蓝靛果（Lonicera caerulea）富含花青素、维生素、氨基酸、矿质元素和多种生物活性物质[1]，其中的花青素含量是蓝莓的13 倍[2]。花青素属于类黄酮多酚类水溶性化合物[3]，具有抗衰老、抗氧化、降血脂、保护视力、预防心血管疾病、抗癌抗肿瘤等生理功能[4-6]。另外，植物花青素能够抑制α-葡萄糖糖苷酶和α-淀粉酶的活性，表现出较好的降血糖活性[7]。目前全球糖尿病患者已超过1.2 亿人，我国患者数量居世界第二，发病率高达12.8%，糖尿病仍是一个严重的公共卫生问题[8]。
胰岛素抵抗是糖尿病的重要发病环节，随磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）通路的活性降低而产生[9]，胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）磷酸化影响胰岛素转运葡萄糖[10]，而叉头盒蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）、G-6-Pase、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）是IRS1/PI3K/AKT 信号通路中的下游靶蛋白和关键酶，影响葡萄糖摄取、糖异生及糖原合成[11]。花青素在肝糖代谢紊乱调控、肝糖原合成和IRS1/PI3K/AKT 信号通路关键酶调控等方面表现出较好的功能特性[12]。
因此，本研究从体外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性以及体内糖尿病小鼠模型两个方面，评价蓝靛果花青素的体内外降血糖作用，并从IRS1/PI3K/AKT 信号通路关键酶和细胞因子的调控角度，对蓝靛果花青素的降血糖作用机制进行探讨，以期为蓝靛果精深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料
蓝靛果：长白朝鲜族自治县三江源土特产有限公司。
1.1.2 实验动物与试剂
昆明小鼠[合格证号：SCXK（辽）2015-003]：辽宁长生生物技术有限公司；血糖测定试剂盒、血清总胆固醇（human serum total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides cholesterol，TG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）、己糖激酶（hexokinase，HK）试剂盒、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）试剂盒、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；Prime-ScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒、Recombinant DNase I试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司；α-葡萄糖苷酶（30 U/mg）、α-淀粉酶（35 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）、4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl α-d-glucopyranoside，PNPG）：上海麦克林生化科技有限公司；阿卡波糖、链脲菌素（streptozotocin，STZ）：美国Sigma 公司；XR6702 型大孔树脂：上海逊尔化工科技有限公司；碳酸钠、可溶性淀粉、酒石酸钾钠（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：上海展云化工有限公司。
1.1.3 仪器设备
BK-400 全自动生化分析仪：济南鑫贝西生物技术有限公司；SPECTRA MAX 190 酶标仪：美国Molecular Devices 公司；CB150 型CO2 培养箱：德国BINDER 公司；Mx3000p 实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Agilent 公司；FD-1A-50 型真空冷冻干燥机：上海豫明仪器有限公司；ZD-2 型电位滴定仪：上海汇分电子科技有限公司；LRH-70型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 蓝靛果花青素提取
将蓝靛果解冻打浆，果浆调至pH5.0，复合酶（纤维素酶∶果胶酶=3∶1，质量比）添加量为0.6%，50 ℃酶解50 min，过滤，滤渣用体积比为60% 的乙醇超声浸提两次，料液比1∶15（g/mL），浸提时间20 min，浸提温度60 ℃。合并滤液，4 000 r/min 离心20 min，浓缩后冷冻干燥备用。
1.2.2 蓝靛果花青素的纯化
将预处理的XR6702 大孔树脂装填于层析柱中（Φ3.5 cm×50 cm），吸附条件：上样浓度2.5 mg/mL，pH4.0，上样体积15 mL；解吸条件：60% 乙醇水溶液，pH4.0，洗脱流速1.5 mL/min，收集波峰（编号30～60 的试管），真空浓缩，冷冻干燥得到纯化蓝靛果花青素，采用pH 示差法测定花青素的含量，其纯度为77.6%。
1.2.3 蓝靛果花青素体外降血糖活性研究
1.2.3.1 蓝靛果花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响
