硒（Se）是一种必需的微量元素，具有抗氧化、抗肿瘤等功效，并对一些重金属离子有解毒作用[1]。研究表明，硒元素的形态与其在人体内的代谢、吸收以及生物功效的发挥存在紧密联系[2]。无机硒的生物利用率低，毒性大；有机硒毒性较无机硒小，具有高度的生物可利用性和无害性，能满足人体的营养需求，并能与功能性大分子物质结合，在抗肿瘤、抗氧化等生物活性方面产生协同效应[3]。但有机硒制作合成难、自然资源中分布不均、消耗量大，因此，近年来研究热点转为微生物的硒生物转化作用[4]。微生物制造有机硒可以通过生物转化作用利用无机硒合成有机硒[5]。其中乳酸菌作为益生菌被广泛使用在硒元素的转化和富集方面[6-7]。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是将碳水化合物发酵形成乳酸的革兰氏阳性菌[8]，其生长过程中会产生胞外多糖、酸以及氨基酸等代谢物质，这些物质具有维持肠道菌群平衡、抑菌、增强免疫力等功效[9]。研究表明，无机硒能通过乳酸菌体内的生物学作用转化为有机硒[10-11]。此外，富硒后的乳酸菌具有抗氧化、抗突变和抗癌等多种生物活性[12]。来源于水产动物肠道中的乳酸菌可在肠道中定殖，维持肠道菌群平衡，并维持氧化还原平衡，同时还可抑制致病菌[13]。因此，源于水产动物肠道的乳酸菌作为合成有机硒的一个新型来源，其潜在价值非常可观[14]。
本研究通过生长曲线、菌体颜色以及分光光度法，筛选水产动物肠道中具有富硒能力的乳酸菌，并比较分析不同富硒率乳酸菌的抗氧化能力、胆盐耐受力、抑菌活性以及对Caco-2 细胞黏附能力的差异，探究硒对乳酸菌生物特性的影响，以期为研发富硒乳酸菌生物制剂或发酵食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
1.1.1 菌株和细胞
乳酸菌菌株（ZHL-1、ZHL-2、ZHL-3、ZHL-4、ZHL-5、ZHS-1、ZHS-2、ZHS-3）：8 株乳酸菌菌株分离自花鲢鱼（ZHL）和海参（ZHS）肠道，均由渤海大学微生物实验室保藏。致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）：保藏于渤海大学微生物实验室。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）：北纳创联生物科技有限公司；Caco-2 细胞：北京协和细胞资源中心。
1.1.2 培养基和试剂
MRS 固体培养基、MRS 肉汤、LB 固体培养基、LB肉汤：青岛海博生物技术有限公司；Taq PCR Master mix、细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物、DNA marker-D、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）试剂（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；邻苯三酚、3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）、亚硒酸钠（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCL]（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；DMEM 培养基：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 试验仪器
GI54DS 立式高压蒸汽灭菌锅：致微科技（北京）有限公司；DL-CJ-2N 超级洁净工作台：北京中西远大科技有限公司；Imark 酶标仪：浙江浙科仪器设备有限公司；BMM-480YS 生物显微镜：上海光学仪器厂；DYY-8C 电泳仪：浙江明德仪器有限公司；ABI stepone plus PCR 仪：德国Eppendorf 公司；Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪：上海谓载商贸发展有限公司；SCIENTZ-ⅡD 超声细胞破碎机：南北仪器有限公司；UV2550 紫外可见分光光度计：北京京科瑞达科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 富硒乳酸菌生长曲线的测定
