肥胖是一种以脂肪异常或过度积累为主要特征的复杂代谢性疾病，对人类健康构成严重威胁[1]。肥胖的发生与多种因素有关，包括遗传因素和环境因素及其相互作用[2]。此外，肥胖现象流行还与其他各种慢性疾病和传染病（如2 型糖尿病、心血管疾病、高血压）的患病率上升有关[3]。世界卫生组织报告指出，1975 年至2016 年间，全球肥胖患病率约增加两倍；2016 年，超重和肥胖人口分别占世界成年人口的39%和13% 左右[4]。大量研究表明，天然植物化学物具有干预和治疗肥胖的生物活性[5-6]。因此，从食品或其他天然产物中寻找更有效、更安全的抗肥胖物质具有重要意义。
丁香酚，又称2-甲氧基-4-烯丙基苯酚，是一种主要从丁香中提取的芳香化合物，作为调味剂广泛应用于食品和化妆品中。丁香酚占丁香精油总成分的45%～90%，是丁香香气的主要来源[7]。此外，肉桂和其他香料中也含有少量的丁香酚[8]。近年来的大量证据表明，除作为食品香料外，丁香酚具有多种生物活性，如抗癌、抗氧化、抗糖尿病和心血管保护作用[9]。前期研究结果表明，丁香酚在高脂饮食喂养小鼠中表现出优异的抗肥胖作用；显著调节高脂饮食小鼠附睾脂肪组织转录图谱，差异基因富集在与肥胖密切相关的环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路上[10]。本研究以3T3-L1 小鼠前脂肪细胞为模型，利用cAMP 抑制剂进一步探索丁香酚改善脂肪细胞脂质积累的分子机制，以期为丁香酚的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株
3T3-L1 小鼠前脂肪细胞株：北京协和细胞资源中心。
1.2 主要试剂
丁香酚、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国西格玛奥德里奇公司；胰岛素、CCK-8 试剂盒、油红O 染色试剂盒：碧云天生物技术有限公司；罗格列酮：上海易恩化学技术有限公司；新生牛血清、胎牛血清、胰酶细胞消化液（0.05%胰酶）、青霉素-链霉素溶液（100×）：美国Gbico公司；DMEM 培养基：北京中源合聚生物科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司；cAMP 抑制剂（SQ22536）：美国MedChemExpress 公司；cAMP 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：美国Enzo 公司；TRIzol 试剂：美国Invitrogen 公司；SYBR Green Master Mix：天根生化科技（北京）有限公司；基因引物：北京睿博兴科生物技术有限公司。
1.3 主要仪器
MCO-18AIC 二氧化碳细胞培养箱：日本三洋电机株式会社；OLYMPUS IX71 荧光倒置显微镜：卡尔蔡司光学（中国）有限公司；超净工作台：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；DNM-9602 酶标仪：北京普朗新技术有限公司；TDL-40B 低速离心机：上海安亭科学仪器厂；荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Bio-Rad 公司。
1.4 方法
1.4.1 3T3-L1 前脂肪细胞培养与诱导分化
细胞培养：3T3-L1 前脂肪细胞在由DMEM 培养基、10% 新生牛血清和1% 双抗组成的完全培养基中培养，培养箱条件为37 ℃、5% CO2。每2 d 更换1 次培养基。
诱导分化：3T3-L1 前脂肪细胞100%融合2 d 后，更换为由DMEM 培养基、10%胎牛血清和1%双抗组成的分化培养基，同时添加0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（isobutylmethylxanthine，M）、1µmol/L 地塞米松（dexamethasone，D）、2 µg/ml 胰岛素（insulin，I）和2µmol/L 罗格列酮（rosiglitazone，R），诱导脂肪形成（第0 天）。2 d 后，将培养基更换为含有2 µg/mL 胰岛素的分化培养基（第2 天）。2 d 后，将培养基更换为分化培养基，每2 d 换液1 次，培养至第8 天。为探讨丁香酚对MDIR 诱导3T3-L1 细胞脂肪生成的影响，以及cAMP 在其中发挥的作用，在整个分化过程中向培养基中添加溶解于DMSO 的丁香酚（50µmol/L）或SQ22536（100µmol/L）。
1.4.2 细胞活力测定
采用CCK8 法测定细胞活力。将3T3-L1 细胞接种至96 孔板中培养24 h，每孔分别用不同浓度的丁香酚（3.125、6.25、12.5、25、50µmol/L）处理24 h。以含有0.1% DMSO 培养基处理的细胞（0µmol/L）作为对照。向每孔加入10µL CCK-8 试剂，在培养箱中孵育3 h后于450 nm 处测量OD 值，记为A1，对照组记为A0。细胞活力（H，%）计算公式如下。
