黑果腺肋花楸为蔷薇科腺肋花楸属落叶灌木，又名野樱莓、不老莓，从20 世纪90 年代由欧洲引种到我国，在我国东北地区尤其是辽宁地区种植较多[1]。黑果腺肋花楸果实中含有极为丰富的多酚类化合物，被认为是一种良好的膳食抗氧化剂来源[2]，其果实提取物富含花青素、类黄酮、多种维生素等成分，在抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂和保胃等方面发挥着重要功效[3-5]。未经加工的黑果腺肋花楸果实具有极高的食用和药用价值，因其果实中含有大量的单宁，酸味和涩味较重[6-7]，因此很少被直接生食。近年来，对黑果腺肋花楸深加工所得的系列产品有果酒、果汁、保健型果茶以及膳食补充剂等[8-9]。
花生粕是以脱壳花生仁为原料，经榨油后的副产品，具有清淡花生香味[10]。低温压榨花生粕是经过低温压榨工艺制备而得，含有多种氨基酸，其蛋白质变性程度小，溶解性、持水性、乳化性及乳化稳定性等功能特性稳定，是良好的食品加工原料[11-12]，花生粕经酶解或提取蛋白后，可制得花生蛋白饮料[13-14]。
将黑果腺肋花楸汁与花生粕乳液结合研制出的黑果腺肋花楸花生粕乳饮料，能够赋予乳饮料多重的营养功效，弥补花生粕乳饮料口味单一的缺点，并为我国黑果腺肋花楸的深加工提供参考。黑果腺肋花楸汁的加入，使得花生粕乳液的pH 值下降，导致在等电点附近乳饮料中的花生蛋白絮凝和沉淀，从而导致乳饮料在调酸、杀菌等过程中极易出现分层和沉淀现象[15]，应控制花生蛋白在酸性条件下保持稳定。复配稳定剂与单一稳定剂相比，可以发挥协同作用，具有更好的稳定效果，故在生产中多采用复配稳定剂来提高饮料稳定性[16-17]。
本文以辽宁地区特色小浆果黑果腺肋花楸和花生油副产物花生粕（低温压榨花生粕）为原料，开发出一款酸性蛋白乳饮料，旨在通过复配稳定剂发挥协同作用使花生蛋白在酸性条件下保持稳定，从而提高乳饮料的稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑果腺肋花楸：辽宁省海城市黑果腺肋花楸种植基地；低温压榨花生粕：辽宁省农科院；白砂糖：市售；柠檬酸、碳酸氢钠、羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose，CMC）、海藻酸钠、阿拉伯胶（均为食品级）：河南万邦实业有限公司。
1.2 仪器与设备
BT-9300ST 激光粒径分析仪：上海甄明科学仪器有限公司；DiscoveryHR-1 流变仪：美国TA 公司；F6/10L 便携式高速匀浆机：上海净信实业发展有限公司；SLS-60-70 高压均质机：上海申鹿均质机有限公司；1KA RW 20 数显型顶置式高速搅拌器：广州仪科实验室技术有限公司；5804R 冷冻离心机：德国艾本德公司。
1.3 方法
1.3.1 黑果腺肋花楸汁加工工艺
黑果腺肋花楸冻果→解冻→挑选→打浆→过滤→黑果腺肋花楸汁→备用。
1.3.2 黑果腺肋花楸花生粕乳饮料加工工艺
花生粕用热水浸泡30 min，将花生粕同浸泡的水一起倒入高速匀浆机中打浆得到花生粕乳液，花生粕与水的质量比为1∶12；利用高速搅拌器，用少量水将稳定剂充分溶解，溶解温度为（60±5）℃，搅拌器转速为400 r/min，待稳定剂充分溶解后，一同加入花生粕乳液进行搅拌；再将白砂糖和黑果腺肋花楸汁加入花生粕乳液中，进行缓慢调酸处理，将pH 值调整至3.8～4.0，在60 ℃、30 MPa 条件下进行均质，最后经灌装、排气和杀菌等步骤得到成品。
1.3.3 黑果腺肋花楸花生粕乳饮料配方优化
1.3.3.1 配方单因素试验
基于预试验结果，固定白砂糖添加量9% 和柠檬酸添加量0.20%，考察黑果腺肋花楸汁添加量（7%、10%、13%、16%、19%）对感官评分的影响；固定黑果腺肋花楸汁添加量13%和柠檬酸添加量0.20%，考察白砂糖添加量（7%、8%、9%、10%、11%）对感官评分的影响；固定黑果腺肋花楸汁添加量13%和白砂糖添加量9%，考察柠檬酸添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）对感官评分的影响。
1.3.3.2 配方正交试验
在单因素试验的基础上，对黑果腺肋花楸汁、白砂糖和柠檬酸添加量在3 个水平进行优化试验，设计L9（34）正交试验，因素与水平如表1 所示。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平1 2 3因素A 黑果腺肋花楸汁添加量/%10 13 16 B 白砂糖添加量/%8 9 10 C 柠檬酸添加量/%0.15 0.20 0.25
1.3.4 黑果腺肋花楸花生粕乳饮料稳定剂的确定
1.3.4.1 单因素试验
