苏氨酸是人与动物体内的一种必需氨基酸，其主要作用是维持蛋白质平衡、促进人体正常生长[1-2]。此外，还具有改善机体免疫和促进生长等功能，因此被广泛应用于医药[3-4]、食品强化剂[5-6]、饲料添加剂[7-9]等方面。
苏氨酸的生产主要以发酵法为主[10-12]，发酵液经过闪蒸结晶后的一次母液再次回流进行结晶蒸发，最终的废液为苏氨酸二次母液，是苏氨酸发酵过程中占比较大、处理成本较高和潜在利用价值最大的副产物。因此将苏氨酸二次母液进行回收利用再次提取苏氨酸，不仅会使效益最大化，而且对于苏氨酸的研究具有良好的促进作用。然而，在苏氨酸加工过程中会产生大量棕褐色色素，严重影响进一步开发利用，同时对苏氨酸二次母液中苏氨酸的分离提取及最终产品的纯度影响较大。
目前，已有的发酵液脱色方式多为离子交换树脂法及活性炭法，如采用活性炭法对L-高丝氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸发酵液进行脱色[13-15]；采用D3520 树脂和201×7 树脂、SQD817 树脂、AB-8 大孔树脂对精氨酸溶液、L-色氨酸、复合氨基酸水解液脱色[16-18]，均具有良好的脱色效果，但目前关于苏氨酸二次母液的脱色研究较少，因此，本研究采用不同树脂和活性炭粉末对苏氨酸二次母液进行脱色处理筛选出最适脱色剂并对脱色参数进行优化，以期为苏氨酸二次母液的开发利用提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
苏氨酸二次母液（干物质含量为42.72%）：黑龙江伊品生物科技有限公司；粉末活性炭：福晨（天津）化学试剂有限公司；AB-8 大孔吸附树脂：陕西乐博生化科技有限公司；D101 大孔吸附树脂、001×7 强酸阳离子树脂、D113 弱酸阳离子树脂、717 强碱阴离子树脂、D201 强碱阴离子树脂、D290 强碱阴离子树脂、D301弱碱阴离子树脂：郑州和成新材料科技有限公司；茚三酮：上海麦克林生化科技股份有限公司；浓硫酸、苯酚、磷酸氢二钠：天津市大茂化学试剂厂；茚三酮显色液、氨基酸混合标准液（H 型）：日本和光纯药工业株式会社；MCI 缓冲溶液：日本三菱化学公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FE28 pH 计：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；SPECTROstar Nano 酶标仪：德国BMG LABTECH 公司；SPECORD 200 紫外-可见分光光度计：德国耶拿公司；CHA-2A 气浴恒温振荡器：常州申光仪器有限公司；L8900 氨基酸分析仪：日本Hitachi 公司。
1.3 方法
1.3.1 脱色剂的预处理及筛选
试验选用粉末活性炭及8 种不同树脂（AB-8、D101、001×7、D113、717、D201、D290、D301）作为脱色剂。
1.3.1.1 树脂的预处理
1）大孔树脂预处理
用95%以上的乙醇浸泡树脂12 h，用纯水冲洗至无醇味，备用。
2）酸性阳离子树脂预处理
纯水搅拌洗去杂质，用4% 盐酸溶液浸泡并搅拌6 h，再用纯水搅拌洗至pH 值为3，用3% 氢氧化钠溶液浸泡并搅拌6 h，再用纯水洗至pH 值为中性，备用。
3）碱性阴离子树脂预处理
纯水搅拌洗去杂质，用6% 盐酸溶液浸泡并搅拌6 h，后用纯水搅拌洗至pH 值为4，用4% 氢氧化钠溶液浸泡并搅拌6 h，再用纯水洗至pH 值为中性，备用。
1.3.1.2 脱色剂的筛选
准确称取10 g 预处理后的粉末活性炭和树脂分别于500 mL 具塞三角瓶中，再加入100 mL 苏氨酸二次母液稀释液（稀释20 倍），然后将具塞三角瓶放入气浴恒温振荡器中，在30 ℃和130 r/min 条件下进行静态脱色，每2 h 取1 次溶液测吸光度，吸附至平衡（12 h），抽滤，取样分析，计算脱色率、苏氨酸损失率和总糖损失率。
1.3.2 母液中氨基酸含量的测定
参照GB/T 30987—2020《植物中游离氨基酸的测定》[19]及Lin 等[20]方法使用氨基酸分析仪进行测定。
1.3.3 脱色过程中氨基酸含量测定
参照刘海艳[21]的方法进行测定。得到标准曲线方程y=0.327 1x-1.081 8，R2=0.995 3。
1.3.4 总糖含量测定
参照张丽霞[22]的方法进行测定。得到标准曲线方程y=1.259 1x+0.001 46，R2=0.998 3，表明测定范围内线性关系较好。