参照李雨鸿等[13]的方法并作适当修改，分别取浓度为0.5～7.0 mg/mL（浓度间隔0.5 mg/mL）的蓝靛果花青素溶液1.6 mL，加入1.6 mL α-葡萄糖苷酶（0.04 U/mL，以pH6.8 的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液溶解），再加入0.8 mL PNPG（0.5 mmol/L，以pH6.8 的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液溶解），振荡2 min，37 ℃孵育30 min，以0.2 mol/L Na2CO3 2 mL 终止反应，室温下冷却5 min，于405 nm 处测定吸光度，以1.6 mL 蒸馏水代替样品作为阴性对照组，以阿卡波糖代替样品作为阳性对照组。α-葡萄糖苷酶活性抑制率（H，%）计算公式如式（1）所示。
式中：A 为加入样品底物和酶的吸光度；C 为加入底物但不加样品和酶的吸光度；B 为加入样品和底物但不加酶的吸光度。
1.2.3.2 蓝靛果花青素对α-淀粉酶活性的影响
参照李井雷等[14]的方法并适当修改，分别取浓度为0.5～7.0 mg/mL（浓度间隔0.5 mg/mL）的蓝靛果花青素溶液1.0 mL，加入1.0 mL α-淀粉酶（2.22 U/mL，以pH6.5 的0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液溶解），再加入可溶性淀粉溶液（2.0 mg/mL）1 mL，振荡混合，37 ℃孵育20 min，加入3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）显色剂（含12%酒石酸钾钠和1%3，5-二硝基水杨酸的0.4 mol/L NaOH 溶液）5 mL 终止反应，沸水浴灭酶5 min，取出后冷却至室温（20 ℃），在540 nm处测定吸光度，以阿卡波糖代替样品为阳性对照组。α-淀粉酶活性抑制率（M，%）计算方法如式（2）所示。
式中：D 为加入底物、不加样品和酶的吸光度；G 为加入样品、底物和酶的吸光度；E 为加入底物和酶、不加样品的吸光度；F 为加入样品和底物不加酶的吸光度。
1.2.4 蓝靛果花青素体内降血糖活性研究
1.2.4.1 动物分组及模型建立
参照Li 等[15]的方法，选择4 周龄雄性昆明小鼠（18～22 g）80 只，禁食不禁水14 h 后称重，按120 mg/kg的剂量对小鼠一次性腹腔注射浓度为10 mg/mL 的STZ 溶液。注射后小鼠自由饮食饮水。另取10 只作为对照组，5 d 后，禁食不禁水8 h，测定空腹血糖值，血糖值在11.1～30.0 mmol/L 的小鼠为糖尿病模型动物。将糖尿病模型小鼠随机分为5 组（10 只/组），即模型组、阿卡波糖组（20 mg/kg·BW）、蓝靛果花青素低剂量组（50 mg/kg·BW，LA-L）、中剂量组（100 mg/kg·BW，LA-M）和高剂量组（200 mg/kg·BW，LA-H），模型组与对照组灌胃生理盐水（100 mg/kg·BW），持续给药4周，禁食不禁水8 h，称重，摘眼球取血，测定血糖值、血清TC、TG、MDA 含量和SOD 活性，取小鼠胸腺、脾脏、肝脏和肾脏，用滤纸吸干血液，称重，计算脏器系数（S，%），计算公式如式（3）所示。
式中：N 为脏器质量，g；P 为动物体质量，g。
1.2.4.2 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠糖耐量的影响
给药4 周后，禁食6 h 后测定血糖值（即0 h）。蓝靛果花青素高、中、低剂量组和阿卡波糖组给予相应的药物，对照组和模型组给予同体积生理盐水，15 min 后各组小鼠经口给予淀粉溶液3 g/kg，之后分别于1、2 h时尾尖采血，测定血糖值。血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）计算方法如式（4）所示。
式中：A 为血糖曲线下面积，mmol/L；X 为0 h 血糖值，mmol/L；Y 为1 h 血糖值，mmol/L；Z 为2 h 血糖值，mmol/L。
1.2.5 蓝靛果花青素降血糖机制研究
1.2.5.1 蓝靛果花青素对肝脏糖原含量的影响
按试剂盒说明测定小鼠肝脏的糖原含量，样品预处理参考Narasimhan 等[16]的方法。
1.2.5.2 蓝靛果花青素对糖代谢关键酶活性的影响
小鼠肝脏以提取液匀浆[1∶10（g/mL）]，4 000 r/min离心20 min，取上清液，依据试剂盒说明书测定HK、PEPCK 和G-6-Pase 的活性。
1.2.5.3 蓝靛果花青素对肝脏糖代谢相关基因表达的影响
肝脏总RNA 的提取参考Wang 等[17]的方法：取小鼠肝脏研磨成粉（液氮辅助），以1 mL 总RNA 提取试剂（Trizol 法）溶解后转入无RNA 的离心管中，利用Recombinant DNase I 试剂盒提取细胞总RNA。
cDNA 制备：利用PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行反转录。
