核桃中含有不饱和脂肪酸、蛋白质、膳食纤维、维生素E 等，是优质的植物蛋白。我国核桃的栽培历史悠久，多种植于西南及西北地区。
随着健康膳食热潮的出现，核桃蛋白因其氨基酸种类齐全，比例较均衡，在食品领域中具有广泛的应用前景。核桃油市场发展迅速，在核桃油的生产过程中会产生大量核桃粕，这些加工副产品中含有40%～50%的蛋白质[1]。但核桃蛋白中谷蛋白所占比例高达70%[2]，导致其蛋白溶解性较差，从而限制了核桃粕在食品加工中的应用与研发，导致大部分核桃粕被丢弃或仅作饲料及堆肥用，造成极大的资源浪费。
通过一定的技术手段可以提高核桃蛋白溶解性，超声具有简易、高效等优势，已被广泛应用于食品加工行业[3]。超声由于其空化和微流作用[4]，已在改善鹰嘴豆蛋白乳化性[5]、增强花生蛋白的溶解性[6]等方面进行了应用。超声处理能增强大豆分离蛋白的持水能力和凝胶强度，也归因于超声诱导的结构变化[7]。目前，国内外超声修饰植物蛋白结构的研究较多，而超声处理对核桃蛋白影响的研究较少。
本研究以核桃粕为原料，通过超声直接作用于碱溶酸沉法提取的核桃分离蛋白，分析不同超声功率对其结构、功能特性的影响，以期有效提高核桃粕资源利用率，为核桃加工提供一定的理论依据、为核桃蛋白的加工应用提供理论参考，从而扩大其在食品领域的应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆油：益海嘉里食品营销有限公司；核桃粕：新疆和田果之初食品股份有限公司；盐酸：四川西陇化工有限公司；考马斯亮蓝（G250）：天津市光复精细化工研究所；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（trometamol，Tris）：北京百达科技有限公司；甘氨酸：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津永晟精细化工有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）：上海麦克林生化科技有限公司；蛋白分子量标准（12～120 kDa）：北京全式金生物技术股份有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
自动凯氏定氮仪（K9840）：海能未来技术集团股份有限公司；冷冻干燥机（Pilot3-6M）：博医康（北京）仪器有限公司；超声细胞粉碎仪（JY92-D）：宁波新芝生物科技股份有限公司；高速离心机（TGL-20B）：上海安亭科学仪器厂；纳米粒度及ZETA 电位分析仪（ZSE）：上海思百吉仪器系统有限公司；荧光光度计（Lumina）：上海君翼仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 核桃粕脱脂粉的制备
将核桃粕粉碎并过60 目筛后于50 ℃干燥箱中干燥24 h，以石油醚为介质采用索氏抽提法脱脂，挥干溶剂，置于冰箱冷藏备用[8]。
1.3.2 核桃分离蛋白的提取
采取碱溶酸沉法，参考毛晓英[9]的方法略作修改。核桃粕脱脂粉按照料液比1∶10（g/mL）用70%乙醇溶液醇洗1 h，挥干溶剂，样品以1∶26（质量比）加入去离子水，调节溶液的pH 值为11.0，在53 ℃下磁力搅拌1.5 h，25 ℃7 000 r/min 离心15 min，收集清液，调整上清液pH 值至4.5，磁力搅拌1 h，25 ℃7 000 r/min 离心15 min，收集沉淀，用NaOH 中和至中性，冻干得到核桃分离蛋白。
1.3.3 核桃分离蛋白蛋白质含量测定
蛋白质含量的测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[10]中的凯氏定氮法，根据附录（常见食物中的氮折算成蛋白质的折算系数）得到核桃蛋白质的转换系数为5.3。
1.3.4 超声处理核桃蛋白样品
称取上述核桃分离蛋白0.5 g 于烧杯中，加入50 mL 0.02 mol/L、pH8.0 的磷酸盐缓冲液，混匀后用1 mol/L的NaOH 和HCl 将pH 值调至8.0，并于室温下磁力搅拌1 h，得浓度为1%的核桃分离蛋白溶液。采用不同超声功率（200、400、600、800 W）处理10 min（＜30 ℃），每超声5 s 间歇5 s，得到对照组（未进行超声处理）及不同超声功率处理过的蛋白溶液。4 ℃下保存备用，48 h 内进行后续分析。
1.3.5 核桃蛋白功能性质的测定
1.3.5.1 溶解性
取1.3.4 1% 的核桃分离蛋白在25 ℃、7 000 r/min离心15 min，采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量[11]。
