL 新的GM I 培养基中，继续相同条件下培养3.5 h。取上述10 mL 培养液接种至90 mL GM II 培养基中，相同条件培养1.5 h。取上述GM II 培养液（10 mL）分装于50 mL 无菌离心管中，在4 ℃、860×g条件下离心5 min。用无菌移液枪吸除9 mL 上清液，留下1 mL 上清液重悬菌体，分装到1.5 mL 离心管中，每管分装500µL 菌液，并加入250µL 30% 甘油，于-80 ℃冻存备用。
1.3.2 敲除框的构建
以B. subtilis 168 基因组DNA 为模板，分别扩增nasB、nasD、nasE 基因的上游和下游1 000 bp 基因序列；同时从质粒P7z/P43、P7s/P43 和P7c/P43 中分别扩增出lox71-zeo-lox66、lox71-spc-lox66 和lox71-cm-lox66基因片段[23-25]。用于扩增3 个nas 基因上下游序列的PCR 体系共20µL，体系包括：10 mmol/L 上下游引物各0.8µL、10µL PrimeSTAR Max DNA 聚合酶、8.4µL无菌水，并用接种环少量挑取B.subtilis 168 单菌落接入该体系并搅匀。扩增lox71-spc-lox66、lox71-cmlox66、lox71-zeo-lox66 片段的PCR 体系共20µL，包括：10 mmol/L 上下游引 物 各0.8µL、10µL Prime-STAR Max DNA 聚合酶、8.4µL 无菌水，并用接种环分别少量挑取P7s/P43、P7c/P43、P7z/P43 大肠杆菌单菌落接入该体系并搅匀。试验所用引物如表3 所示，PCR 反应程序均为：95 ℃15 min 预变性；95 ℃30 s、55 ℃30 s 和72 ℃1 min 为一个循环，共循环35 次；最后继续延伸5 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察条带位置及大小。本研究所用引物信息见表3。
表3 引物信息
Table 3 Primers information
引物名称nasBup-F nasBup-R nasBdw-F nasBdw-R nasDup-F nasDup-R nasDdw-F nasDdw-R nasEup-F nasEup-R nasEdw-F nasEdw-R zeo/cm/spc-F zeo/cm-R spc-R引物序列（5'～3'）CCGCCACACATAATGTAACGAAG TCTCTAGAGGATCCCCGGGTAGTATCAGACCTCCTTT GGCG CATTATACGAACGGTAAATCGTCGGGCATTTTGACTG AACGACTGC GCACCATGTTTAAGAAGCCTTTCAC GCTGTTTCCAGTCCAAATGC TCTCTAGAGGATCCCCGGGTACAGATGATCCGCTCCT TATCAAATG CGAACGGTAGAATCGTCGACATGTCGTGACCACATCA TAATGAC CCGTATGAAATAAGCTGCTGGC GCACCACATTGTCGAGAGATG TCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGTCCATTCCTCCT CAATGATAG CATTATACGAACGGTAAATCGTCGCGCTGATCGAAGG AGAACATG AACGTCTTCAAAGGTGCCAATC TACCCGGGGATCCTCTAGAGA CGACGATTTACCGTTCGTATAATG GTCGACGATTCTACCGTTCG
分别将nasB 上下游序列与lox71-zeo-lox66 序列、nasD 上下游序列与lox71-spc-lox66 序列、nasE 上下游序列与lox71-cm-lox66 序列通过三重融合PCR 进行融合获得敲除框序列[26-28]，PCR 体系共20µL，包括：10µL PrimeSTAR Max DNA 聚合酶、10µL 敲除框左右壁序列及lox71-spc/cm/zeo-lox66 序列（浓度比例为1∶1∶2）。PCR 反 应 程序均 为95 ℃3 min 预变性；95 ℃30 s、55 ℃30 s 和72 ℃2 min 为一个循环，共循环15 次；最后继续延伸5 min。
取敲除框序列进行进一步扩增，PCR 体系共50µL，包括：2µL 敲除框序列、10 mmol/L 上下游引物各2µL，25µL PrimeSTAR Max DNA 聚合酶、19µL 无菌水。PCR 反应程序均为95 ℃3 min 预变性；95 ℃30 s、55 ℃30 s 和72 ℃2 min 为一个循环，共循环35 次；最后继续延伸5 min。得到大量敲除框序列扩增产物。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察条带位置及大小。