反转录定量聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-qPCR）：IRS1、PI3K、AKt、GSK-3β、G6PC、PEPCK、FoxO1 引物设计委托北京中科亚光生物科技有限公司，序列如表1 所示。按TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书，反应体系为20µL，RT-qPCR 条件为95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，5 s；扩增40 个循环，95 ℃，5 s。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称IRS1 PI3K AKt GSK-3β G6PC PEPCK FoxO1 β-actin上游引物（5'-3'）ACCAGCCCTTAGGCAGCAAT GGGCAGTTAAGAAGCACAATG GATCATGCAGCACCGGTTCT CGGGACCCAAATGTCAAACT AGGTCGTGGCTGGAGTCTTGTC AAGGAGTGGAGACCGCAGGAC CCTGAGCCTGCTGGAGGAGAG AGCCATGTACGTAGCCATCC下游引物（3'-5'）GAAGCTGATGCTGGCATAGTTG GCAGGAGAGTCTTTCCAATG GGCGTGATGGTGATCATCTG GTCCACGGTCTCCAGCATTA AATGCAGGCGAAGCGGAATGG TGCCGAAGTTGTAGCCGAAGAAG GCACGCTCTTCACCATCCACTC TCCCTCTCAGCTGTGGTGGTGAA
1.3 数据处理
数据分析采用SPSS 19.0 软件，绘图采用Origin 8.5 软件。
2 结果与分析
2.1 蓝靛果花青素的体外降血糖活性
2.1.1 蓝靛果花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响
蓝靛果花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响如图1所示。
图1 蓝靛果花青素对α-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.1 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on α-glucosidase activity
由图1 可知，蓝靛果花青素随浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率逐渐增大，并呈现一定的剂量效应关系，抑制率最高为76.92%，此时蓝靛果花青素浓度为6.0 mg/mL，较阳性对照组（阿卡波糖）抑制率显著提高2.2%（p＜0.05），对α-葡萄糖苷酶的抑制率高于羊肚菌胞外多糖[14]。
2.1.2 蓝靛果花青素对α-淀粉酶活性的影响
蓝靛果花青素对α-淀粉酶活性的影响如图2所示。
图2 蓝靛果花青素对α-淀粉酶活性的影响
Fig.2 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on α-amylase activity
由图2 可知，蓝靛果花青素浓度为0.5～6.0 mg/mL时，对于α-淀粉酶的活性表现出一定的抑制特性，呈现剂量效应关系，抑制率最高为74.85%，此时浓度为6.0 mg/mL，较阳性对照组（阿卡波糖）显著提高1.69%（p＜0.05），对α-淀粉酶的抑制率高于桑黄提取物[13]。
2.2 蓝靛果花青素体内降血糖作用
2.2.1 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠体质量的影响
给药0、1、2、3、4 周后测定各组小鼠的体质量。蓝靛果花青素对糖尿病小鼠体质量的影响如表2 所示。
表2 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠体质量的影响（n=10）
Table 2 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on the weight of diabetic mice（n=10）g
注：#表示与对照组相比差异显著（p＜0.05）；##表示与对照组相比差异极显著（p＜0.01）；*表示与模型组相比差异显著（p＜0.05）；**表示与模型组相比差异极显著（p＜0.01）；△表示与阳性对照组相比差异显著（p＜0.05）；△△表示与阳性对照组相比差异极显著（p＜0.01）。
组别对照组模型组阳性对照组LA-L LA-M LA-H 0 周25.16±2.13*△24.15±2.27##24.32±2.61##24.49±2.61#24.53±2.68#24.41±2.26#1 周29.48±2.62**△△24.32±2.37△△##27.48±2.35**##25.47±3.69*△△##26.61±2.45**△##27.27±3.73**##2 周33.52±3.14**△△23.52±1.16△△##30.52±2.18**#28.42±1.25**△△##29.73±1.54**△##30.65±1.92**#3 周36.45±2.03**△△22.45±2.14△△##32.45±2.26**##30.16±2.27**△△##31.17±2.41**△##32.58±1.62**##4 周41.24±2.05**△△21.46±2.18△△##34.59±2.24**##32.37±2.03**△△##33.19±2.19**△##34.17±2.16**##
由表2 可知，与对照组比较，各组糖尿病小鼠体质量显著降低（p＜0.05）。给药后，与模型组比较，各给药组糖尿病小鼠体质量均明显增高，给药1 周后，蓝靛果花青素各剂量组和阳性对照组糖尿病小鼠体质量开始有显著升高（p＜0.05 或p＜0.01）；给药4 周后，与模型组相比，蓝靛果花青素各剂量组糖尿病小鼠体质量分别增加了50.84%、54.66%、59.23%。与阳性对照组相比，在给药的4 周内蓝靛果花青素高剂量组糖尿病小鼠体质量无显著差异（p＞0.05），低中剂量组糖尿病小鼠体质量显著升高（p＜0.05），蓝靛果花青素高剂量组和阳性对照组缓解糖尿病小鼠消瘦症状效果相当，对糖尿病小鼠体质量下降具有一定的改善作用。