1.4.3 油红O 染色与脂质含量测定
油红O 染色：去除孔板中的完全培养基后，用PBS洗涤3 次。在室温下用中性4%多聚甲醛甲醛固定细胞1 h，60%异丙醇快速冲洗并晾干。用双重蒸馏水按体积比3∶2 稀释的油红O 染色10 min，蒸馏水洗涤3～4 次终止染色。利用显微镜观察并拍摄各孔细胞内脂滴染色情况。
脂质含量测定：每孔加入1 mL 异丙醇，室温孵育10 min。将异丙醇溶液转移到96 孔板上，利用酶标仪测定490 nm 处的OD 值。
1.4.4 cAMP 含量测定
使用稀HCl 从3T3-L1 细胞中提取cAMP，按照cAMP ELISA 试剂盒说明书测定裂解物中cAMP 的细胞内浓度。
1.4.5 RNA 提取与实时荧光定量PCR 测定
用Trizol 试剂提取细胞RNA。参照荧光定量PCR 试剂盒说明书，以GAPDH 为内标，测定细胞中CCAAT 增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPα）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein，aP2）和解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）的基因表达量。引物序列如表1 所示。
表1 实时荧光定量PCR 引物序列
Table 1 Sequences of primers used for real-time quantitative PCR
基因CEBPα aP2 UCP1上游引物（5'-3'）TCAGCTTACAACAGGCCAGG CATGCGACAAAGGCAGAAAT GGTTTGCACCACACTCCTG下游引物（5'-3'）ACACAAGGCTAATGGTCCCC GTTACAAGGCAAGGAAGGGC ACATGGACATCGCACAGCTT
1.5 数据统计与分析
所有数据以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析：使用非配对双尾t 检验分析两个独立组间的差异；使用单因素方差分析和Dunnett 多重比较检验两组以上之间的差异。当P＜0.05 时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 丁香酚对3T3-L1 细胞活力的影响
丁香酚对3T3-L1 细胞活力的影响如图1 所示。
图1 丁香酚对3T3-L1 细胞活力的影响
Fig.1 Effect of eugenol on cell viability in 3T3-L1 cells
由图1 可知，与对照组相比，3.125、6.25、12.5、25、50µmol/L 丁香酚对3T3-L1 细胞活力均无明显影响，表明试验剂量范围内的丁香酚对3T3-L1 细胞无毒性。因此，选择无毒性的最大剂量（50µmol/L）进行后续试验。
2.2 丁香酚抑制MDIR 诱导的3T3-L1 细胞脂质积累
丁香酚抑制MDIR 诱导的3T3-L1 细胞脂质积累结果如图2 所示。
图2 丁香酚抑制MDIR 诱导的3T3-L1 细胞脂质积累
Fig.2 Eugenol suppresses intracellular lipid accumulation in 3T3-L1 cells treated with MDIR
由图2 可知，与未经诱导分化的3T3-L1 前脂肪细胞（对照组）相比，MDIR 诱导分化的3T3-L1 细胞（模型组）呈现出明显的脂质积累；50µmol/L 丁香酚存在的条件下，MDIR 诱导的3T3-L1 细胞内脂质积累现象被显著抑制。定量分析结果表明，模型组胞内脂质含量极高度显著升高（P＜0.000 1），丁香酚处理显著降低胞内脂质含量（P＜0.000 1）（图2B）。前期研究结果证实，膳食补充丁香酚能够显著预防高脂饮食诱导的肥胖，且高脂饮食模型组和丁香酚处理组小鼠脂肪组织的差异基因富集在cAMP 信号通路上[10]。基于cAMP信号通路与肥胖发生密切相关，对3T3-L1 细胞内cAMP 含量进行测定。结果表明，与对照组相比，模型组细胞内的cAMP 含量极高度显著降低（P＜0.000 1）；与模型组相比，丁香酚处理组胞内cAMP 含量极显著上升（P＜0.01）（图2C）。
2.3 SQ22536 削弱丁香酚对3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用
为进一步探究cAMP 在丁香酚抑制3T3-L1 细胞脂质积累过程中发挥的作用，采用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536 处理3T3-L1 细胞，抑制细胞内cAMP 的合成。SQ22536 削弱丁香酚对3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用如图3 所示。