1.3.5 脱色率、苏氨酸损失率和总糖损失率的测定
1.3.5.1 脱色率测定
参照王新杰等[23]的方法进行测定。将酶标仪于420 nm 预热30 min，测定苏氨酸二次母液脱色前后吸光度，并按公式（1）计算苏氨酸二次母液脱色率（T，%）。
式中：A0 为脱色前苏氨酸二次母液的吸光度；A 为脱色后苏氨酸二次母液的吸光度。
1.3.5.2 苏氨酸损失率计算
测定脱色前后苏氨酸二次母液中苏氨酸含量，并按公式（2）计算苏氨酸损失率（S，%）。
式中：C0 为脱色前苏氨酸二次母液中的苏氨酸含量，mg/mL；C 为脱色后苏氨酸二次母液中的苏氨酸含量，mg/mL。
1.3.5.3 总糖损失率计算
测定脱色前后苏氨酸二次母液中总糖含量，并按公式（3）计算总糖损失率（Z，%）。
式中：C1 为脱色前苏氨酸二次母液中的总糖含量，mg/mL；C2 为脱色后苏氨酸二次母液中的总糖含量，mg/mL。
1.3.6 工艺优化
1.3.6.1 单因素试验
1）脱色温度对脱色效果的影响
取稀释液20 mL 于100 mL 具塞三角瓶中，活性炭添加量为20%，稀释液自然pH 值，脱色时间50 min，在此条件下研究不同脱色温度（25、30、35、40、45 ℃）对苏氨酸二次母液脱色效果的影响。
2）脱色时间对脱色效果的影响
取稀释液20 mL 于100 mL 具塞三角瓶中，活性炭添加量为20%，稀释液自然pH 值，探究不同脱色时间（30、35、40、45、50 min）对苏氨酸二次母液脱色效果的影响。
3）活性炭添加量对脱色效果的影响
取稀释液20 mL 于100 mL 具塞三角瓶中，脱色温度30 ℃、稀释液pH 值自然、脱色时间50 min，在此条件下研究不同活性炭添加量（10%、15%、20%、25% 和30%）对苏氨酸二次母液脱色效果的影响。
4）母液pH 值对脱色效果的影响
取稀释液20 mL 于100 mL 具塞三角瓶中，活性炭添加量20%，脱色温度30 ℃，脱色时间50 min，在此条件下研究不同pH 值（4、6、8、10 和自然pH5.86）对苏氨酸二次母液脱色效果的影响。
1.3.6.2 响应面试验
以单因素试验为基础，基于Box-Behnken 试验设计原理，以苏氨酸二次母液脱色率和苏氨酸损失率为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平-1 0 1 A 脱色温度/℃25 30 35 B 脱色时间/min 30 35 40 C 活性炭添加量/%15 20 25
1.4 数据统计分析
利用Excel 和SPSS 26 对数据进行分析，所有试验均重复3 次，采用Origin 2019 进行绘图，利用Design-Expert 13 设计软件进行响应面设计及分析。
2 结果与分析
2.1 苏氨酸二次母液中的氨基酸组成
苏氨酸二次母液中氨基酸组成如表2 所示。
表2 苏氨酸二次母液中17 种氨基酸组成
Table 2 Composition of 17 amino acids included in the threonine secondary mother liquor
注：*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；***表示差异高度显著，P＜0.001。
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17氨基酸种类苏氨酸（Thr）谷氨酸（Glu）异亮氨酸（IIe）胱氨酸（Cys）胱氨酸（Cys）苯丙氨酸（Phe）酪氨酸（Tyr）丝氨酸（Ser）缬氨酸（Val）甘氨酸（Gly）天冬氨酸（Asp）组氨酸（His）丙氨酸（Ala）赖氨酸（Lys）亮氨酸（Leu）精氨酸（Arg）蛋氨酸（Met）质量浓度/（g/100 mL）7.82 1.96 1.36 0.32 0.35 0.27 0.21 0.18 0.10 0.10 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.01显著性***********
由表2 可知，苏氨酸二次母液中苏氨酸质量浓度达到高度显著水平，达7.82 g/100 mL，具有很好的分离纯化价值。
2.2 不同脱色剂对苏氨酸二次母液的影响
不同脱色剂对苏氨酸二次母液的影响如图1所示。
图1 不同脱色剂脱色效果对比