分别向复合乳饮料中添加质量分数为0.00%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.70% 的CMC、海藻酸钠和阿拉伯胶，考察单一稳定剂添加量对复合乳饮料稳定性的影响，以常温放置1 d 后复合乳饮料的离心沉淀率作为衡量稳定性的指标，进行3 次平行试验。
1.3.4.2 响应面试验设计
结合单因素最优结果，根据Box-Behnken 试验设计原理，选取CMC、海藻酸钠、阿拉伯胶添加量进行三因素三水平的响应面试验，以乳饮料离心沉淀率为响应值，试验因素与水平设计见表2。
表2 Box-Behnken 试验设计因素水平
Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken experiment design
水平-1 0 1因素A CMC 添加量/%0.13 0.20 0.27 B 海藻酸钠添加量/%0.13 0.20 0.27 C 阿拉伯胶添加量/%0.10 0.15 0.20
1.3.5 感官评定
参考马永轩等[18]的方法，对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料样品进行随机编号，邀请10 名具有饮料评定相关经验的品评员，对乳饮料的色泽、香气、口感和组织状态进行感官评定，各评价指标的平均分加和即为本产品最终的感官评分，评价标准如表3 所示。
表3 黑果腺肋花楸花生粕复合乳饮料感官评定标准
Table 3 Sensory evaluation table of peanut meal composite milk beverage of Aronia melanocarpa
色泽（10 分）色泽均匀，呈乳粉色（7～10）色泽较为均匀，颜色较暗（4～＜7）色泽不均，粉白色相间（0～＜4）香气（30 分）具有花生和花楸特有的清香气味（20～30）香气不够柔和，过浓或过淡（10～＜20）香气不协调，有异味产生（0～＜10）口感（30 分）花生花楸滋味柔和，酸甜适宜，层次感丰富（20～30）花生花楸滋味较为柔和，酸甜较为适宜，层次感一般（10～＜20）花生黑果腺肋花楸滋味不协调，层次感差（0～＜10）组织状态（30 分）体系均匀，无分层、无沉淀、脂肪上浮现象（20～30）体系均匀，轻微分层、稍有沉淀及脂肪上浮现象（10～＜20）体系不均匀，出现分层、沉淀及脂肪上浮现象（0～＜10）
1.3.6 离心沉淀率测定
取25 mL 复合乳饮料样品（记作W1，g）于离心管中，6 000 r/min 下离心10 min，静置5 min，弃上清液取沉淀，将沉淀烘干至恒重后称重（记作W0，g）。每个样品进行3 次平行试验取平均值，根据式（1）计算其离心沉淀率（S，%）。
1.3.7 粒径大小及分布测定
利用激光粒度分析仪测定3 种单一稳定剂和复配稳定剂对复合乳饮料粒径大小及分布的影响。具体参数：分散剂为去离子水，分析模式为通用，样品折射率为1.596，介质折射率为1.333。
1.3.8 流变学性质的测定
在25 ℃的温度下，剪切速率范围为0.1～500 s-1，考察3 种单一稳定剂和复配稳定剂对复配乳饮料表观黏度大小和变化的影响。
1.4 数据处理
所有试验进行3 次重复，IBM SPSS 19.0 软件用于方差分析，采用Origin 2019b 软件对数据进行绘图处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 黑果腺肋花楸汁添加量对乳饮料感官评分的影响
黑果腺肋花楸汁添加量对乳饮料感官评分的影响见图1。
图1 黑果腺肋花楸汁添加量对感官评分的影响
Fig.1 Effect of Aronia melanocarpa juice addition level on sensory score
如图1 所示，黑果腺肋花楸汁直接影响了乳饮料的口感和色泽，对感官评分有较大影响。黑果腺肋花楸汁添加量为7%时，感官评分为74.2，此时花生香气浓郁，乳饮料口感较为厚重，掩盖了黑果腺肋花楸独有的清香气味；添加量为13%时，感官评分达到最高，为84.1，进一步添加黑果腺肋花楸汁会导致酸涩味加重，乳饮料风味失衡。因此，选择黑果腺肋花楸汁添加量为10%、13%、16%进行后续试验。
2.1.2 白砂糖添加量对乳饮料感官评分的影响
白砂糖添加量对乳饮料感官评分的影响见图2。
图2 白砂糖添加量对感官评分的影响
Fig.2 Effect of white sugar addition level on sensory score
由图2 可知，白砂糖作为甜味剂直接影响了乳饮料的酸甜度。白砂糖添加量在7%～9% 时，感官评分随着白砂糖添加量增加逐渐增大，黑果腺肋花楸中的涩味逐渐被掩盖；白砂糖添加量为9%时，乳饮料酸甜适宜，感官评分达到最高，为84.4；白砂糖添加量大于9%时，甜味过重逐渐掩盖乳饮料风味，使得感官评分持续降低。因此，选择白砂糖添加量为8%、9%、10%进行后续试验。