将-80 ℃保存的乳酸菌接种于MRS 肉汤中，37 ℃下静置培养24 h，将培养至第2 代的乳酸菌按体积分数2.0% 接种于MRS 肉汤中，使用全自动生长曲线分析仪在OD600 nm 下每隔2 h 测定菌密度，确定各菌株的生长情况。
1.3.2 适宜硒质量浓度的确定
以2%的接种量将对数生长期的乳酸菌分别加入到含亚硒酸钠质量浓度为0、20、40、60、80、100µg/mL的MRS 肉汤，于37 ℃培养至稳定期，观察菌体颜色发生的变化，确定适宜的硒质量浓度。
1.3.3 残留无机硒含量的测定
1.3.3.1 标准溶液曲线的绘制
参考白芳芳等[15]的方法进行标准曲线测定。
1.3.3.2 硒含量的测定
参考杨靖鹏等[16]的方法并稍作修改。乳酸菌以体积分数2% 接种到适宜硒质量浓度的MRS 肉汤中，37 ℃培养至其稳定期，5 500 r/min 离心10 min，取上清液10 mL，后续步骤与制作标准曲线相同，根据标准曲线计算上清液中的硒含量，即残留无机硒量。根据公式（1）计算富硒率（F，%）。
式中：S1 为总硒量，µg；S2 为残留无机硒含量，µg。
1.3.4 乳酸菌菌株的鉴定
形态学：将乳酸菌菌株革兰氏染色并在显微镜下进行形态学观察[17]。
生理生化：根据凌代文等[18]的方法对菌株进行生理生化鉴定。
生物信息学分析：参考崔天琦等[19]的方法进行生物信息学分析，并利用MEGA5.0 构建系统发育进化树。
1.3.5 富硒乳酸菌抗氧化活性测定
将培养好的富硒乳酸菌菌悬液于4 ℃下6 000 r/min离心15 min 后，菌体用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤两次后重悬，调节菌液终浓度为108 CFU/mL，一部分作为乳酸菌完整细胞，另一部分菌悬液于冰浴下超声破碎（变幅杆：φ6、超声开1 s 关2 s、功率33%、15 min），离心（8 000 r/min，10 min）得上清液，即为乳酸菌破碎细胞。以未加硒MRS 培养的乳酸菌为对照组。抗氧化分析中样品均为乳酸菌完整细胞或破碎细胞。
1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力
取1.0 mL 样品加入0.2 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液1.0 mL，暗处反应（室温下）30 min 后3 000 r/min离心15 min，取上清液，于517 nm 测定其吸光度，以鼠李糖乳杆菌（LGG）为阳性对照[20]。DPPH 自由基清除率（D，%）按公式（2）计算。
式中：Ai 为样品添加DPPH-无水乙醇的吸光度；Aj为样品添加PBS 的吸光度；Ac 为PBS 添加DPPH-无水乙醇的吸光度。
1.3.5.2 超氧阴离子自由基清除能力
取2.0 mL Tris-HCl 缓冲液加入0.6 mL 样品，在25 ℃下水浴预热，再加入0.4 mL 邻苯三酚（25 ℃预热），在25 ℃下水浴20 min，于325 nm 测定吸光度，以LGG 为阳性对照[21]。超氧阴离子自由基清除率（C，%）按公式（3）计算。
式中：A11 为含样品和邻苯三酚的吸光度；A10 为含样品的吸光度，邻苯三酚以蒸馏水代替；A01 为不含样品含邻苯三酚的吸光度；A00 为不含样品不含邻苯三酚的吸光度。
1.3.6 富硒乳酸菌的胆盐耐受性
富硒乳酸菌以体积分数2%分别接种于含牛胆盐质量分数为0.0%、0.2%、0.3% 的MRS 肉汤中，置于37 ℃培养至对数后期，于600 nm 下测定吸光度，以未加硒MRS 培养的乳酸菌为对照组。胆盐耐受力（T，%）按公式（4）计算[16]。
式中：Oi 为含胆盐的培养基吸光度；On 为不含胆盐的培养基吸光度。
1.3.7 富硒乳酸菌的抗菌活性