蛋白质的溶解度计算公式如下。
式中：X1 为溶解度，%；M1 为上清液中蛋白质含量，mg/mL；M2 为样品中总蛋白含量，%。
1.3.5.2 乳化性和乳化稳定性
参考文献[12]的方法，并稍作修改。将1.3.4 蛋白溶液用0.02 mol/L、pH8.0 的磷酸盐缓冲溶液稀释至2 mg/mL，取15 mL 稀释后的蛋白溶液于试管中，加入5 mL 大豆油，以10 000 r/min 高速搅拌2 min，从底部快速抽取25µL 样液，加入到5 mL SDS 溶液（0.1%）中，迅速混匀，在500 nm 波长处测定其吸光值，静置10 min 后，再次从底部取样液进行如上操作测定吸光值。
乳化活力指数（emulsification activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsification stability index，ESI）计算公式如下。
式中：X2 为乳化活力指数，m2/g；X3 为乳化稳定性指数；N 为稀释倍数，200；Φ 为油相体积分数，0.25；C为 蛋 白 质 溶 液 浓 度，0.002 g/mL；A0、A10 分 别 为0、10 min 的吸光值。
1.3.5.3 起泡性和起泡稳定性
参考文献[12]的方法，略作修改。取15 mL 1%蛋白溶液于50 mL 试管中，以10 000 r/min 高速搅拌2 min，量筒中溶液和泡沫的总体积记为V1（mL）。静置30 min，再次记下量筒中溶液和泡沫总体积V2（mL）。
起泡性（X4，%）和泡沫稳定性（X5，%）按以下公式计算。
1.3.6 核桃蛋白结构性质的测定
1.3.6.1 粒径和电位
将上述制得的蛋白溶液用磷酸盐缓冲溶液（0.02 mol/L、pH8.0）稀释，使蛋白浓度为0.1 mg/mL，使用纳米粒度及ZETA 电位分析仪测定粒径和电位。
1.3.6.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）
参考康石花[13]的方法，并作适当修改。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，取蛋白溶液（浓度调整为1 mg/mL）与加样缓冲液（0.25 mol/L Tris-HCl、10%SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油、5%β-巯基乙醇）以4∶1（体积比）混合，得到浓度为0.8 mg/mL 的混合液，100 ℃煮沸5 min，冷却至室温。分别取20µL 混合液和10µL 标准蛋白加入凝胶孔中，电压分别设置为40 V 和120 V。电泳完成后用考马斯亮蓝R-250 染色30 min，冰乙酸和甲醇的混合溶液反复进行脱色。
1.3.6.3 游离巯基含量
吸取1 mL 核桃蛋白上清液（1%）、5 mL Tris-Gly 缓冲液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、0.004 mol/L EDTA，去离子水溶解混匀后调pH 值为8.0）于10 mL试管中，再加入0.100 mL Ellman 试剂，迅速漩涡混匀，静置15 min，用分光光度计法在412 nm 测定吸光值。以不含蛋白质的Tris-Gly 缓冲液作为空白对照[14]。巯基含量按下式计算。
式中：X6 为巯基含量，µmol/g；73.53= 106/13 600，13 600 为Ellman 试剂的摩尔消光系数；A412 为412 nm测定吸光值；D 为稀释倍数；C 为蛋白质浓度，mg/mL。
1.3.6.4 内源荧光光谱
用磷酸盐缓冲溶液（0.02 mol/L、pH8.0）将蛋白溶液稀释至0.1 mg/mL，用荧光光度计测定蛋白质的荧光光谱。设置狭缝宽5 nm，扫描速度1 200 nm/min，激发波长290 nm，扫描范围300～400 nm，扫描间隔20 ms，反应时间0.1 s[15]。
1.3.6.5 表面疏水性
将1.3.4 5 组蛋白质溶液用磷酸盐缓冲溶液（0.02 mol/L、pH8.0）分别稀释成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的蛋白质溶液。测定时取2 mL 稀释后的样液，加入10µL、8 mmol/L 的ANS 溶液，混匀后避光静置15 min，用荧光光度计测定荧光强度。设定荧光光度计的激发波长为390 nm，发射波长470 nm，狭缝宽度为5 nm。用核桃蛋白浓度和荧光强度作图，曲线的初始斜率即为表面疏水性（H0）[16]。
1.4 数据处理