2.1.3 柠檬酸添加量对乳饮料感官评分的影响
柠檬酸添加量对乳饮料感官评分的影响见图3。由图3 可知，柠檬酸是一种常用的食品酸味剂，口感较为温和。柠檬酸添加量低于0.20%时，乳饮料酸甜比不协调；添加量为0.20%时，产品感官评分最高，为84.8，此时柠檬酸的酸味与乳饮料的甜味刚好中和，口感达到最佳状态；添加量高于0.20%时，酸味过重掩盖住了乳饮料的甜味和花楸特有的涩味。因此，选择柠檬酸添加量为0.15%、0.20%、0.25%进行后续试验。
图3 柠檬酸添加量对感官评分的影响
Fig.3 Effect of citric acid addition level on sensory score
2.2 黑果腺肋花楸花生粕乳饮料正交试验结果分析
黑果腺肋花楸花生粕乳饮料的正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。
表4 黑果腺肋花楸花生粕乳饮料配方正交试验结果
Table 4 Orthogonal test results of peanut meal composite milk beverage of Aronia melanocarpa
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R因素水平A 黑果腺肋花楸汁添加量1 1 1 2 2 2 3 3 3 79.20 86.17 85.47 6.97 B 白砂糖添加量1 2 3 1 2 3 1 2 3 84.13 86.87 79.83 7.04 C 柠檬酸添加量1 2 3 2 3 1 3 1 2 81.23 84.37 85.23 4.00 D 空列1 2 3 3 1 2 2 3 1 83.77 83.70 83.37 0.40感官评分77.50 83.30 76.80 87.20 91.20 80.10 87.70 86.10 82.60
表5 正交试验结果的方差分析
Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiment results
注：**表示影响极显著，P＜0.01；*表示影响显著，P＜0.05。
方差来源A B C误差总和离差平方和88.295 75.428 26.568 0.275 190.569自由度2 2 2 2 8均方44.15 37.71 13.28 0.14 F 值320.43**273.73**96.42*1.00
由表4 极差分析可知，3 个因素对感官评分影响从大到小为白砂糖添加量＞黑果腺肋花楸汁添加量＞柠檬酸添加量；可知配方最佳组合为A2B2C3，即黑果腺肋花楸汁添加量为13%，白砂糖添加量为9%，柠檬酸添加量为0.25%，乳饮料的其他成分为花生粕乳液，即以77.75% 花生粕乳液、13% 黑果腺肋花楸汁、9% 白砂糖和0.25%柠檬酸调配而成的乳饮料口感最优。表5 方差结果表明，黑果腺肋花楸汁添加量和白砂糖添加量对乳饮料感官评分影响极显著（P＜0.01），柠檬酸添加量影响显著（P＜0.05）。将最优组合A2B2C3 进行3 组平行验证试验，乳饮料平均感官评分为92.67。
2.3 单一稳定剂对复合乳饮料稳定性的影响
黑果腺肋花楸花生粕乳饮料中含有较多的花生蛋白，热杀菌后易会出现絮凝和分层。CMC、海藻酸钠和阿拉伯胶等亲水胶体一方面通过提高乳饮料体系黏度来提高乳饮料稳定性，另一方面通过与花生蛋白发生相互作用来稳定乳饮料[19-20]。通过添加复配稳定剂，可利用各稳定剂之间的协同作用来使稳定剂更好地发挥作用[21-22]。
单一稳定剂对复合乳饮料稳定性的影响见图4。
图4 单一稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料稳定性的影响
Fig.4 Effect of single stabilizer on the stability of peanut meal composite milk beverage of Aronia melanocarpa
由图4 可知，当CMC 和海藻酸钠添加量为0.10%和0.20% 时，乳饮料有明显的絮凝和分层现象，当CMC 和海藻酸钠添加量在0.30%～0.70%时，乳饮料状态稳定均一；当阿拉伯胶添加量为0.10%时，乳饮料有明显的浆液分层现象，阿拉伯胶添加量在0.20%～0.70% 时，乳饮料稳定不分层，但有轻微的沾壁现象。乳饮料的离心沉淀率越低，其稳定性越高，因此CMC、海藻酸钠、阿拉伯胶的最佳添加量分别为0.40%、0.40% 和0.30%。当稳定剂增加至一定量时，复合乳饮料的离心沉淀率呈现增大的趋势，这是因为乳饮料的平衡体系被打破，稳定剂随着花生蛋白一起絮凝，使得离心沉淀率增加。
2.4 稳定剂复配试验结果分析
2.4.1 Box-Behnken 试验设计