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按体积分数2%分别接种于LB 肉汤中，37 ℃恒温培养至对数后期。参照Tarannum 等[22]的牛津杯打孔法测定富硒乳酸菌对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抗菌活性。
1.3.8 富硒乳酸菌的细胞黏附性
乳酸菌菌悬液的制备：将富硒乳酸菌（OD600 nm=1.0）离心（8 000 r/min，10 min）收集菌体，采用无菌PBS洗涤3 次后，用不含血清的DMEM 培养基重悬[23]，以LGG 作为阳性对照。参照张汝京等[23]的方法进行细胞黏附研究，在24 孔板中预先放入8 mm×8 mm 的载玻片，将Caco-2 细胞调整至2×104 个/mL，并接种至24 孔板中使其贴壁生长，至细胞长成单层后，以无菌PBS 洗涤2 次，每孔加入0.5 mL DMEM 和0.5 mL 预先制备好的乳酸菌菌液继续培养1 h。用无菌PBS 洗涤3 次，除去未黏附的乳酸菌，加入甲醛固定20 min，对载玻片进行革兰氏染色，光学显微镜下随机取20 个视野，观察并计算乳酸菌黏附数。
1.4 数据处理
采用IBM SPSS 23 软件进行单因素分析、Origin-Pro 9.1 软件进行绘图，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05 时表示差异显著。
2 结果与讨论
2.1 乳酸菌生长曲线及加硒时间的确定
乳酸菌在对数期生长代谢旺盛，富硒能力强并且有机硒转化率高，而加硒时间越早对菌体生长抑制越强，不利于硒的转化，因此，需依据菌株生长曲线确定菌株的适宜加硒时间[16，24]。生长曲线如图1 所示。
图1 乳酸菌的生长曲线
Fig.1 Growth curves of LAB
由图1 可知，菌株ZHL-2、ZHL-3、ZHL-5、ZHS-2、ZHS-3 在培养2 h 后进入对数期，菌株ZHL-1、ZHL-4、ZHS-1 在培养4 h 后进入对数期。根据不同菌株的生长曲线，确定菌株ZHL-2、ZHL-3、ZHL-5、ZHS-2、ZHS-3的加硒时间为2 h，菌株ZHL-1、ZHL-4、ZHS-1 的加硒时间为4 h。
2.2 亚硒酸钠质量浓度的确定
亚硒酸钠质量浓度的增加会使乳酸菌菌体颜色变红，富硒率一定时，富硒总量不变，转化出的单质硒越多，菌体自身合成有机硒越少，从益生角度考虑，应选择菌体为粉红色时的浓度为富硒的最佳亚硒酸钠质量浓度[16]。因此，本研究选择粉红色对应的亚硒酸钠质量浓度为适宜亚硒酸钠质量浓度，结果如表1 所示。
表1 乳酸菌在不同浓度亚硒酸钠下培养24 h 后颜色变化
Table 1 Change in color of LAB after cultivation 24 h in sodium selenite with different concentrations
注：-为正常；+为微红；++为粉红；+++为红；++++为深红。
菌株编号ZHL-1 ZHL-2 ZHL-3 ZHL-4 ZHL-5 ZHS-1 ZHS-2 ZHS-3亚硒酸钠质量浓度/（µg/mL）0--------20+--++++++++40+++++++++++++++60+++++++++++++++++++80++++++++++++++++++++++100++++++++++++++++++++++++++
由表1 可知，菌株ZHL-4、ZHL-5、ZHS-3 的适宜亚硒酸钠浓度为20 µg/mL；菌株ZHL-1、ZHL-3、ZHS-1、ZHS-2 的适宜亚硒酸钠浓度为40 µg/mL；菌株ZHL-2的适宜亚硒酸钠浓度为60µg/mL。
2.3 富硒率的测定
硒含量标准曲线和8 株乳酸菌的富硒率如图2所示。
图2 硒含量标准曲线和乳酸菌的富硒率
Fig.2 Standard curve of selenium content and selenium-rich rate of LAB
由图2 可知，8 株乳酸菌均具有一定的富硒能力，且菌株ZHL-2 与其他菌株富硒能力存在显著性差异（P＜0.05）。菌株ZHL-2 的富硒能力显著高于其他菌株，富硒率达85.46%，菌株ZHL-5 的富硒能力较低，显著低于其他菌株，富硒率为67.78%。因此，后续选择富硒率较高的菌株ZHL-2 为研究对象并探究其体外生物活性。