Fig.1 Decolorization effect comparison of different decolorization agents
由图1 可知，不同脱色剂对苏氨酸二次母液的脱色效果有明显差异，在相同条件下，活性炭具有良好的脱色效果，苏氨酸损失也相对较少且可以去除母液中80%以上的残糖[24]，其次分别是717 树脂、D201 树脂、D290 树脂。而D113 树脂脱色效果最差，并且苏氨酸损失率与粉末活性炭效果几乎相同，且总糖损失率相对较低。这是由于粉末活性炭内部孔隙结构发达，比表面积较大，吸附性能强，与苏氨酸二次母液中的有色物质有较大的接触面积，使得色素分子紧密附着于活性炭表面，在抽滤过程中色素分子随活性炭一同去除而具有更优的脱色效果。因此，综合考虑选择活性炭作为脱色剂对苏氨酸二次母液脱色效果进行优化。
2.3 单因素试验结果分析
2.3.1 脱色温度对脱色效果的影响
脱色温度对脱色效果的影响如图2 所示。
图2 脱色温度对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
Fig.2 Influence of decolorization temperature on decolorization effect of threonine secondary mother liquor
由图2 可知，当脱色温度高于25 ℃时，随着脱色温度升高苏氨酸二次母液脱色率明显提高，这可能是由于脱色温度的升高，稀释液黏度降低、分子扩散速度加快[25]，色素更易于渗透到活性炭内部吸附位点，有利于吸附的进行，因此提高了脱色率。而高于30 ℃时脱色率变化趋势开始趋近平缓。这可能是由于脱色温度过高及脱色时间过长，造成了活性炭已吸附的色素释放[26]。苏氨酸损失率在30 ℃时也达到最低，综合考虑成本及能耗，最终选取脱色温度为25、30、35 ℃进行响应面试验。
2.3.2 脱色时间对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
脱色时间对苏氨酸二次母液脱色效果的影响如图3 所示。
图3 脱色时间对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
Fig.3 Influence of decolorization time on decolorization effect of threonine secondary mother liquor
由图3 可知，苏氨酸二次母液在脱色35 min 时脱色效果最好，并且随脱色时间延长，脱色率下降，这可能是因为活性炭在吸附过程中需要一定接触时间，使色素分子渗入活性炭粉末的吸附位点中[27-28]，且随着脱色时间的延长，活性炭吸附的色素被重新释放，因此导致脱色率下降，并且脱色时间过长会导致苏氨酸损失率提高，综合考虑最终选取脱色时间为30、35、40 min 进行响应面试验。
2.3.3 活性炭添加量对脱色效果的影响
活性炭添加量对苏氨酸二次母液脱色效果的影响如图4 所示。
图4 活性炭添加量对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
Fig.4 Influence of activated carbon content on decolorization effect of threonine secondary mother liquid
由图4 可知，稀释液中活性炭添加量与脱色率整体上呈显著正相关，活性炭添加量由10%增加到20%时，脱色率由66% 增加到96%，而当活性炭添加量由20%继续增加时，脱色率增加缓慢，母液中苏氨酸的损失率也呈现逐渐上升的趋势，对脱色率和苏氨酸损失率综合考虑，最终选取活性炭添加量为15%、20%、25%进行响应面试验。
2.3.4 pH 值对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
pH 值对苏氨酸二次母液脱色效果的影响如图5所示。
图5 pH 值对苏氨酸二次母液脱色效果的影响
Fig.5 Influence of pH value on decolorization effect of threonine secondary mother liquid