由单因素试验结果可知，CMC、海藻酸钠和阿拉伯胶的最佳添加量分别为0.40%、0.40%、0.30%。由于3 种稳定剂之间复配时存在协同交互作用，因此选取3 种单一稳定剂最佳添加量的1/3、1/2、2/3 作为Box-Behnken 设计的-1、0、1 水平，进行三因素三水平试验设计，优化稳定剂的复配比例，各因素及水平设计和试验结果如表6 所示。
表6 Box-Behnken 试验设计与结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken experimental
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A CMC添加量1 0 0 0-1 0 0-1 1 1 1-1 1 0 0-1 0 B 海藻酸钠添加量0-1 0 0 1 0 1 0-1 1 0 0 0 0 1-1-1 C 阿拉伯胶添量-1-1 0 0 0 0-1 1 0 0 0-1 1 0 1 0 1 Y 离心沉淀率/%0.66 0.73 0.35 0.33 0.38 0.29 0.44 0.78 0.53 0.42 0.34 0.72 0.46 0.31 0.36 0.91 0.69
2.4.2 离心沉淀率拟合模型的建立与分析
离心沉淀率拟合模型的回归方程系数显著性检验见表7。
表7 回归方程系数显著性检验
Table 7 Significance test of regression equation module
注：**表示影响极显著，P＜0.01。
项目模型A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和0.61 0.065 0.20 8.450×10-3 0.044 0.017 4.000×10-4 0.12 0.019 0.11 2.620×10-3 3.000×10-4 2.320×10-3 0.61自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方0.068 0.065 0.20 8.450×10-3 0.044 0.017 4.000×10-4 0.12 0.019 0.11 3.743×10-4 1.000×10-4 5.800×10-4 F 值180.56 173.13 530.21 22.58 117.82 45.15 1.07 317.51 52.02 298.89 0.17 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.002 1＜0.000 1 0.000 3 0.335 6＜0.000 1 0.000 2＜0.000 1 0.909 8显著性******************
应用Design-Expert 8.0.6 进行二次多项回归拟合，得到离心沉淀率随CMC、海藻酸钠和阿拉伯胶添加量因素变化的三元二次回归方程：Y=4.74-16.50A-11.66B-15.92C+21.43AB-18.57AC-2.85BC+34.29A2+13.88B2+65.20C2。由表7 可知，回归模型具有高度的显著性（P＜0.000 1），且失拟项不显著（P＞0.05），表明无需引入更高次模型和其他变量，该回归方程对试验结果的分析可靠。一次项中CMC（P＜0.000 1）、海藻酸钠（P＜0.000 1）和阿拉伯胶（P=0.002 1）添加量对饮料稳定性有极显著影响，各影响因素主次为海藻酸钠添加量＞CMC 添加量＞阿拉伯胶添加量。其中CMC 添加量和海藻酸钠添加量、CMC 添加量和阿拉伯胶添加量之间的交互作用极显著（P＜0.01），海藻酸钠和阿拉伯胶之间的交互作用不显著（P=0.335 6）。
2.4.3 响应面交互作用分析
响应面交互作用分析见图5 和图6。
图5 CMC 和海藻酸钠交互作用对乳饮料稳定性影响的响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour of interaction between CMC and sodium alginate on stability of milk beverage
图6 CMC 和阿拉伯胶交互作用对乳饮料稳定性影响的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface and contour of interaction between CMC and arabic gum on stability of milk beverage
由图5 和图6 可知，CMC 添加量及海藻酸钠添加量等高线近似于椭圆形，说明CMC 添加量和海藻酸钠添加量的交互作用极显著，是影响乳饮料离心沉淀率的主要因素；CMC 添加量及阿拉伯胶添加量等高线近似于圆形，说明CMC 添加量及阿拉伯胶添加量的交互作用相较于CMC 添加量和海藻酸钠添加量的交互作用影响较小。