2.4 菌株鉴定
乳酸菌ZHL-2 的菌落形态和革兰氏染色结果如图3 所示，生理生化鉴定结果如表2 所示。
表2 乳酸菌ZHL-2 的生理生化鉴定结果
Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain ZHL-2
注：+表示阳性；-表示阴性。
项目纤维二糖麦芽糖葡萄糖酸盐果糖木糖结果+ + - + +项目葡萄糖阿拉伯糖棉籽糖松三糖肉汤七叶灵结果+ + + - +项目蔗糖甘露糖甘露醇鼠李糖结果+ + - -项目乳糖山梨醇密二糖肉汤半乳糖结果+ - + -
图3 菌株ZHL-2 的菌落形态和革兰氏染色图
Fig.3 Colony morphology and Gram stain of strain ZHL-2
由图3 可知，菌株ZHL-2 菌落呈圆形、乳白色、不透明、光滑、周围有溶钙圈，且革兰氏染色呈阳性，结合表2 的生理生化鉴定结果，初步判定菌株ZHL-2 为植物乳杆菌。
菌株ZHL-2 的电泳图及系统发育树如图4 所示。
图4 菌株ZHL-2 的16S rRNA 基因扩增电泳图和系统发育树
Fig.4 16S rRNA gene amplification electrophoresis diagram and phylogenetic tree of strain ZHL-2
由图4a 可知，扩增片段在1 500 bp 左右，表明菌株ZHL-2 片段扩增成功。由图4b 可以看出菌株ZHL-2 与植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）G2-6-8最相似，相似度达到99%，因此，菌株ZHL-2 被鉴定为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）。
2.5 乳酸菌菌株富硒前后的抗氧化活性
乳酸菌菌株ZHL-2 富硒前后DPPH 自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力如图5 所示。
图5 乳酸菌菌株富硒前后的抗氧化能力
Fig.5 Antioxidant capacity of LAB before and after selenium enrichment
由图5a 可知，与乳酸菌破碎细胞相比，乳酸菌的完整细胞DPPH 自由基清除率均较高，这可能是因为乳酸菌的胞外活性物质（如胞外多糖、表面蛋白等）具有清除DPPH 自由基的作用[25]。与菌株LGG 相比，未富硒植物乳杆菌ZHL-2 的破碎细胞DPPH 自由基清除率变化不显著，但富硒后植物乳杆菌ZHL-2 的破碎细胞DPPH 自由基清除率显著提高。与菌株ZHL-5相比，植物乳杆菌ZHL-2 富硒前后DPPH 自由基（完整细胞和破碎细胞）的清除率分别提高了5.00%、2.67%、6.67%、5.00%。同时，与未富硒的植物乳杆菌ZHL-2 相比，富硒后植物乳杆菌ZHL-2 对清除DPPH自由基（完整细胞和破碎细胞）的能力显著提高，分别提高了3.67% 和3.67%。结果表明，富硒能提高乳酸菌对DPPH 自由基的清除能力。这与韦梦婷等[4]的研究结果相似，富硒可以使乳酸菌DPPH 自由基清除率提高13.78%，从而提高其抗氧化能力。
由图5b 可知，与乳酸菌的破碎细胞相比，乳酸菌的完整细胞超氧阴离子自由基清除率均较低，这可能是因为大部分的抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）均存在于细胞内[26-27]。与菌株LGG相比，富硒前后植物乳杆菌ZHL-2 的破碎细胞超氧阴离子自由基清除率变化显著。与菌株ZHL-5 相比，植物乳杆菌ZHL-2 富硒前后超氧阴离子自由基（完整细胞和破碎细胞）清除率分别提高了16.67%、28.67%、25.33%、28.00%。同时，与未富硒的植物乳杆菌ZHL-2相比，富硒后植物乳杆菌ZHL-2 对超氧阴离子自由基（完整细胞和破碎细胞）的清除率分别提高11.67%和11.00%。结果表明，富硒能提高乳酸菌对超氧阴离子自由基的清除能力。这与金子灿[26]的研究结果相似，富硒后可以使糙小米超氧阴离子自由基清除能力提高3.23%，从而提高其抗氧化能力。