2.2.2 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血糖的影响
蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血糖的影响如表3所示。
表3 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血糖值的影响（n=10）
Table 3 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on GLU in diabetic mice（n=10）
注：*表示与模型组相比差异显著（p＜0.05），**表示与模型组相比差异极显著（p＜0.01）；△表示与阳性对照组相比差异显著（p＜0.05）；△△表示与阳性对照组相比差异极显著（p＜0.01）。
组别对照组模型组阳性对照组LA-L LA-M LA-H空腹血糖值/（mmol/L）0 周6.76±1.03**△△19.24±1.27 19.16±1.63 19.49±1.93 19.53±1.15 19.41±1.62 1 周6.84±0.82**△△20.17±1.37 20.41±1.41 20.62±1.62 20.35±1.43 20.41±1.12 2 周7.02±0.63**△△21.65±1.16△△19.17±1.02**19.42±1.58**△△19.73±1.38**△19.15±1.26**3 周6.94±0.71**△△22.63±1.14△△18.15±1.35**19.11±1.38**△18.94±2.16**18.08±1.47**4 周6.87±1.06**△△23.15±1.12△△17.68±1.14**18.33±1.06**△△18.12±1.12**17.13±1.18**△
由表3 可知，与模型组相比，给药4 周后，阳性对照组和蓝靛果花青素各剂量组小鼠空腹血糖值有极显著降低（p＜0.01），蓝靛果花青素各剂量组空腹血糖值分别降低了20.82%，21.73%、26.01%。与阳性对照组小鼠相比，在给药的第4 周后，蓝靛果花青素高剂量组空腹血糖值有显著降低（p＜0.05）。高剂量蓝靛果花青素降低STZ 诱导的糖尿病小鼠血糖效果比阿卡波糖显著。
2.2.3 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠脏器系数的影响
蓝靛果花青素对糖尿病小鼠脏器系数的影响结果见表4。
表4 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠脏器系数的影响（n=10）
Table 4 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on organ index of diabetic mice（n=10）
注：#表示与对照组相比差异显著（p＜0.05）；##表示与对照组相比差异极显著（p＜0.01）；*表示与模型组相比差异显著（p＜0.05），**表示与模型组相比差异极显著（p＜0.01）；△表示与阳性对照组相比差异显著（p＜0.05）；△△表示与阳性对照组相比差异极显著（p＜0.01）。
组别对照组模型组阳性对照组LA-L LA-M LA-H肝脏系数/%4.72±0.45**△△5.82±0.12△△##5.01±0.31*##5.13±0.27*△△##4.95±0.11**△△##4.81±0.11**△△#脾系数/%0.47±0.13**△△0.41±0.12△△##0.59±0.11**##0.62±0.12**△△##0.71±0.09**△△##0.76±0.08**△△##肾脏系数/%1.58±0.12**△△1.68±0.17△△##1.45±0.11**##1.54±0.15**△#1.48±0.12**##1.41±0.09**##胸腺系数/%0.12±0.06**△△0.09±0.04△△##0.15±0.05**##0.13±0.03**△0.15±0.06**△##0.19±0.08**△△##
由表4 可知，与对照组相比，模型组小鼠肝脏系数和肾脏系数极显著升高（p＜0.01）。与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组和阳性对照组小鼠的肝脏系数、肾脏系数显著降低（p＜0.05），胸腺系数和脾脏系数极显著上升（p＜0.01）；与阳性对照组相比，蓝靛果花青素中、高剂量组的肝脏系数极显著降低（p＜0.01），蓝靛果花青素高剂量组胸腺系数和脾系数呈现极显著上升趋势（p＜0.01），蓝靛果花青素可阻止因糖尿病引起的小鼠肝脏和肾脏损伤，通过增大脾脏系数和胸腺系数，提高小鼠的免疫力，效果优于阿卡波糖。
2.2.4 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血清指标的影响
蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血清指标影响如表5所示。
表5 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠血清指标的影响
