黄芪是多年生草本植物，又被称为北芪或北蓍[1]。黄芪已被纳入保健食品来源名单，其具有治表虚自汗、脾虚泄泻、阳虚泄脱及水肿血痹等的效用[2-4]。黄芪含有多种活性物质，研究较多的是多糖类物质，研究表明其具有清除自由基和抗癌的效果。此外，黄芪还具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗感染等功效[5-8]。近年来的研究表明，黄芪作为一种药食两用食物，具有副作用低的特点，因此被广泛应用于功能性食品的开发和应用[9-11]。本试验通过使用不同极性的有机溶剂提取黄芪的有效成分，并结合高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和网络药理学鉴定黄芪的抗氧化活性物质和作用靶点及机制，以期为黄芪相关保健品的开发以及药食两用产业化的发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
黄芪：牡丹江天利药店，经牡丹江师范学院孙晓薇老师鉴定为豆科植物黄芪的干燥根；乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、浓盐酸、乙腈（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；没食子酸：四川维克奇生物科技有限公司；槲皮素：上海源叶生物科技有限公司；齐墩果酸：贵州迪大科技有限责任公司；1，1-二苯基-2-三 硝 基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚：青岛海博生物技术有限公司。
2695 型高效液相色谱仪：美国Waters 公司；Tp-213 电子天秤：上海资一仪器设备有限公司；HVE-50高压灭菌锅：华粤企业集团有限公司；ZHJH-C1209B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；CRY-21 分光光度计：上海茸研仪器有限公司；Wk-2102 电磁炉：美的集团股份有限公司；Hws-26 电热恒温水浴锅、RE-2000B 旋转蒸发仪：上海一恒科学仪器有限公司；DFY-1000 摇摆式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司。
1.2 方法
1.2.1 制备黄芪提取物
取2.75 kg 黄芪进行粉碎，200 目过筛后用70%乙醇浸泡12 h（浸泡过程中进行搅拌），重复浸提3 次。采用旋蒸浸提液的方法得到黄芪乙醇浸膏。
将黄芪乙醇浸膏用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇4 种不同极性的有机溶剂萃取至无色，收集各有机相萃取液，分别得到黄芪正丁醇相（主要含有极性较大的物质）、黄芪氯仿相（主要含有黄酮类和生物碱类化合物）、黄芪乙酸乙酯相（主要含有多酚类和香豆素类化合物）、黄芪石油醚相（主要含有油脂和三萜类化合物）。采用旋蒸萃取液的方法得到浸膏，并将其蒸干，最终获得黄芪石油醚相提取物12.781 4 g、氯仿相提取物4.616 g、乙酸乙酯相提取物1.913 g 和正丁醇相提取物7.2 g。
样品液制备：称取1 mg 的黄芪各有机相提取物溶解后，配制成浓度分别为0.8、0.4、0.2 mg/mL 的提取物待测溶液。
1.2.2 抗氧化效果的测定
1.2.2.1 羟基自由基清除能力
参照文献[12-16]的方法并稍作修改，取pH7.4 的磷酸缓冲液2 mL 和1.5 mmol/L 的邻二氮菲溶液1 mL于试管中充分混匀，分别加入浓度为0.02%的H2O2溶液或1 mL 不同浓度的黄芪提取液（0.8、0.4、0.2 mg/mL），1 mL 浓度为0.02% 的H2O2 溶液，加入蒸馏水定容至8 mL。在37 ℃恒温水浴锅中水浴加热1 h 后，于510 nm 波长处测量其吸光度。·OH 清除率（A，%）的计算公式如下。
式中：A1 为仅加样品溶液的吸光度；A2 为加H2O2溶液和样品溶液的吸光度；A3 为不加H2O2 和样品溶液的吸光度；A4 为仅加H2O2 溶液的吸光度。
1.2.2.2 超氧自由基清除能力
参照文献[17-18]的方法并稍作修改，向试管中加入5 mL 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl]缓冲液、10µL 样品和5µL 邻苯三酚溶液，摇匀后在分光光度计中测定其在波长325 nm 的吸光度，每30 s 记录一次，共测定7 次。O2-·清除率（G，%）的计算公式如下。
式中：ΔA为仅加待测样品和空白溶液的吸光度（3.5 min 时吸光度与初始时吸光度之差）；ΔA1 为邻苯三酚自氧化吸光度（3.5 min 时吸光度与初始时吸光度之差）；ΔA2 为样品的吸光度（3.5 min 时吸光度与初始时吸光度之差）。
1.2.2.3 DPPH 自由基清除能力
参照文献[19-20]的方法，向试管中加入2 mL DPPH 溶液和2 mL 不同浓度的黄芪提取液（0.8、0.4、0.2 mg/mL），黑暗条件下反应20 min，测定其在波长517 nm 处的吸光度。DPPH·清除率（D，%）的计算公式如下。