所得数据为每个样品3 次平行测定的值，并计算平均值和标准差。采用SPSS 26.0 进行显著性分析（P＜0.05 被认为具有显著差异），用Origin 2019 作图。
2 结果与分析
2.1 不同超声功率对核桃蛋白功能性质的影响
2.1.1 核桃蛋白的溶解性
不同超声功率下WPI 的溶解性见图1。
图1 不同超声功率下WPI 的溶解性
Fig.1 Solubility of WPI at different ultrasonic power
经凯氏定氮测定所提WPI 蛋白含量为80.35%。由于WPI 的特殊组成，导致其水溶性较差，而溶解性又是其他功能性的基础。如图1 所示，未处理的WPI溶解度为43.42%，经过超声处理后，与对照组相比其溶解度有显著性差异（P＜0.05）。600 W 条件下，溶解度最高,达到75.27%。超声功率升至800 W 时，溶解度又再次下降。这是因为超声产生的空化、湍流效应使蛋白粒径减小，并使肽链疏松，一些大的蛋白聚集体伸展开，从而增强了蛋白质的水合作用[17]。但是过高的超声功率使蛋白变性程度加剧，伸展开的蛋白分子重新凝聚，溶解度降低[18]。
3.1.2 核桃蛋白的乳化性及乳化稳定性
不同超声功率对WPI 乳化特性的影响如图2 所示。
图2 不同超声功率对WPI 乳化性、乳化稳定性的影响
Fig.2 Influence of different ultrasonic power on emulsifying properties and emulsion stability of WPI
由图2 可知，在相同超声时间下，随着超声功率的增加，WPI 的乳化特性呈现先增大后减小的趋势。600 W 下超声10 min，乳化活性指数从56.01 m2/g 增长到了82.05 m2/g，这可能是因为超声使蛋白分子表面疏水性增强，水溶性亚基的增多使蛋白能更快地吸附到油水界面[19]。其次，溶解度的增强也有利于提高蛋白的乳化性能，更多的可溶蛋白吸附到油水界面，使乳化性显著增强[20]。同时，与对照组（41.72±1.67）相比，WPI 的ESI 也提高了22.79%。在包中宇[21]采用超声处理大豆蛋白的研究中，其处理后的大豆蛋白乳化性及乳化稳定性也得到显著改善。然而，超声功率800 W 下，WPI 的EAI 和ESI 有所下降，可能是因为过高超声功率使分子再次聚集成不溶性蛋白聚集体，疏水性减小，从而乳化性降低。
2.1.3 核桃蛋白的起泡性及起泡稳定性
不同超声功率对WPI 起泡性、起泡稳定性的影响如图3 所示。
图3 不同超声功率对WPI 起泡性、起泡稳定性的影响
Fig.3 Influence of different ultrasonic power on foaming properties and foaming stability of WPI
由图3 可知，随着超声功率的增加，WPI 的起泡性及起泡稳定性得到改善（P＜0.05），600 W 功率下均达到最高（89.78±1.68）%、（84.93±2.33）%，与对照组相比，起泡能力及起泡稳定性分别提高了1.5 倍和2.5 倍左右，800 W 时略有所下降。蛋白的泡沫性质与溶解度密切相关，经过超声处理后的蛋白结构展开，更加灵活，表面张力的降低使其能更快地吸附到气水界面，从而形成更多泡沫。而起泡稳定性与气泡的排水、聚结、歧化有关，尤其是气液界面的膜相互靠拢聚集得越慢，起泡稳定性越好[22]。但过度的处理也会使蛋白结构松散不稳定，导致泡沫性质有所下降。
2.2 不同超声功率对核桃蛋白结构性质的影响
2.2.1 粒径和电位
不同超声功率对WPI 粒径、电位的影响见图4。
图4 不同超声功率对WPI 粒径、电位的影响
Fig.4 Effects of different ultrasonic power on WPI particle size and electric potential
由图4 可知，超声处理会降低WPI 的平均粒径大小，使表面负电荷增加。蛋白溶液的粒径从（453.50±5.05）nm 降到600 W 超声 处 理10 min 的（183.40±2.54）nm，所有超声处理的电位绝对值也均显著高于未处理组（P＜0.05），其中600 W 处理条件下，WPI 溶液的电位值为（-26.47±0.35）mV。这主要是因为超声产生的空穴效应的影响，溶液内部产生空化气泡，气泡坍塌破裂，从而爆发出强剪切力，使不溶性蛋白聚集体在溶液中分散均匀。超声处理后的WPI 基团电离程度增强，表面负电荷的增多使分子间静电斥力增强，蛋白溶液分散较稳定[14]。
2.2.2 SDS-PAGE
经超声处理后WPI 的还原电泳图谱如图5 所示。