Table 5 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on serum profiles in diabetic mice
注：**表示与模型组相比差异极显著（p＜0.01）；△表示与阳性对照组相比差异显著（p＜0.05）；△△表示与阳性对照组相比差异极显著（p＜0.01）。
组别对照组模型组阳性对照组LA-L LA-M LA-H TG 含量/（mmol/L）4.23±0.52**△△6.51±0.26△△4.39±0.31**4.59±0.53**△△4.28±0.47**△△4.07±0.32**TC 含量/（mmol/L）7.52±0.16**△△12.09±0.73△△9.45±0.26**10.24±0.45**△9.69±0.31**△△9.09±0.56**△△SOD 活性/（U/mL）242.29±5.3**△△214.47±4.53△△329.37±5.73**273.69±4.71**△△288.71±3.28**△△327.9 3±2.37**MDA 含量/（nmol/mL）53.53±1.39**△△62.71±1.29△△49.43±2.37**52.63±1.06**△△50.42±1.21**△48.35±1.34**△△
由表5 可知，灌胃给予蓝靛果花青素4 周后，与模型组比较，蓝靛果花青素可降低糖尿病小鼠血清TC、TG、MDA 含量，高剂量组分别降低24.79%、36.65%、21.94%，SOD 活性升高了51.01%。表明蓝靛果花青素具有改善糖尿病脂质代谢紊乱、减轻氧自由基损伤和抑制脂质过氧化的作用。
2.2.5 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠糖耐量的影响
蓝靛果花青素对糖尿病小鼠糖耐量的影响如表6所示。
表6 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠糖耐量的影响（n=10）
Table 6 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on glucose tolerance in diabetic mice（n=10）
注：**表示与模型组相比差异极显著（p＜0.01）；△表示与阳性对照组相比差异显著（p＜0.05）；△△表示与阳性对照组相比差异极显著（p＜0.01）。
组别对照组模型组阳性对照组LA-L LA-M LA-H淀粉负荷后不同时间血糖值/（mmol/L）0 h 6.87±1.06**△△23.15±1.12△△17.68±1.14**18.33±1.063**△18.12±1.12**△17.13±1.18**△1 h 10.15±0.53**△△28.26±1.02△△22.13±1.04**22.94±1.05**△22.75±1.16**△21.25±1.06**2 h 7.27±0.96**△△25.73±1.73△△19.24±1.12**19.26±1.46**19.17±1.47**18.38±1.26**△△AUC/（mmol·h/L）17.22±1.41**△△52.70±2.53△△40.59±2.05**41.74±3.56**△△41.40±3.29**△39.01±3.43**
由表6 可知，与模型组比较，淀粉灌胃1 h 和2 h后，蓝靛果花青素各剂量组和阳性对照组小鼠血糖值极显著降低（p＜0.01），与阳性对照组比较，淀粉灌胃2 h 后，蓝靛果花青素高剂量组极显著降低（p＜0.01）。与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组和阳性对照组的AUC 均极显著降低（p＜0.01）；与阳性对照组比较，蓝靛果花青素高剂量组AUC 无显著差异（p＞0.05）。由此可知，蓝靛果花青素可降低糖尿病小鼠糖耐量值，改善胰岛素抵抗。
2.3 蓝靛果花青素降血糖机制研究
2.3.1 蓝靛果花青素对小鼠肝脏糖原含量的影响
蓝靛果花青素对肝脏糖原含量的影响如图3 所示。
图3 蓝靛果花青素对肝脏糖原含量的影响
Fig.3 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on the liver glycogen content
由图3 可知，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中的糖原含量显著减小（p＜0.05），糖尿病小鼠的肝脏糖原含量出现急剧下降，与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组的肝脏糖原显著增高（p＜0.05），高剂量组提高1.3倍。蓝靛果花青素可提高糖尿病小鼠肝脏糖原的储存能力，减弱胰岛素抵抗引起的肝脏糖原分解，效果优于大豆叶提取物[15]。
2.3.2 蓝靛果花青素对小鼠肝脏HK 活性的影响
HK 是血糖浓度调节的关键酶[18]。蓝靛果花青素对肝脏HK 活性的影响如图4 所示。
图4 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠肝脏HK 活性的影响
Fig.4 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on HK activity in the liver of diabetic mice
由图4 可知，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中的HK 活性显著降低（p＜0.05），与模型组比较，蓝靛果花青素中、高剂量组肝脏HK 活性显著提高（p＜0.05），高剂量组提高69.6%，与阳性对照组无显著差异。说明蓝靛果花青素通过提高糖尿病小鼠肝脏HK 活性发挥降血糖作用。