由图5 可知，稀释液在酸性条件下脱色率较高且苏氨酸损失率较小，当pH 值超过8 时，脱色率迅速下降，苏氨酸损失率迅速增加，若采用酸调节pH 值虽可以提高稀释液的脱色率，但同时也会增加生产成本，稀释液的原始pH 值为5.86，考虑到时间成本及工艺优化，最终将稀释液固定为自然pH 值。
2.4 响应面试验结果与分析
2.4.1 响应面试验结果
根据表1 设计因素，采用Design-Expert 13 设计软件对脱色工艺进行试验设计，试验得到最佳试验条件，响应面试验结果见表3。
表3 响应面试验结果
Table 3 Response surface test design and results
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 脱色温度-1-1 1 0 0 0-1 0 1 0 0 1 0-1 0 0 1 B 脱色时间-1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1-1-1 0-1 0 0 C 活性炭添加量0 0 0 0 0 0-1 0 1 1-1 0 1 1-1 0-1 Y1 苏氨酸二次母液脱色率/%93.44 95.43 97.85 98.07 97.95 97.85 92.21 97.84 98.27 97.74 93.80 95.76 95.38 95.47 92.16 98.07 94.03 Y2 苏氨酸损失率/%11.74 20.91 8.37 14.28 13.32 14.13 9.13 14.37 12.35 15.34 11.13 11.74 16.36 30.98 2.71 13.27 17.84
2.4.2 模型建立与方差分析结果
利用Design-Expert 13 软件对试验数据进行分析，得到二次多项回归方程如下。
该回归方程显著性及方差分析结果见表4。
表4 苏氨酸二次母液脱色率拟合回归方程的方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis of fitting regression equation for the decolorization rate of threonine secondary mother liquor
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源回归模型A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差合计平方和76.12 10.95 8.16 26.86 0.002 500 0.24 0.13 4.69 6.90 15.29 0.068 0.017 0.051 76.19自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16方差8.46 10.95 8.16 26.86 2.50×10-3 0.24 0.13 4.69 6.90 15.29 9.68×10-3 5.68×10-3 0.013 F 值873.61 1 131.16 842.93 2 774.84 0.26 24.80 13.39 484.52 713.11 1 579.12 0.45 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.627 0 0.001 6 0.008 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.732 1显著性****************
由表4 可知，各因素对脱色率影响大小顺序为C＞A＞B，即活性炭添加量＞脱色温度＞脱色时间。R2=0.999 1，该模型极显著，同时RAdj2=0.998 0，能够解释试验99.80% 的响应值变异，且与预测相关系数RPred2也接近，说明此试验模型与试验数据具有较高的拟合度，具有实际意义。
以最大脱色率为优化目标，根据Design-Expert 13软件运行结果，脱色率在脱色温度、脱色时间、活性炭添加量等因素共同影响下的最优工艺为脱色温度30.67 ℃、脱色时间35.67 min、活性炭添加量20.67%，在此条件下模型预测的脱色率为98.42%。
苏氨酸损失率拟合回归方程的方差分析结果如表5 所示。
表5 苏氨酸损失率拟合回归方程的方差分析结果
