果实褐变是影响众多品种梨果中长期贮藏的主要生理病害[1]，鸭梨急速降温冷藏30 d 后果心呈现褐变[2]，皇冠梨冷藏期会发生不同程度的褐变[3-4]；冷藏后货架期间南果梨果皮[5]、果心[6]褐变严重。玉露香梨冷藏中后期极易出现果心褐变，且无法被简便地识别，成为限制其果实优质品质呈现的主要影响因素。
抗氧化系统在果实组织褐变中发挥着重要且复杂的作用，酚类物质具有清除自由基的抗氧化性，同时酚类物质的氧化又会引起果实组织褐变[6]；过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）作为果实组织的保护酶，可清除自由基，保持细胞膜的完整性，从而减少氧化的发生[7-8]，但也有研究认为POD 参与酚类物质的代谢，导致果实褐变的发生[9]，酚类物质代谢及保护酶活性变化等因素共同影响果实抗氧化能力，进一步影响果实的衰老褐变。目前，关于玉露香梨采后果心褐变与果实抗氧化能力变化的关系鲜见报道。
果实采收品质对果实贮藏期的生理代谢影响较大，尤其是对梨果实褐变的影响[10-11]。生产性采收均以大量果实的成熟期为标准，分批采收的可行性较低，且多以可溶性固形物含量（soluble solid content，SSC）为参照，为此本研究从果实抗氧化性出发，分析采收时主要品质特性指标可溶性固形物含量对玉露香梨冷藏过程中果心酚类物质、自由基清除能力及保护酶的影响，探究可溶性固形物含量与玉露香梨果心产生褐变的关系，以期为玉露香梨中长期贮藏品质的控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉露香梨：2021 年9 月采自山西省隰县，采收当日运至实验冷库0～2 ℃预冷。选取果型周正，大小均匀，无磕碰伤，无病虫害果实为试材。
绿原酸标准品（96.3%）、熊果苷标准品（99.7%）、儿茶素标准品（95.1%）、芦丁标准品（91.7%）：中国食品药品检定研究院国家标准物质中心；甲醇、乙腈、乙酸（均为色谱纯）：德国默克公司；醋酸钠、冰醋酸、愈创木酚、无水乙醇（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、聚乙烯吡咯烷酮（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；30%过氧化氢溶液、FeCl3、FeSO4·7H2O、三氯乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯胼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；高渗出CO2 保鲜袋：山西龙田保鲜技术有限公司。
1.2 仪器与设备
水果无损伤检测仪（NCS001）：意大利SACMI 公司；高效液相色谱仪（1200）：美国安捷伦公司；水果硬度计（53205）：意大利TR 公司；糖酸度计（PAL-BX/ACID F5）：日本ATAGO 公司；微型低温离心机（5425R）：德国Eppendorf 公司；紫外可见分光光度计（Ultrospec2000）：英国Pharmacic Biotech（Biochrom）公司；分析研磨机（A11BASIC）：德国IKA 公司。
1.3 方法
采用研究前期建立的玉露香梨果实品质参数模型，利用水果无损伤检测仪按照梨果可溶性固形物含量分为3 组：SSC＜11.0%（Ⅰ组）、SSC 11.0%～13.0%（Ⅱ组）、SSC＞13.0%（Ⅲ组），每组60 个果实，重复3 次，高渗出CO2 保鲜袋包装，贮藏温度（0.0±0.5）℃，相对湿度90%左右。定期取样测定相关指标。
1.4 指标测定方法
1.4.1 硬度
取6 个样品果，果实赤道部对称两面去皮，测定深度10 mm，探头直径11 mm，采用水果硬度计测定样品硬度。
1.4.2 果实可溶性固形物及可滴定酸（titratable acid，TA）含量
分别取果心、果肉组织汁液，定量稀释后采用糖酸度计测定SSC 和TA 含量。
1.4.3 果心褐变指数果实沿横径横切，果心褐变分级标准及褐变指数计算参照赵迎丽等[12]的方法。