1.3.3 敲除框的转化
通过化学转化法将敲除框片段转化至B. subtilis 168 感受态细胞。取-80 ℃下保存的B.subtilis 168 感受态细胞，分别加入扩增出的nasB、nasD、nasE 敲除框片段，混匀并于37 ℃培养箱中振荡孵育2 h。孵育结束后将菌液在4 ℃条件下8 000×g 离心5 min，去除多余上清液，留取100µL 上清液重悬菌体并分别涂布于含博莱霉素、壮观霉素、氯霉素的LB 平板上，于37 ℃培养过夜。将具有抗性的菌株进行菌落PCR 验证，PCR 体系共20µL，包括：10 mmol/L 上下游引物各0.8µL、10µL 5×Taq PCR Master Mix、8.4µL 无菌水，并用接种环少量挑取单菌落接入该体系并搅匀。其中，PCR 引物为敲除框的上下游引物。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，分子量正确则证明转化成功，即获得ΔnasB BSU、ΔnasD BSU 和ΔnasE BSU 3 种基因缺陷型B.subtilis 168 菌株。
1.3.4 NiR 缺陷型B.subtilis 168 菌株的表型鉴定
将BSU、ΔnasB BSU、ΔnasD BSU、ΔnasE BSU 4 种B. subtilis 168 菌株分别接种于10 mL 含90µmol/L 亚硝酸钠的LB 培养基中，接种体系浓度至OD600=0.1。将其于37 ℃、转速150 r/min 的培养箱中振荡培养，并于培养12、18、24 h 后取出培养液1 mL，10 000×g，离心3 min，取上清液并使用一氧化氮检测试剂盒测定培养基上清液中的亚硝酸盐含量，分析菌株的NiR 酶活力。
1.4 数据处理
每个试验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示。使用Statistix 8.0 软件（analysis software，St. Paul，MN，USA）对数据进行分析，各数据之间的显著性差异（P＜0.05）使用Tukey HSD 程序进行检验，利用Origin 2018（Northampton，MA，USA）作图。
2 结果与分析
2.1 B.subtilis 168 nir 基因和lox71-spc/cm/zeo-lox66 序列的扩增
图1 为lox71-spc/cm/zeo-lox66 和3 组上下游同源臂的PCR 电泳图。为避免NiR 消耗体系中的亚硝酸盐[1]，需要敲除B.subtilis 168 基因组上的nir 基因。根据在NCBI 网站查询的信息可知，B.subtilis 168 的亚硝酸盐还原酶基因包含3 个基因编码，分别为nasB、nasD 和nasE，且3 种基因分别在基因组中的不同位置上[22]，3 个基因是否都拥有完整的NiR 活性目前未知。因此，为获得无亚硝酸盐还原酶活性的B.subtilis 168 菌株，分别对3 个基因进行敲除，对敲除后菌株的NiR 活性进行测定。首先对3 个nir 基因的上下游1 000 bp基因序列及3 个抗性基因序列进行扩增。
图1 lox71-spc/cm/zeo-lox66 和3 组上下游同源臂PCR 电泳图
Fig.1 PCR electrophoresis of lox71-spc/cm/zeo-lox66 and three groups of upstream and downstream homology fragments
由图1 可知，泳道1～3 包括nasD 基因的上下游同源臂序列以及lox71-spc-lox66 抗性基因框序列，这三段基因将通过融合PCR 组成nasD 基因敲除框[29]；泳道4～6 包括nasE 基因的上下游同源臂序列以及lox71-cm-lox66 抗性基因框序列，对应nasE 基因敲除框；泳道7～9 包括nasB 基因的上下游同源臂序列以及lox71-zeo-lox66 抗性基因框序列，对应nasB 基因敲除框。各泳道条带位置及大小正确且均无杂散条带，证明3 个nir 基因和lox71-spc/cm/zeo-lox66 序列均成功扩增。选择性标记基因lox71-spc/cm/zeo-lox66 需要分别置换到nasD、nasE、nasB 3 个基因所在位点处，可以让宿主菌B.subtilis 168 丧失NiR 活性的同时拥有抗生素抗性[7]，便于后续筛选菌株。
2.2 B.subtilis 168 nir 基因的敲除