2.3.3 蓝靛果花青素对小鼠肝脏G-6-Pase 活性的影响
G-6-Pase 是糖异生的限速酶[19]。蓝靛果花青素对肝脏G-6-Pase 活性的影响如图5 所示。
图5 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠肝脏G-6-Pase 活性的影响
Fig.5 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on G-6-Pase activity in the liver of diabetic mice
由图5 可知，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中的G-6-Pase 活性显著提高（p＜0.05）；与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组肝脏G-6-Pase 活性显著降低（p＜0.05），高剂量组降低25.94%，与阳性对照组无显著差异。蓝靛果花青素通过抑制小鼠肝脏G-6-Pase 活性抑制肝脏糖原分解，减缓小鼠糖尿病进程。
2.3.4 蓝靛果花青素对小鼠肝脏PEPCK 活性的影响
PEPCK 在维持血糖稳定和能量供给中发挥重要调控作用[20]。蓝靛果花青素对肝脏PEPCK 活性的影响如图6 所示。
图6 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠肝脏PEPCK 活性的影响
Fig.6 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on PEPCK activity in the liver of diabetic mice
由图6 可知，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中的PEPCK 活性显著提高（p＜0.05）；与模型组比较，蓝靛果花青素各剂量组肝脏PEPCK 活性显著降低（p＜0.05），高剂量组降低57.71%，与阳性对照组无显著差异。蓝靛果花青素可抑制小鼠肝脏PEPCK 活性，抑制糖异生作用，降低小鼠血糖浓度。
2.3.5 蓝靛果花青素对肝脏IRS1-PI3K-AKt 信号通路基因mRNA 表达的影响
胰岛素抵抗发生时，胰岛素信号通路IRS1-PI3KAKt 受到阻碍，相关的基因表达量发生不同的变化[21]。蓝靛果花青素对小鼠肝脏IRS1、PI3K 和AKt mRNA 表达的影响如图7 所示。
图7 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠肝脏IRS1、PI3K 和AKt mRNA表达量的影响
Fig.7 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on IRS1，PI3K，and AKt mRNA levels in the liver of diabetic mice
由图7 可知，与对照组比较，模型组的IRS1、PI3K和AKt 的相对mRNA 表达量明显降低（p＜0.05），与模型组比较，蓝靛果各剂量组IRS1、PI3K 和AKt 的相对mRNA 表达量明显升高（p＜0.05），高剂量组分别提高了2.1、3.2 倍和2.3 倍，PI3K 和AKt 表达量与阳性对照组无显著性差异。综上，蓝靛果花青素可激活IRS1-PI3K-AKt 信号通路，上调IRS1、PI3K 和AKt 基因的表达量，发挥降血糖作用。
蓝靛果花青素对小鼠肝脏FoxO1、G6PC、PEPCK和GSK-3β mRNA 表达的影响如图8 所示。
图8 蓝靛果花青素对糖尿病小鼠肝脏FoxO1、G6PC、PEPCK 和GSK-3β mRNA 表达量的影响
Fig.8 Effect of Lonicera caerulea anthocyanins on FoxO1，G6PC，PEPCK，and GSK-3β mRNA levels in the liver of diabetic mice
由图8 可知，与对照组比较，模型组的FoxO1、G6PC、PEPCK 和GSK-3β 的相对mRNA 表达量明显升高（p＜0.05）；与模型组比较，蓝靛果各剂量组FoxO1、G6PC、PEPCK 和GSK-3β 的相对mRNA 表达量明显降低（p＜0.05），高剂量组分别降低了38.09%、33.34%、39.26% 和45.71%，FoxO1、PEPCK 和GSK-3β 表达量与阳性对照组无显著性差异。蓝靛果花青素可激活IRS1-PI3K-AKt 信号通路，下调FoxO1、G6PC、PEPCK和GSK-3β mRNA 基因的表达量，减缓糖异生进程，减弱高血糖症，降低血糖浓度。
IRS1-PI3K-AKt 信号通路在调控胰岛素转运葡萄糖的过程中发挥重要作用，通路中的关键酶和细胞因子的表达异常，可引起糖代谢的紊乱[22]。AKt 是胰岛素信号通路中的关键因子，被上游IRS1 的磷酸化和PI3K 蛋白的表达激活，从而抑制下游GSK-3β 表达，抑制FoxO1 表达，进而抑制G6PC 和PEPCK 的表达，抑制糖异生进程，降低血糖浓度，阻止糖尿病的发生[23-25]。综上，蓝靛果花青素在IRS1-PI3K-AKt 信号通路关键酶和细胞因子表达方面表现出较好的特性，可上调IRS1、PI3K 和AKt mRNA 表达量，下调FoxO1、G6PC、PEPCK 和GSK-3β mRNA 表达量，发挥降血糖作用。
3 结论