1.4.4 酚类物质含量
定量称取去核后心室组织，加入一定体积70%的甲醇溶液，超声辅助提取30 min，静置2 h，10 000 r/min离心20 min，取上清液备用。ZORBAX SB-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm），柱温30 ℃，波长280 nm，进样量20µL，流动相：100% 乙腈（A），0.04% 乙酸水溶液（B），梯度洗脱，流速1 mL/min 进行色谱测定。
1.4.5 过氧化物酶活性
过氧化物酶活性参考李英丽等[7]的方法测定，结果以U/g 表示。
1.4.6 过氧化氢酶活性
过氧化氢酶活性参考王蕾等[8]的方法测定，结果以U/g 表示。
1.4.7 DPPH 自由基清除能力
参考Dong 等[13]的方法测定DPPH 自由基清除能力，以DPPH 自由基清除率（%）表示。
1.4.8 铁离子还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）
参考安景舒等[14]的方法测定，FRAP 值以每克样品中含FeSO4 的物质的量表示（µmol FeSO4/g）。
1.5 数据处理
采用Excel 2007 分析数据，SPSS Statistics V17.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果实品质的变化
硬度、可溶性固形物含量和可滴定酸含量是果实重要的品质指标。不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果实品质的变化如表1 所示。
表1 不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果实品质的变化
Table 1 Effect of different SSC on fruit quality of'Yuluxiang'pear
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
组别Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组果实硬度/（kg/cm2）初始3.82a 3.76a 3.61b冷藏240 d 3.61a 3.65a 3.43b SSC/%果肉初始10.70c 12.80b 13.70a冷藏240 d 10.26c 12.36b 13.42a果心初始10.50c 12.30b 13.40a冷藏240 d 10.35c 11.52b 12.91a TA 含量/%果肉初始0.37a 0.34ab 0.29b冷藏240 d 0.24ab 0.26a 0.22b果心初始0.75a 0.69b 0.67b冷藏240 d 0.56b 0.64a 0.59b果心褐变指数（冷藏240 d）8.89a 6.20b 6.70b
由表1 可知，玉露香梨经过240 d 冷藏后，果实硬度下降，其中Ⅰ组和Ⅱ组较Ⅲ组硬度大，且差异显著。采后3 组玉露香梨初始果肉的SSC 略高于果心，240 d冷藏后果肉和果心的SSC 变化幅度不大，Ⅲ组果肉和果心的SSC 仍显著高于其他2 组。采收时不同SSC的玉露香梨果心的TA 含量均较果肉高，冷藏240 d后，Ⅰ组果肉和果心TA 含量下降幅度最大，分别达到了35.13% 和25.33%。玉露香梨冷藏240 d 后，Ⅰ组果心褐变指数为8.89，显著高于其他2 组，Ⅱ组和Ⅲ组间差异不显著。
2.2 不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果心酚类物质含量的变化
冷藏过程中不同可溶性固形物含量玉露香梨果心酚类物质含量的变化见图1。
图1 冷藏期间不同可溶性固形物含量玉露香梨果心酚类物质含量的变化
Fig.1 Changes in phenolic substances in core of'Yuluxiang'pear with different soluble solid content during cold storage