图5 经超声处理后WPI 的还原电泳图谱
Fig.5 Reduced electrophoresis pattern of WPI after ultrasonic treatment
通过分析电泳条带结果可以观察蛋白质亚基组成。由图5 可知，WPI 在20～30 kDa 和30～40 kDa 处具有清晰的条带，在50～80 kDa 范围内的条带较浅。电泳结果表明，超声处理与未超声处理的蛋白其差异不明显，这说明超声没有改变WPI 的亚基，既没有破坏肽键和二硫键，也没有产生新的共价键。这与曹灿[14]的研究结果一致，在大豆分离蛋白的亚基组成分析中也得到证实[23]。
2.2.3 游离巯基含量
不同超声功率下WPI 的游离巯基含量如图6 所示。
图6 不同超声功率下WPI 的游离巯基含量
Fig.6 Content of free sulfhydryl groups in WPI under different ultrasonic powers
巯基含量的变化与蛋白质分子结构的改变有一定相关，巯基可以通过脱氢形成二硫键，蛋白分子间的S—S 被破坏后也会增加游离—SH 的含量。由图6可知，超声处理后，游离巯基含量随功率的升高先增加后又略微减少。一个原因可能是超声使WPI 结构展开，导致折叠隐藏在分子内部的巯基暴露出来，另一原因可能是适当超声处理后蛋白解聚，连接分子的二硫键断裂，导致游离巯基的增多。但有研究表明，超声过程中会产生过氧化氢，氧化游离巯基，使蛋白聚集[14]。在800 W 时巯基含量的下降可能是因为氧化速率大于—SH 暴露速率，从而导致其含量略微降低。
2.2.4 内源荧光光谱
通过测定样品的荧光光谱可以进一步反映蛋白的结构变化。环境极性的变化会使色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基发射的荧光光谱发生变化。这种内源荧光可以表征蛋白质三级结构的相关信息。在290 nm 激发波长下，测得WPI 的发射光谱如图7 所示。
图7 不同超声功率下WPI 的内源荧光强度
Fig.7 Intrinsic fluorescence intensity of WPI at different ultrasonic power
由图7 可知，所有蛋白样品的最大发射波长在335 nm 附近，与对照组相比，超声处理组最大发射波长几乎没有发生变化，但荧光强度均增强。在200～600 W 超声10 min 时，荧光强度随功率的增加而增强，然而功率增加到800 W 时，发色团的荧光强度降低。可能是因为超声处理后蛋白分子结构展开，内部疏水基团的暴露使微环境非极性增强，从而使荧光强度增加。但超声强度过大时，疏水残基吸引力增强，使蛋白聚集，从而可能将发色团隐藏在分子内部[24]。
2.2.5 表面疏水性
不同超声功率下WPI 的表面疏水性如图8 所示。
图8 不同超声功率下WPI 的表面疏水性
Fig.8 Surface hydrophobicity of WPI under different ultrasonic power
表面疏水性由蛋白质的氨基酸残基决定，也可以反映蛋白构象。由图8 可知，超声处理后，在相同超声时间下，随着超声功率的增加表面疏水性先增强后降低。与未处理组相比，H0 从951.2 升至1 239.0（600 W，10 min）。这主要是由于超声作用使蛋白解折叠，暴露了嵌入内部的一些疏水性氨基酸残基，疏水基团含量增加从而增加表面疏水性。刘斌等[25]的研究结果也表明，超声强度过大会使蛋白再次卷曲折叠，导致氨基酸残基再次被包埋。这一结果与各组荧光强度和溶解度的结果一致。
3 结论
本文探究超声功率对WPI 性能的影响。结果表明，采用碱溶酸沉法提取的WPI 颜色呈深棕色，蛋白含量为80.35%。在相同超声时间下，随着超声功率的增加，WPI 的功能性呈现先升高再降低的趋势。超声作用后，WPI 的平均粒径减小，显著增强了核桃蛋白的溶解性，进而增加蛋白的乳化性。与对照组相比，处理组的电位绝对值变大，说明蛋白基团电离程度增强，有利于提高乳化稳定性。电泳图谱结果表明，超声没有使共价键断裂，即没有改变WPI 的一级结构。荧光强度增强以及表面疏水性的增加，反映超声对蛋白三级结构的改变。处理后核桃蛋白结构伸展，隐藏的疏水氨基酸暴露，增加蛋白质的表面疏水性，从而使EAI得到有效改善。但值得注意的是，过高功率的超声会使核桃蛋白变性程度增加，使蛋白再次聚集，导致WPI性能下降，但仍然优于未处理组。适当的超声可以修饰蛋白结构并改善功能性，这为核桃蛋白的加工应用特别是作为乳化剂在食品中的应用提供了理论基础。
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