本研究通过体外和体内途径评价蓝靛果花青素的降血糖作用，并从IRS1-PI3K-AKt 信号通路关键酶和细胞因子调节角度探讨蓝靛果花青素的降血糖作用机制。体外降血糖活性结果表明，蓝靛果花青素对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性具有一定抑制作用，抑制率分别为76.92% 和74.85%；体内降血糖活性结果表明，蓝靛果花青素可降低STZ 诱导的糖尿病小鼠血糖水平，降低糖尿病小鼠的糖耐量值，调节脂质代谢，减轻氧自由基损伤，抑制脂质过氧化，增强糖尿病小鼠免疫力，提高糖尿病小鼠肝脏糖原的储存能力，提高糖尿病小鼠肝脏HK 活性，抑制G-6-Pase 和PEPCK 活性，下调FoxO1、G6PC、PEPCK 和GSK-3β mRNA 表达量，上调IRS1、PI3K 和AKt mRNA 表达量，激活IRS1-PI3KAKt 信号通路，调节糖代谢紊乱，发挥降血糖作用。
[1] WANG Y H, ZHU J Y, MENG X J, et al. Comparison of polyphenol, anthocyanin and antioxidant capacity in four varieties of Lonicera caerulea berry extracts[J].Food Chemistry,2016,197:522-529.
[2] FENG C Y,SU S,WANG L J,et al.Antioxidant capacities and anthocyanin characteristics of the black-red wild berries obtained in Northeast China[J].Food Chemistry,2016,204:150-158.
[3] ŠIC ŽLABUR J, COLNAR D, VOĆA S, et al. Effect of ultrasound pre-treatment and drying method on specialized metabolites of honeyberry fruits (Lonicera caerulea var. kamtschatica)[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2019,56:372-377.
[4] GONÇALVES R, MATEUS N, DE FREITAS V. Inhibition of αamylase activity by condensed tannins[J]. Food Chemistry, 2011,125(2):665-672.
[5] KHAN N Q,PATEL B,KANG S S,et al.Regulation of vascular endothelial function by red wine procyanidins:Implications for cardiovascular health[J].Tetrahedron,2015,71(20):3059-3065.
[6] RAUDONĖ L, LIAUDANSKAS M, VILKICKYTĖ G, et al. Phenolic profiles, antioxidant activity and phenotypic characterization of Lonicera caerulea L. berries, cultivated in Lithuania[J]. Antioxidants,2021,10(1):115.
[7] 高秀娥,梁雪晴,刘薇,等.黑豆花青素精制及降血糖活性研究[J].食品研究与开发,2020,41(16):51-56.GAO Xiue, LIANG Xueqing, LIU Wei, et al. Study on refine and hypoglycemic activity of anthocyanin from black soybean[J]. Food Research and Development,2020,41(16):51-56.
[8] CARDULLO N,MUCCILLI V,PULVIRENTI L,et al.C-glucosidic ellagitannins and galloylated glucoses as potential functional food ingredients with anti-diabetic properties: A study of α-glucosidase and α-amylase inhibition[J].Food Chemistry,2020,313:126099.
[9] XU H,ZHOU Y,LIU Y X,et al.Metformin improves hepatic IRS2/PI3K/Akt signaling in insulin-resistant rats of NASH and cirrhosis[J].The Journal of Endocrinology,2016,229(2):133-144.
[10] ČESONIENĖ L, LABOKAS J, JASUTIENĖ I, et al. Bioactive compounds, antioxidant, and antibacterial properties of Lonicera caerulea berries:Evaluation of 11 cultivars[J].Plants,2021,10(4):624.