式中：A1 为不同浓度的黄芪提取溶液与DPPH 溶液混合液的吸光度；A2 为无水乙醇溶液与DPPH 溶液混合液的吸光度；A3 为4 种不同浓度的不同浓度的黄芪提取溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度。
1.2.3 HPLC 条件
没食子酸流动相：甲醇与水体积比1∶4，流速1 mL/min，柱 温23 ℃，进 样 量10µL，检 测 波 长270 nm，平行进样3 次。
齐墩果酸流动相：乙腈与水体积比9∶1，流速1 mL/min，柱 温23 ℃，进 样 量10µL，检 测 波 长210 nm，平行进样3 次。
山奈酚流动相：甲醇与0.2% 磷酸体积比55∶45，流速1 mL/min，柱温23 ℃，进样量20µL，检测波长370 nm，平行进样3 次。
槲皮素流动相：甲醇与0.2% 磷酸体积比58∶42，流速1 mL/min，柱温23 ℃，进样量20µL，检测波长360 nm，平行进样3 次。
1.2.4 黄芪抗氧化相关成分靶点及通路分析
基于Symmap 数据库（www.symmap.org）以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 进行筛选，获得黄芪活性成分及相关靶点。基于Genecards 数据库（https：//www.genecards.org）检索得到抗氧化的相关靶点。并将上述靶点分别输入到Venny 2.1.0 中（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），筛选出黄芪-抗氧化共有靶点。将黄芪-抗氧化共有靶点输入到Metascape数据库中分别进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，其中P≤0.01。
1.2.5 分子对接
基于Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取所提取成分的SDF 格式，基于PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）获取所筛选靶点的3D 结构，通过Autodock 和PyMOL 软件将提取成分与筛选靶点进行分子对接，获取对接亲和力效果。
1.3 统计分析
所有试验均重复3 次，采用IBM SPSS 26 进行显著性分析和方差分析，P＜0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 黄芪各提取相抗氧化效果研究
黄芪各提取相对·OH、O2-·和DPPH·的清除能力见图1。
图1 黄芪各提取相抗氧化效果
Fig.1 Antioxidant effect of each extract phase of Astragalus
由图1 可知，黄芪各提取相对·OH、O2-·和DPPH·均有一定的清除能力。黄芪各提取相浓度为0.2～1.0 mg/mL 时，黄芪乙酸乙酯相和黄芪氯仿相的清除效果较好，黄芪乙酸乙酯相时对·OH、O2-·和DPPH·的最大清除率分别为31.66%、47.21%和85.36%，黄芪氯仿相 对·OH、O2-·和DPPH·的 最 大 清 除 率 分 别 为38.30%、49.08%和95.64%。
2.2 HPLC 检测黄芪活性成分
黄芪各提取相高效液相色谱图见图2。
图2 各提取相的高效液相色谱图
Fig.2 HPLC diagram of each extract phase
通过HPLC 法绘制标准曲线，回归方程：槲皮素标准曲线y=11 309x+36 215，R2=0.990 4；齐墩果酸标准曲线y=4 654.1x+651 1.2，R2=0.999 8；没食子酸标准曲线y=1 422.6x-5 711.1，R2=0.999 7；山奈酚标准曲线y=66 924x+20 981，R2=0.999 6。
有研究表明没食子酸及其衍生物经电子自旋共振、可见吸收光谱研究等手段检测发现其具有清除自由基和电子转移的能力，并呈现一定的浓度依赖关系[19]。由图2（D）可知，在乙酸乙酯提取相中发现了山萘酚吸收峰，其吸收峰在乙酸乙酯提取相中保留时间为12.152 min，根据峰面积计算得到山奈酚的质量为0.38 g/kg，得率为0.038%。山奈酚具有一定的抗氧化作用，对超氧自由基DPPH·均有一定的清除能力，尤其对DPPH·的清除能力更强，且清除能力随浓度的升高而提高。由图2（F）可知，在石油醚提取相中发现了齐墩果酸吸收峰，其吸收峰保留时间为9.302 min，根据峰面积计算得到齐墩果酸的质量比为6.73 g/kg，得率为0.673%。由图2（H）、图2（I）可知，在黄芪乙酸乙酯相和氯仿相中均存在大量的没食子酸，其吸收峰在氯仿提取相中保留时间为6.359 min，根据计算可得没食子酸的质量比为5.74 g/kg，得率为0.574%；其吸收峰在乙酸乙酯提取相中保留时间为6.457 min，根据峰面积计算得到没食子酸的质量比为5.62 g/kg，得率为0.562%。研究表明药物植物中三萜类化合物具有一定的抗氧化效果，齐墩果酸具有体外清除自由基的效果[20]。抗氧化结果表明：黄芪氯仿相和乙酸乙酯相的抗氧化效果相对较强，这可能是与没食子酸、齐墩果酸和山奈酚的抗氧化作用有关。