分别将上下游基因序列和对应抗性基因框序列进行融合扩增，其中nasB 上下游基因序列对应lox71-zeolox66 抗性基因框序列；nasD 上下游基因序列对应lox71-spc-lox66 抗性基因框序列；nasE 上下游基因序列对应lox71-cm-lox66 抗性基因框序列。为了获得敲除框，第一次融合PCR 体系中不添加引物，目的是为了通过同源臂连接上下游基因片段和抗性基因片段，在连接成功后需要大量扩增敲除框，此时PCR 体系中需要添加引物，引物选择整个敲除框片段的上下游引物，即上游基因的上游引物（up-F）和下游基因的下游引物（dw-R）[26，29]。融合扩增后的3 组敲除框序列电泳图如2 所示，各条带位置及大小正确，证明各敲除框已经成功融合扩增。将3 个敲除框序列分别转化至B.subtilis 168 感受态细胞中，并涂布于具有相应抗生素的LB 固体培养基中，获得抗性菌株，结果见图3。
图2 nasB、nasD 和nasE 敲除框片段电泳图
Fig.2 Electrophoresis of nasB，nasD and nasE knockout box fragments
图3 nasB、nasD 和nasE 缺陷型菌株抗性筛选
Fig.3 Resistance selection of nasB，nasD and nasE deficient strains
野生型B.subtilis 168 菌株不含敲除框片段，所以不具有相应抗生素抗性，因此未能转化成功的菌株不能在抗性平板上生长并且不能通过PCR 验证。其中，ΔnasB 菌株用博来霉素筛选；ΔnasD 菌株用壮观霉素筛选；ΔnasE 菌株用氯霉素筛选。筛选出的菌株用于亚硝酸盐还原酶活性的表型鉴定。
2.3 3 种NiR 缺陷型菌株的表型鉴定
图4 表示3 种nas 缺陷型菌株分别培养12、18 h和24 h 后培养液中的亚硝酸盐含量。
图4 3 种nas 缺陷型菌株培养12、18 h 和24 h 后培养液中亚硝酸盐含量
Fig.4 Nitrite contents in culture solutions of three nas deficient strains after 12，18 h and 24 h
亚硝酸盐还原酶的3 个不同基因编码蛋白在还原亚硝酸盐的途径中可能起着不同的作用。因此，不同基因缺陷型B.subtilis 168 菌株对亚硝酸盐降解能力也会有所不同。本研究将3 种基因缺陷型菌株培养于添加90µmol/L 亚硝酸钠的LB 液体培养基中，通过测定不同时间培养后培养基中亚硝酸钠含量来判断菌株的NiR 活性。由图4 可知，在培养12、18 h 和24 h 后BSU 和ΔnasB BSU 菌株对亚硝酸盐的消耗均几乎相当，在12 h 时培养基中的亚硝酸盐就几乎被消耗殆尽，说明敲除nasB 基因的ΔnasB BSU 菌株仍具有降解亚硝酸盐的能力[1]。ΔnasE BSU 型菌株在培养至12 h和18 h 时，培养基中亚硝酸盐含量有所提升，而在24 h 时含量降低。其可能的原因是，在生长前期（18 h之前），培养基中菌数较低，此时亚硝酸盐还原酶对亚硝酸盐的降解能力还较弱，且菌株本身存在NOS，产生的NO 被氧化成终产物亚硝酸盐[30]，进一步提升了体系内亚硝酸盐含量；在生长后期（18～24 h），菌数大幅度增加，对亚硝酸盐的降解能力也随之增加。因此，根据ΔnasE BSU 菌株对亚硝酸盐的降解规律可以得出，该菌株被削弱了亚硝酸盐还原酶活性，但是没有完全消除。与前两株敲除菌不同，ΔnasD BSU 在生长不同时期培养基中亚硝酸盐含量均未减少，且因为NOS 的存在而有所增加，这表明该型菌株亚硝酸盐还原酶活性已被完全消除，不再具备降解亚硝酸盐能力。
3 结论
NOS 的催化产物NO 极易被氧化成亚硝酸盐，因而检测亚硝酸盐的含量即可准确测定NOS 酶活性。然而，在含有nos 基因的细菌中，大部分也含有nir 基因。NiR 能够降解亚硝酸盐生成NO，这严重影响了测定NOS 酶活性的准确性。本研究以B. subtilis 168 为例，通过同源重组的方式扩增出3 种nir 基因位点上下游片段，同时从质粒P7z/P43、P7s/P43 和P7c/P43 中分别扩增出lox71-zeo-lox66、lox71-spc-lox66 和lox71-cm-lox66 抗性基因片段，再通过三重融合PCR 融合敲除框片段后将其转化进B.subtilis 168 中，筛选出通过抗性平板筛选具有抗性的菌株。根据3 种NiR 缺陷型菌株NiR 活性测定结果可知，ΔnasD BSU 菌株亚硝酸盐还原酶活性已被完全消除，不再具备降解亚硝酸盐能力。本研究为准确测定细菌中NOS 酶活性提供了一种切实可行的方法。
[1] 张庆芳,李美玉,王晓辉,等.微生物亚硝酸盐还原酶的研究进展[J].微生物学通报,2019,46(11):3148-3157.ZHANG Qingfang,LI Meiyu,WANG Xiaohui,et al.Research progress of microbial nitrite reductase[J]. Microbiology China, 2019, 46(11):3148-3157.