[11] NANDIPATI K C, SUBRAMANIAN S, AGRAWAL D K. Protein kinases: Mechanisms and downstream targets in inflammation-mediated obesity and insulin resistance[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2017,426(1-2):27-45.
[12] LIU X X, LV Y, ZHENG M Y, et al. Polyphenols from blue honeysuckle (Lonicera caerulea var. edulis) berry inhibit lipid accumulation in adipocytes by suppressing lipogenesis[J]. Journal of Ethnopharmacology,2021,279:114403.
[13] 李雨鸿,殷朝敏,范秀芝,等.桑黄提取物的体外抗氧化、降血糖及降尿酸活性[J].现代食品科技,2022,38(5):71-80.LI Yuhong,YIN Chaomin,FAN Xiuzhi,et al.In vitro Anti-oxidant,hypoglycemic,and hypouricemic activities of Sanghuangporus vaninii extracts[J]. Modern Food Science and Technology, 2022, 38(5):71-80.
[14] 李井雷,刘玉婷,宗帅,等.羊肚菌胞外多糖体外降血糖降血脂活性研究[J].食品研究与开发,2020,41(16):39-45.LI Jinglei, LIU Yuting, ZONG Shuai, et al. In vitro hyperglycemic and hypolipidemic activity of Morchella esculenta extracellular polysaccharides[J]. Food Research and Development, 2020, 41(16):39-45.
[15] LI H, JI H S, KANG J H, et al. Soy leaf extract containing kaempferol glycosides and pheophorbides improves glucose homeostasis by enhancing pancreatic β-Cell function and suppressing hepatic lipid accumulation in db/db mice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(32):7198-7210.
[16] NARASIMHAN A, CHINNAIYAN M, KARUNDEVI B. Ferulic acid exerts its antidiabetic effect by modulating insulin-signalling molecules in the liver of high-fat diet and fructose-induced type-2 diabetic adult male rat[J]. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism=Physiologie Appliquee, Nutrition et Metabolisme, 2015,40(8):769-781.
[17] WANG H L, GUO X B, LIU J, et al. Comparative suppression of NLRP3 inflammasome activation with LPS-induced inflammation by blueberry extracts (Vaccinium spp.)[J]. RSC Advances, 2017, 7(46):28931-28939.
[18] CORSSMIT E P M, ROMIJN J A, SAUERWEIN H P. Review article: Regulation of glucose production with special attention to nonclassical regulatory mechanisms: A review[J]. Metabolism,2001,50(7):742-755.
[19] LI W,ZHANG M,GU J,et al.Hypoglycemic effect of protopanaxadiol-type ginsenosides and compound K on Type 2 Diabetes mice induced by High-Fat Diet combining with Streptozotocin via suppression of hepatic gluconeogenesis[J]. Fitoterapia, 2012, 83(1):192-198.
[20] FUJITA Y, HOSOKAWA M, FUJIMOTO S, et al. Metformin suppresses hepatic gluconeogenesis and lowers fasting blood glucose levels through reactive nitrogen species in mice[J]. Diabetologia,2010,53(7):1472-1481.
[21] MU J J,XIN G,ZHANG B,et al.Beneficial effects of Aronia melanocarpa berry extract on hepatic insulin resistance in type 2 diabetes mellitus rats[J]. Journal of Food Science, 2020, 85(4): 1307-1318.
[22] ZHANG Y, LIU X F, HAN L F, et al. Regulation of lipid and glucose homeostasis by mango tree leaf extract is mediated by AMPK and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3):2896-2905.
[23] WANG D S, WANG J M, ZHANG F R, et al. Ameliorative effects of malonyl ginsenoside from Panax ginseng on glucose-lipid metabolism and insulin resistance via IRS1/PI3K/Akt and AMPK signaling pathways in type 2 diabetic mice[J]. The American Journal of Chinese Medicine,2022,50(3):863-882.
[24] XU J, DONG J X, DING H Y, et al. Ginsenoside compound K inhibits obesity-induced insulin resistance by regulation of macrophage recruitment and polarization via activating PPARγ[J]. Food&Function,2022,13(6):3561-3571.
[25] DING Y Y, XU T, MAO G H, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate-induced hepatotoxicity exacerbated type 2 diabetes mellitus (T2DM)in female pubertal T2DM mice[J]. Food and Chemical Toxicology,2021,149:112003.