由图1 可知，贮藏开始时熊果苷含量依次为Ⅰ组（951.49 mg/kg）、Ⅱ组（893.51 mg/kg）、Ⅲ组（849.89 mg/kg）；随后3 组均呈缓慢下降的趋势，到240 d，Ⅰ组降幅最高，达38.37%，其次为Ⅱ组（26.16%）、Ⅲ组（22.16%）。贮藏初期玉露香梨果心绿原酸含量呈升高的趋势，Ⅰ组、Ⅲ组绿原酸峰值出现在60 d，Ⅱ组则在120 d 达到峰值，随后下降；贮藏180、240 d，Ⅱ组果心绿原酸含量较其他2 组高，且差异显著。果心儿茶素含量在入贮时较低，冷藏后逐步升高；120 d 后呈下降的趋势，Ⅱ组儿茶素含量在120、240 d 均较其他2 组含量高，且差异显著。芦丁含量随贮藏时间延长呈下降的趋势，Ⅰ组和Ⅱ组在冷藏60 d 呈现小幅增加，120 d 后缓慢下降；Ⅲ组在180 d 缓慢增加后下降；240 d 时，Ⅱ组芦丁含量显著高于Ⅰ组和Ⅲ组。
2.3 不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果心POD 和CAT 活性的变化
POD 可清除果实体内的活性氧，从而保护细胞的完整性。不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期POD 和CAT 活性的变化见图2。
图2 冷藏期间不同可溶性固形物含量玉露香梨果心POD 和CAT活性的变化
Fig.2 Changes in POD and CAT activities in core of'Yuluxiang'pear with different soluble solid content during cold storage
由图2 可知，贮藏开始时，果心POD 活性高低依次为Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅰ组。冷藏期间3 组不同可溶性固形物含量玉露香梨果心POD 活性整体均呈现下降的趋势，120 d 时，Ⅰ组果心POD 活性显著低于Ⅱ组、Ⅲ组果心POD 活性，果实体内清除自由基的能力随之减弱。不同可溶性固形物含量玉露香梨果心CAT 活性在贮藏前期急剧上升，Ⅰ组、Ⅲ组在冷藏120 d，Ⅱ组在180 d 达到最大值后逐渐下降。在贮藏120 d 时，Ⅰ组果心CAT 活性显著高于Ⅱ组和Ⅲ组果心CAT 活性。Ⅲ组果心CAT活性在180 d 和240 d 较Ⅰ组高但差异不显著。Ⅱ组果心CAT 活性在180 d 和240 d 均显著高于其他2 组。
2.4 不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果心抗氧化能力的变化
冷藏期间不同可溶性固形物含量玉露香梨冷藏期果心抗氧化能力的变化见图3。
图3 冷藏期间不同可溶性固形物含量玉露香梨果心抗氧化能力的变化
Fig.3 Changes in antioxidant capacity in core of'Yuluxiang'pear with different soluble solid content during cold storage
由图3A 可知，贮藏开始时，Ⅲ组玉露香梨果心DPPH 自由基清除率略高，其次为Ⅱ组和Ⅰ组。随贮藏时间的延长，3 组不同可溶性固形物含量玉露香梨果心DPPH 自由基清除率呈现缓慢上升后逐渐下降的趋势。贮藏至120～240 d 时，Ⅱ组、Ⅲ组果心DPPH 自由基清除率较Ⅰ组高且差异显著。Ⅱ组与Ⅲ组之间仅180 d差异显著。不同可溶性固形物含量玉露香梨果心FRAP 值在贮藏开始后缓慢上升，Ⅲ组在60 d 后缓慢下降，但降幅不明显（图3B）。Ⅰ组和Ⅱ组在冷藏120 d达到峰值18.11µmol FeSO4/g 和20.04µmol FeSO4/g 后下降，Ⅰ组下降速度较快，贮藏后期240 d 时，Ⅱ组果心FRAP 值显著高于Ⅰ组及Ⅲ组果心FRAP 值，延缓了果实氧化的过程。
2.5 果心酚类物质与抗氧化能力相关性分析
玉露香梨果心几种酚类含量与保护酶活性及抗氧化能力相关性分析结果见表2。
表2 果心酚类物质与抗氧化能力相关性分析