[2] DEVECI G, TEK N A. N-Nitrosamines: A potential hazard in processed meat products[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2024,104(5):2551-2560.
[3] BEDALE W, SINDELAR J J, MILKOWSKI A L. Dietary nitrate and nitrite: Benefits, risks, and evolving perceptions[J]. Meat Science,2016,120:85-92.
[4] LARSSON S C,ORSINI N,WOLK A.Processed meat consumption and stomach cancer risk: A meta-analysis[J]. Journal of the National Cancer Institute,2006,98(15):1078-1087.
[5] RAS G,LEROY S,TALON R.Nitric oxide synthase:What is its potential role in the physiology of staphylococci in meat products?[J].International Journal of Food Microbiology,2018,282:28-34.
[6] 罗慧婷,孔保华,李沛军,等.细菌一氧化氮合酶及其在食品科学研究中的应用[J].食品科学,2014,35(17):266-271.LUO Huiting, KONG Baohua, LI Peijun, et al. Bacterial nitric oxide synthase and its application in food science: A review[J]. Food Science,2014,35(17):266-271.
[7] PATEL B A, CRANE B R. When it comes to antibiotics, bacteria show some NO-how[J]. Journal of Molecular Cell Biology, 2010, 2(5):234-236.
[8] WANG Z Q, LAWSON R J, BUDDHA M R, et al. Bacterial flavodoxins support nitric oxide production by Bacillus subtilis nitric-oxide synthase[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(4):2196-2202.
[9] VAN SORGE N M,BEASLEY F C,GUSAROV I,et al.Methicillinresistant Staphylococcus aureus bacterial nitric-oxide synthase affects antibiotic sensitivity and skin abscess development[J]. The Journal of Biological Chemistry,2013,288(9):6417-6426.
[10] HUANG P, XU B C, SHAO X F, et al. Theoretical basis of nitrosomyoglobin formation in a dry sausage model by coagulase-negative staphylococci: Behavior and expression of nitric oxide synthase[J].Meat Science,2020,161:108022.
[11] HUANG P, SHAO X F, ZHU M M, et al. Sucrose enhances colour formation in dry sausages by up-regulating gene expression of nitric oxide synthase in Staphylococcus vitulinus[J]. International Journal of Food Microbiology,2020,315:108419.