Table 5 Results of variance analysis of fitting regression equation for threonine loss rate
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源回归模型A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差合计平方和560.85 63.06 21.78 146.38 39.31 186.87 22.28 31.91 49.74 3.78 2.61 1.46 1.15 563.46自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16方差62.32 63.06 21.78 146.38 39.31 186.87 22.28 31.91 49.74 3.78 0.37 0.49 0.29 F 值167.30 169.28 58.47 392.97 105.54 501.68 59.81 85.67 133.53 10.16 1.69 P 值＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.015 3 0.304 8显著性*******************
由表5 可知，各因素对苏氨酸损失率影响大小顺序为C＞A＞B，即活性炭添加量＞脱色温度＞脱色时间。R2=0.995 4，该模型极显著，同时R2adj=0.989 4，能够解释试验98.94% 的响应值变异，接近预测相关系数R2Pred，说明此试验模型与真实数据有较好的拟合度，具有实践指导意义，由此可以用该模型分析和预测损失率最优提取工艺。
以最小损失率为优化目标，根据Design-Expert 13软件运行结果，损失率在脱色温度、脱色时间、活性炭添加量等因素共同影响下的最优工艺条件为脱色温度27.94 ℃、脱色时间30.73 min、活性炭添加量15.05%，在此条件下模型预测的损失率为2.39%。
2.4.3 苏氨酸二次母液最佳脱色工艺条件验证
应用响应面法对回归模型进行优化确定最优工艺条件为脱色温度35 ℃、脱色时间40 min、活性炭添加量24.67%、自然pH 值，得到的苏氨酸二次母液脱色率为98.27%，苏氨酸损失率为5.13%。为方便实际操作，将工艺技术参数优化调整为脱色温度35 ℃、脱色时间40 min、活性炭添加量25%，自然pH 值，并在此参数下进行3 次重复试验，得到的苏氨酸二次母液平均脱色率为97.69%，苏氨酸损失率为5.02%，偏差率均小于2%，与模型预测结果接近，表明基于该响应面模型分析优化苏氨酸二次母液除杂工艺的方法有效可行。
2.4.4 苏氨酸二次母液脱色率及苏氨酸损失率的准确性分析
苏氨酸二次母液脱色率及苏氨酸损失率的准确性分析结果如图6 所示。
图6 苏氨酸二次母液脱色率和损失率的准确性分析
Fig.6 Accuracy analysis of decolorization rate and loss rate of threonine secondary mother liquor
由图6 可知，17 组响应值较为合理地分布于一条直线两侧，且其方差无偏差显示，本试验的试验值十分靠近预测值，表明本试验所建立的模型增强了3 个变量参数与响应之间的关系。通过建模拟合，对内部残差与17 组试验运行数据进行分析，所有杠杆点都小于2，处于样本空间中心，表明试验模型中不存在有效误差，相反，在确定的范围内，17 组试验数据中无影响模型的观察值，通过上述回归分析，表明本试验建立的苏氨酸脱色工艺模型具有较高的准确性，可以用于苏氨酸二次母液的脱色制备[29]。
3 结论
以苏氨酸二次母液脱色率和苏氨酸损失率为评价指标，选取粉末活性炭及8 种不同的树脂作为脱色剂对苏氨酸二次母液进行脱色处理。结果显示，粉末活性炭相比于其他脱色剂具有较好的脱色效果。以粉末活性炭作为苏氨酸二次母液的脱色剂，通过单因素试验和响应面优化试验对苏氨酸二次母液进行脱色条件的优化。结果表明，苏氨酸二次母液的最佳脱色工艺参数为脱色温度35 ℃、脱色时间40 min、活性炭添加量25%、自然pH 值，此条件下，苏氨酸二次母液的脱色率为97.69%，苏氨酸损失率为5.02%。本试验为苏氨酸二次母液中苏氨酸的进一步提取、纯化奠定一定的基础。
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