2.3 黄芪抗氧化的相关靶点及富集分析
基于网络药理学对黄芪抗氧化相关靶点进行分析，结果见图3～图5。
图3 黄芪-抗氧化蛋白互作分析图
Fig.3 Astragalus-antioxidant protein-protein interaction analysis diagram
图4 黄芪-抗氧化的GO 富集分析图
Fig.4 Astragalus-antioxidant GO enrichment analysis chart
图5 黄芪-抗氧化KEGG 富集分析图
Fig.5 Astragalus-antioxidant KEGG enrichment analysis chart
如图3 可知，筛选得到黄芪活性成分76 个，包括没食子酸、齐墩果酸和山奈酚等，与HPLC 检测结果一致；黄芪的有效靶点为487 个；抗氧化靶点1 048 个；取交集得共有靶点为136 个。在String 数据库中得到靶点互作关系，并用Cytoscape 可视化，颜色越深表明相关性越高。如图4 可知，黄芪主要通过对无机物的反应、激素反应、对细菌来源分子的响应、对外来刺激的反应等多种生物学过程起到抗氧化的作用。如图5可知，黄芪可以通过癌症通路、脂质与动脉粥状硬化、缺氧诱导因子-1 等信号通路进行调控，从而形成抗氧化功能。其中共有24 个靶点富集在缺氧诱导因子-1信号通路上。缺氧诱导因子-1 信号通路是细胞对氧气水平探测和应激系统的重要一环，其能在所有的哺乳动物细胞中起作用[21]。还有48 个靶点聚集在癌症通路上，这也预示着黄芪将有可能通过调节机体的氧化应激损伤来起到治疗癌症的作用[22-23]。
2.4 分子对接
信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3），其被受体相关激酶磷酸化后形成的二聚体能影响细胞的转录，调节白细胞介素-5（interleukin-5，IL-5）、白细胞介素-6（interleukin-5，IL-6）、干扰素（interferon，IFN）、人类细胞生长因子（human growth factor，HGF）等多种因子的表达最终引起细胞的生长或凋亡，氧化应激产物会引起STAT3 在线粒体聚集，激活抗氧化的能力。肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）其编码的蛋白质P53 能通过激发抗氧化活性来降低体内活性氧（reactive oxygen species，ROS），在氧化应激条件下，P53 甚至能引起线粒体内容物的释放，最终诱导细胞周期的停滞、凋亡等。因此，STAT3 和TP53 对于物质的抗氧化能力的测定中起到至关重要的作用。将提取出来的山奈酚、没食子酸和齐墩果酸分别与筛选出来的重要靶点STAT3、TP53 进行分子对接，结果见图6。
图6 山奈酚、没食子酸和齐墩果酸与STAT3、TP53 分子对接结果
Fig.6 Molecular docking results of kaempferol，gallic acid，and oleanolic acid with STAT3 and TP53
由图6 可知，山奈酚与STAT3、TP53 亲和力分别为-7.8、-7.4 kcal/mol，没食子酸与STAT3、TP53 亲和力分别为-8.4、-7.9 kcal/mol，齐墩果酸与STAT3、TP53亲和力分别为-5.7、-6.3 kcal/mol，对接结果均良好。分子对接结果表明，黄芪中活性成分能够起到良好的抗氧化效果。
3 结论
本研究基于网络药理学研究了黄芪抗氧化效果，并采用网络药理学多个线上数据库获取黄芪—抗氧化共有靶点并构建蛋白互作网络以及进行GO 富集分析和KEGG 富集分析。发现黄芪的氯仿相、石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯提取相对·OH、O2-·和DPPH·均有不同程度的清除能力，其中氯仿相、乙酸乙酯相中的抗氧化效果最佳。HPLC 法与网络药理学研究结果共同表明，黄芪的抗氧化活性功能的实现主要是其含有的山奈酚、齐墩果酸、没食子酸等。STAT3、TP53 等多种靶点的相互作用是其抗氧化功能实现的基石。这些靶点大多富集在癌症通路、脂质与动脉粥状硬化、缺氧诱导因子-1 等信号通路上，其中共有24 个靶点富集在缺氧诱导因子-1 信号通路上。因此推测黄芪抗氧化可能用于癌症、动脉粥状硬化等多种疾病的治疗。分子对接结果显示，黄芪中的山奈酚、没食子酸、齐墩果酸与抗氧化的重要靶点结合力很好，这也佐证了黄芪有很好的抗氧化效果。
本研究表明黄芪能够通过多靶点、多通路的途经发挥抗氧化的作用，为黄芪抗氧化的相关研究提供数据支持，有助于后续的黄芪药食两用市场的发展。
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