Table 2 Correlation analysis between phenolic substances in fruit core and antioxidant ability
注：*表示存在显著相关（P＜0.05）；**表示存在极显著相关（P＜0.01）。
参数熊果苷含量绿原酸含量儿茶素含量芦丁含量CAT 活性POD 活性DPPH 自由基清除率FRAP 值熊果苷含量1 0.655-0.736 0.369-0.892*0.668-0.627-0.611绿原酸含量1 0.024 0.837-0.288 0.877 0.076 0.194儿茶素含量1 0.299 0.898*-0.145 0.867*0.973**芦丁含量1-0.098 0.567 0.078 0.404 CAT 活性1-0.265 0.849 0.865 POD 活性1 0.002 0.078 DPPH 自由基清除率1 0.864 FRAP 值1
由表2 可知，熊果苷含量与DPPH 自由基清除率和FRAP 值呈负相关，与CAT 活性相关系数为-0.892，呈显著负相关。绿原酸和芦丁含量与CAT 活性均呈负相关，与POD 活性、DPPH 自由基清除率和FRAP 值呈正相关。儿茶素含量与CAT 活性相关系数为0.898，呈显著正相关，与FRAP 值相关系数为0.973，呈极显著正相关。保护酶活性与抗氧化能力的分析表明，CAT活性与DPPH 自由基清除率及FRAP 值呈正相关，相关系数达0.849 和0.865。POD 活性与DPPH 自由基清除率及FRAP 值也呈正相关，但相关系数较低。
3 讨论与结论
不同品系梨果酚类物质的研究表明，绿原酸、熊果苷等是梨果主要酚类物质[15-16]。而作为氧化底物果实酚类物质，在冷藏过程中其含量及代谢直接影响果实褐变的发生[16-18]，苏艳丽等[15]对易褐变品种梨特性研究发现其总酚、总酸含量均高于不易褐变品种。另有研究表明褐变敏感梨品种绿原酸含量较不敏感品种高[19]，试验结果表明，玉露香梨果实SSC 含量相对低的Ⅰ组（SSC＜11.0%），贮藏开始时果心绿原酸、熊果苷含量较其他2 组含量高，且作为氧化底物的酚类物质降幅较大，冷藏240 d 后其抗氧化能力较低，果心褐变指数较Ⅱ组和Ⅲ组高。
果实褐变的原因之一是衰老导致果实抗氧化能力减弱，自由基产生和清除的动态平衡被打破，CAT 和POD 是参与组织清除自由基的抗氧化系统的关键酶。贮藏过程中，果实POD 活性呈现下降的趋势，且Ⅰ组（SSC＜11.0%）果心POD 活性一直处于较低水平，CAT活性也在贮藏前期快速上升后下降，推测与前期启动清除代谢过程中产生的活性氧有关。相比较，Ⅱ组（SSC 11.0%～13.0%）延缓了POD 活性的下降，CAT 峰值出现较晚，且冷藏后期保持较高的活性，减缓了果心褐变的发生。这与王蕾等[8]的研究结果一致，壳聚糖涂膜和抗坏血酸处理延缓了皇冠梨果皮中过氧化氢酶下降趋势，在提高过氧化物酶活性的同时减轻了黄冠梨果皮褐变的程度。Ⅱ组在贮藏后期其清除DPPH 自由基能力和FRAP 抗氧化能力相对较高，相关性分析表明，清除DPPH 自由基能力、FRAP 抗氧化能力与CAT 活性的相关性系数分别为0.849、0.865，与POD活性呈正相关，但相关系数较低。推测与过氧化物酶作为保护酶，在清除H2O2 的同时，参与酚类物质的氧化过程有关[20]。DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力与儿茶素的含量显著相关，与芦丁、绿原酸的含量正相关但相关系数较低，与熊果苷的含量呈负相关。有研究表明多酚含量与抗氧化活性呈显著相关关系[7，21-22]，Ⅰ组虽含有较高的酚类物质含量，但抗氧化能力在贮藏后期下降，推测其更多作为氧化底物参与反应，含量对果实褐变影响较大有关[16]。梨果实抗氧化能力与品种[15，23]、抗氧化物质的组成[24]、含量及采后代谢密切相关，是复杂的动态变化的过程，其作用机理有待进一步深入。
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