2.6 胆盐耐受能力和抗菌活性
研究发现所有菌株在0.3% 胆盐中生长微弱，因此，选择0.2%胆盐浓度作为处理浓度。乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果以及对猪胆盐的胆盐耐受能力如表3 所示。
表3 乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果及其胆盐耐受能力
Table 3 Inhibitory effect of LAB on Staphylococcus aureus and Escherichia coli and its bile salt resistance
注：不同小写字母表示同一指标差异显著（P＜0.05）。
菌株编号ZHL-2 ZHL-5金黄色葡萄球菌抑菌圈直径/mm对照组10.33±0.06c 10.15±0.04c富硒组13.22±0.12a 11.61±0.09b大肠杆菌抑菌圈直径/mm对照组13.03±0.01c 10.50±0.05d富硒组14.17±0.07a 13.15±0.06b胆盐耐受能力/%对照组68.92±2.42b 47.31±0.93d富硒组75.46±1.19a 52.91±0.92c
由表3 可知，富硒后乳酸菌的胆盐耐受能力和抗菌活性显著提高。富硒后植物乳杆菌ZHL-2 的胆盐耐受能力提高了6.54%，且植物乳杆菌ZHL-2 富硒前和富硒后的胆盐耐受能力显著高于菌株ZHL-5，胆盐耐受能力分别提高了21.61%和22.55%。富硒后植物乳杆菌ZHL-2 对致病菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌圈直径分别增加了1.14 mm 和2.89 mm。说明乳酸菌富硒后，能增强其对致病菌的抑制能力及提高对胆盐的耐受能力。与杨靖鹏等[16]的研究结果相似，菌株WY1 富硒后对胆盐的耐受能力提高了16.87%。
2.7 乳酸菌对Caco-2 细胞黏附性的测定
黏附是微生物与宿主相互作用的先决条件之一，乳酸菌的益生作用是建立在其代谢活性及其与宿主肠道细胞较长时间的紧密接触[28]。乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附性如图6 所示。
图6 乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附性
Fig.6 Adhesion of LAB to Caco-2 cells
由图6 可知，乳酸菌LGG、ZHL-2 和ZHL-5 富硒前后对Caco-2 细胞均具有一定的黏附性。与菌株LGG 相比，未富硒的植物乳杆菌ZHL-2 黏附数增加了4.66 CFU/个。与菌株ZHL-5 富硒前后相比，植物乳杆菌ZHL-2 富硒前后的黏附数分别增加了16.00、18.00 CFU/个。与富硒前的菌株ZHL-2 相比，富硒后菌株ZHL-2 黏附数增加了7.34 CFU/个。因此，表明植物乳杆菌ZHL-2 具有较好的黏附性，富硒后其黏附性也显著提高，说明富硒能够提高乳酸菌对细胞的黏附能力。Liu 等[29]研究了硬膜肠球菌A8-1 及富硒后的硬膜肠球菌A8-1-Se 对沙门寒氏菌处理后的细胞完整性的保护作用，与A8-1 处理组相比，A8-1-Se 处理组具有更强保护细胞完整性的作用。
3 结论
由水产动物肠道中筛选获得1 株富硒率较高的植物乳杆菌ZHL-2，富硒率达85.46%。经体外生物活性分析结果表明，与未富硒菌株ZHL-2 相比，富硒后菌株ZHL-2 完整细胞和破碎细胞清除DPPH 自由基和超氧阴离子的能力分别提高3.67%、3.67%、11.67%、11.00%；对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别增加了1.14 mm 和2.89 mm；胆盐耐受能力以及对Caco-2 细胞的黏附数分别增加6.54% 和7.34 CFU/个。本研究为开发富硒乳酸菌生物制剂或发酵食品提供了理论基础。
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