图3 SQ22536 削弱丁香酚对3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用
Fig.3 SQ22536 attenuates the inhibitory effect of eugenol on lipid accumulation in 3T3-L1 cells
由图3 可知，在SQ22536 存在的条件下，50µmol/L丁香酚对MDIR 诱导3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用被大幅度削弱，由24.7%（图2）降低为6.7%（图3）。此外，由图3C 可知，SQ22536 处理消除了丁香酚对MDIR 诱导3T3-L1 细胞内cAMP 含量的增加作用。综上，丁香酚对3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用与cAMP 的激活有关。
2.4 丁香酚对3T3-L1 细胞脂质生成和产热相关基因表达的影响
丁香酚对3T3-L1 细胞脂质生成和产热相关基因表达的影响如图4 所示。
图4 丁香酚对3T3-L1 细胞脂质生成和产热相关基因表达的影响
Fig.4 Effect of eugenol on the expression of genes related to lipid production and thermogenesis in 3T3-L1 cells
由图4 可知，与对照组相比，MDIR 处理显著上调了脂肪生成基因的mRNA 表达，如CEBPα（P＜0.000 1）和aP2（P＜0.000 1）；丁香酚显著降低了3T3-L1 细胞中脂肪形成基因CEBPα（P＜0.05）和aP2（P＜0.01）的mRNA 表达量。然而，在SQ22536 存在时，丁香酚对3T3-L1 细胞中脂肪形成基因CEBPα 和aP2 表达量的下调作用被削弱，分别由32.1%和32.7%降低为29.3%和30.1%。产热过程的调节与脂肪细胞中脂质积累密切相关[11]。同时，进一步对调控产热程序的关键基因UCP1 的mRNA 表达量进行检测，发现丁香酚显著上调了3T3-L1 细胞中UCP1 的表达量（P＜0.01），而SQ22536 处理完全消除了丁香酚UCP1 的表达量的影响。综上，丁香酚对3T3-L1 细胞中脂质生成和产热相关基因表达量的调节作用在一定程度上与cAMP 的激活有关。
3 讨论与结论
肥胖以白色脂肪组织的异常扩张为主要特征。脂肪组织的肥大主要通过两种方式：肥大（现有脂肪细胞的大小增加）或增生（通过前脂肪细胞分化形成成熟的脂肪细胞）[12]。因此，控制前脂肪细胞的增生过程是肥胖有效的预防或治疗方式[13]。3T3-L1 是一种小鼠前脂肪细胞系，被广泛用于脂肪形成的研究。当3T3-L1前脂肪细胞融合度达到100% 时，会因接触抑制而发生生长停滞。生长停滞的3T3-L1 细胞在MDIR 处理后重新进入细胞周期，开始增殖并最终分化为成熟脂肪细胞[14]。在本研究中，丁香酚对未分化的3T3-L1 前脂肪细胞的存活率无影响，但显著抑制了MDIR 诱导的3T3-L1 细胞的分化过程，同时下调脂质生成相关基因CEBPα 和aP2 的表达。
白色脂肪组织的作用是储存能量，而棕色脂肪组织通过生热作用以热量的形式消耗储存的能量[15]。因此，促进白色脂肪细胞褐变以增加能量消耗是改善肥胖的另一种有效方法[16]。UCP1 在白色脂肪细胞转化为棕色产热脂肪细胞的过程中起重要的调控作用[17]。在本研究中，丁香酚处理的分化后的3T3-L1 细胞中UCP1 的表达量显著升高。该结果表明，丁香酚可以促进白色脂肪细胞分解产热，为丁香酚抑制3T3-L1 细胞脂质积累的潜在机制提供依据。
cAMP 作为细胞内第二信使，在多种慢性疾病的发生发展中起重要作用[18]。大量研究表明，cAMP 信号通路参与调控脂肪组织形成和分化过程，并已成为许多植物化学物质发挥抗肥胖作用的靶点[19]。在3T3-L1 脂肪细胞中，腺苷酸环化酶激活剂处理使细胞内cAMP 浓度升高，下调主要脂肪生成转录因子的mRNA 水平，并抑制细胞内脂质积累[20]。Moon 等[21]发现，榛果中的主要风味化合物榛子酮通过激活cAMP通路，抑制了MDI 诱导的3T3-L1 细胞的脂质积累，降低高脂饮食诱导小鼠的肥胖现象。本研究采用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536 处理细胞时，丁香酚对MDIR诱导的3T3-L1 细胞脂质积累的抑制作用被极大削弱。综上，丁香酚在3T3-L1 细胞中发挥的有益作用在一定程度上与cAMP 的激活有关。
综上所述，丁香酚可有效抑制3T3-L1 细胞脂质积累，其作用机制与cAMP 的激活有关。本研究揭示了丁香酚在抑制脂肪细胞增生方面的潜力及其潜在的分子机制，为丁香酚在生物医药领域的进一步应用提供参考。
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