根据Design-Expert 分析得到的回归方程求解极小值，得出CMC、海藻酸钠、阿拉伯胶的添加量分别为0.19%、0.27%、0.15%，乳饮料离心沉淀率最小，为0.24%，稳定性良好。为验证回归模型的真实性，在此条件下进行3 次验证试验，得到离心沉淀率为0.26%，与理论预测值相比相对误差较小，证明Box-Behnken设计得到的降低黑果腺肋花楸花生粕乳饮料离心沉淀率的复配稳定剂添加方案比较可靠准确，对实际工业化应用具有指导意义。
2.5 不同稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料粒径大小及分布的影响
不同稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料粒径大小及分布影响见图7。
图7 不同稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料粒径分布的影响
Fig.7 Effect of different stabilizers on the particle size distribution of peanut meal composite milk beverage of Aronia melanocarpa
由斯托克斯定律可知，当固体小球在流体中运动速度很小时，其受到的黏性阻力与小球的半径成正比，乳饮料中的颗粒受到的黏性阻力越大其沉降速度越慢[23]。因此乳饮料粒径大小及分布与乳饮料的稳定性直接相关，可以直观预测乳饮料絮凝和分层等不稳定现象的发生。由图7 可知，添加海藻酸钠的乳饮料粒径分布在2～200µm 之间，粒径较大，说明只添加海藻酸钠的乳饮料不稳定，花生蛋白易发生絮凝现象，海藻酸钠的稳定效果不理想；0.4%CMC 和0.3% 阿拉伯胶出现峰的位置接近，分别在15、20µm 处有一个峰，峰位置相对于0.4% 海藻酸钠均明显左移，说明CMC 和阿拉伯胶的稳定效果显著优于海藻酸钠。且3 种稳定剂的稳定效果依次为CMC＞阿拉伯胶＞海藻酸钠。复配稳定剂组的粒径分布在0.1～80µm，分别在0.4、9µm 处出现两个峰，粒径较少，相比于其他3 组粒径更小且分布范围集中，表明复配稳定剂能够使乳饮料中的花生蛋白稳定，减少聚集现象的发生[24-25]。
2.6 不同稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料表观黏度的影响
不同稳定剂下黑果腺肋花楸花生粕乳饮料表观黏度见图8。
图8 不同稳定剂对黑果腺肋花楸花生粕乳饮料表观黏度的影响
Fig.8 Effect of different stabilizers on the viscosity of peanut meal compound beverage of Aronia melanocarpa
不同稳定剂对乳饮料流变性质的影响与稳定剂自身的性质有关。由图8 可知，乳饮料体系的表观黏度都随着剪切速率的增加而降低，具有明显的剪切稀化特点，这是由于高剪切力作用下，饮料分子间的相互作用被破坏[26-27]。含0.3% 阿拉伯胶的复合乳饮料黏度相较于含0.4%CMC 或0.4% 海藻酸钠的复合乳饮料黏度更大，体现出阿拉伯胶的增稠效果较强，这与乳饮料离心沉淀率的单因素试验结果相一致。由图8 可知，复配稳定剂相对其他3 种单一稳定剂使黑果腺肋花楸花生粕乳饮料黏度更低，避免了乳饮料因为稳定剂过多而变得浓稠，保持了乳饮料清爽的口感。
3 结论
以辽宁地区特色小浆果黑果腺肋花楸和花生油副产物花生粕为原料，通过单因素、正交和响应面试验法，研制出一款果香和乳香浓郁、状态稳定的酸性花生蛋白饮料。通过正交试验法优化影响黑果腺肋花楸花生粕复合乳饮料的3 个因素，得到77.75% 花生粕乳液、13%黑果腺肋花楸汁、9%白砂糖和0.25%柠檬酸进行配比时乳饮料风味最优。通过响应面试验设计法优化了复配稳定剂配方，当CMC、海藻酸钠、阿拉伯胶的添加量分别为0.19%、0.27%和0.15%时，产品沉淀率最小值为0.24%。由粒径测定结果可知，CMC 和海藻酸钠的粒径相比阿拉伯胶较小，分别在15、20µm处有一个峰，CMC 和海藻酸钠的稳定性优于阿拉伯胶；复配组分别在0.4、9µm 处出现两个峰，且粒径较小分布在0.1～80µm，复配稳定剂对乳饮料的稳定效果优于单体稳定剂。流变结果表明阿拉伯胶的增稠效果最好，此外复合乳饮料体系具有明显的剪切稀化现象，复配稳定剂使乳饮料稳定性最优的同时可使乳饮料黏度更低，从而使乳饮料呈现出更加清爽的口感。
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