[12] LI P J,LUO H T,KONG B H,et al.Formation of red myoglobin derivatives and inhibition of spoilage bacteria in raw meat batters by lactic acid bacteria and Staphylococcus xylosus[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,68:251-257.
[13] LI P J, KONG B H, CHEN Q, et al. Formation and identification of nitrosylmyoglobin by Staphylococcus xylosus in raw meat batters: A potential solution for nitrite substitution in meat products[J]. Meat Science,2013,93(1):67-72.
[14] ZHANG X, KONG B H, XIONG Y L. Production of cured meat color in nitrite-free Harbin red sausage by Lactobacillus fermentum fermentation[J].Meat Science,2007,77(4):593-598.
[15] GUSAROV I, STARODUBTSEVA M, WANG Z Q, et al. Bacterial nitric-oxide synthases operate without a dedicated redox partner[J].The Journal of Biological Chemistry,2008,283(19):13140-13147.
[16] DAI W B, DENG Y Y, CHEN X H, et al. A mitochondria-targeted supramolecular nanoplatform for peroxynitrite-potentiated oxidative therapy of orthotopic hepatoma[J]. Biomaterials, 2022, 290:121854.
[17] ZHU D S, HOU J L, QIAN M, et al. Nitrate-functionalized patch confers cardioprotection and improves heart repair after myocardial infarction via local nitric oxide delivery[J]. Nature Communications,2021,12:4501.
[18] GU H, ZOU Y R, RAJEWSKY K. Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting[J].Cell,1993,73(6):1155-1164.
[19] 孔梓宇,柳毅,汪晖.Cre-LoxP 条件性基因敲除的实际应用策略[J].中国生物化学与分子生物学报,2022,38(9):1125-1132.KONG Ziyu, LIU Yi, WANG Hui. Practical application strategies of cre-LoxP conditional gene knockout[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2022,38(9):1125-1132.
[20] KAWANO F, OKAZAKI R, YAZAWA M, et al. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering[J].Nature Chemical Biology,2016,12:1059-1064.
[21] ZHANG X, LU R Q, WANG Q, et al. Production of D-tagatose by whole-cell conversion of recombinant Bacillus subtilis in the absence of antibiotics[J].Biology,2021,10(12):1343.
[22] HOFFMANN M, BRAIG A, FERNANDEZ CANO LUNA D S, et al. Evaluation of an oxygen-dependent self-inducible surfactin synthesis in B. subtilis by substitution of native promoter PsrfA by anaerobically active PnarG and PnasD[J].AMB Express,2021,11(1):57.
[23] ALIU E, LEE K, WANG K. CRISPR RNA-guided integrase enables high-efficiency targeted genome engineering in Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(10):1916-1927.
[24] KITAGAWA W,HATA M.Development of efficient genome-reduction tool based on cre/loxP system in Rhodococcus erythropolis[J].Microorganisms,2023,11(2):268.
[25] LUO G J,ZHAO N N,JIANG S B,et al.Application of RecET-Cre/loxP system in Corynebacterium glutamicum ATCC14067 for L-leucine production[J].Biotechnology Letters,2021,43(1):297-306.
[26] LI W, TAO Y, SONG C F, et al. Multiple copies of the fusion gene cflyC-mzfDB3 enhance the expression of a hybrid antimicrobial peptide in Pichia pastoris[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2021,57(2):189-199.
[27] LIU L, LIU W B, HE Y Y, et al. Transcriptional regulation of hmsB, A temperature-dependent small RNA, by RovM in Yersinia pestis biovar Microtus[J].Current Microbiology,2023,80(5):182.
[28] YAN J L, LIN N Q, WANG X Q, et al. Markerless gene deletion in Ralstonia solanacearum based on its natural transformation competence[J].Frontiers in Microbiology,2022,13:977580.
[29] DIEBOLD P J, NEW F N, HOVAN M, et al. Linking plasmidbased beta-lactamases to their bacterial hosts using single-cell fusion PCR[J].eLife,2021,10:e66834.
[30] CRANE B R, SUDHAMSU J, PATEL B A. Bacterial nitric oxide synthases[J].Annual Review of Biochemistry,2010,79:445-470.