灵芝（Ganoderma lucidum）是多孔菌科药食两用真菌，具有滋身强体、扶正固本效用[1]。灵芝食用药用历史悠久，可用于鲜食、泡酒、泡茶、煲汤、入药等[2]，随着灵芝被列为药食同源食品起，其在食品行业的应用更加广泛，深受消费者青睐。灵芝孢子粉是灵芝的生殖细胞，是灵芝子实体发育成熟后期释放出的种子，是灵芝的精华。灵芝孢子中含有丰富的多糖类、萜类、生物碱类、氨基酸多肽类、脂肪酸等活性成分，常被用作保健食品，具有提高免疫力、延缓衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖、保肝护肝等作用[3-5]。灵芝多糖是灵芝孢子粉中最主要的活性物质之一，生理作用及功效较显著，是研究的热点[6]。
目前，已分离出200 多种灵芝多糖，主要分为葡聚糖和杂多糖两大类，其中，葡聚糖主要是通过（1→3）、（1→4）、（1→6）-α/β 糖苷键连接组成；杂多糖主要由葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）组成，还含有木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannose，Man）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、岩藻糖（fucose，Fuc）、氨基糖等，通过α-或β-糖苷键连接[7]。从灵芝菌丝体、子实体、孢子中均可以提取得到灵芝多糖，但是从不同部位提取的灵芝多糖在含量及单糖组成上均有差异[8]，灵芝孢子多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖和甘露糖等单糖组成[9]。灵芝多糖的提取方法有多种，主要包括微波辅助法、亚临界水提取法、复合酶法、高压热水法、超声辅助提取法、回流提取法等；提取溶剂也有多种，包括水、稀酸、稀碱、低共熔溶剂；传统的水提醇沉法具有操作方法简单、不引入新的溶剂或酶、对设备要求低、安全等优点[10-13]，是目前较受欢迎的一种提取方式。
本试验以破壁灵芝孢子粉为原料，灵芝孢子粗多糖含量为指标，对比常温水浸提、常温超声辅助水提取以及沸水回流提取，筛选出最适提取方法并进行响应面优化，以期获得破壁灵芝孢子粉最佳提取工艺；通过对比破壁前后灵芝孢子粉中灵芝粗多糖的单糖组成、DPPH 自由基清除能力、多糖结构等，以期为灵芝孢子产品的综合开发提供技术指导和理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灵芝孢子粉（水分含量约12%）：湖南省宜章县福城生物科技开发有限公司。
无水乙醇、苯酚、七水合硫酸锌、葡萄糖、无水硫酸钠、乙酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、甲醇（均为色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖（均为标准品）：索莱宝生物科技有限公司；甘露糖、果糖（fructose，Fru）、岩藻糖、核糖（ribose，Rib）、甘露糖醛酸（mannuronic acid，Man-UA）（均为标准品）：上海源叶生物科技有限公司；鼠李糖标准品：成都乐美天医药科技有限公司；半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal-UA）标准品：美国阿拉丁工业公司；葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc-UA）标准品：润友化学有限公司；古罗糖醛酸（guluronic acid，Gul-UA）标准品：上海瀚香生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JCWF-50 型超微粉碎机：济南骏程机械设备有限公司；Eco-S15 纯水机：上海和泰仪器有限公司；KQ5200DE 型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；300G 型真空干燥器：日本亚速旺公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Blue-Star A 紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；TG16-WS 离心机：湖南迈克尔实验仪器科技有限公司；XH-C 涡旋混合器：江苏金怡仪器科技有限公司；GZX-6246 MBE 电热恒温鼓风干燥箱、YSQ-LS-50S11 立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；FA 2004 C 电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；DL-1 万用电炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SCIENTZ-10N 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；Thermo ICS5000 离子色谱仪、TS-18825 氮吹仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 常温水浸提
称取10 g 破壁灵芝孢子粉，按料液比1∶20（g/mL）加入超纯水，常温静置提取24 h，抽滤，滤液备用。采用苯酚硫酸法测定粗多糖含量。
1.3.2 常温超声辅助水提取
称取10 g 破壁灵芝孢子粉，按料液比1∶20（g/mL）加入超纯水，常温超声（200 W，40 kHz）辅助提取4 h，抽滤，滤液备用。采用苯酚硫酸法测定粗多糖含量。
1.3.3 沸水回流提取
称取10 g 破壁灵芝孢子粉，按料液比1∶20（g/mL）加入超纯水，沸水浴回流提取4 h，抽滤，滤液备用。采用苯酚硫酸法测定粗多糖含量。
1.3.4 单因素试验
按1.3.2 步骤，考察不同超声温度（30、50、70 ℃）、超声时间（2、4、8 h）对灵芝孢子粗多糖含量的影响。
1.3.5 响应面优化
根据单因素试验结果，选取超声温度、超声时间为影响因素，以灵芝粗多糖含量为响应值，利用中心组合设计（central composite design，CCD）建立超声辅助水提取法与灵芝孢子粗多糖含量的响应面模型，试验因素编码及水平如表1 所示。
表1 CCD 试验因素编码及水平
Table 1 Codes and levels of factors of central composite design（CCD）
水平-α-1 0 1 α X1 超声温度/℃35.858 40 50 60 64.142 X2 超声时间/h 5.172 6 8 10 10.828
利用Design-Expert 12 软件设计试验方案，并分析数据，优化超声辅助水提取灵芝粗多糖的最佳工艺条件。
1.4 指标测定方法
1.4.1 灵芝孢子粗多糖含量测定方法
标准曲线绘制：以葡萄糖标准溶液为对照，配制0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 葡萄糖标准溶液，分别吸取不同浓度的葡萄糖标准溶液1 mL 置于25 mL 比色管中，加水至2 mL，加入5% 苯酚溶液1 mL、浓硫酸10 mL，沸水浴放置2 min 冷却至室温，加水定容至25 mL，测定各浓度葡萄糖溶液经苯酚-硫酸处理后在489 nm 波长处的吸光度，绘制标准曲线。
灵芝孢子粗多糖含量的测定：取灵芝孢子粉提取后的滤液10 mL，加入40 mL 无水乙醇，混匀，-20 ℃冰箱放置2 h，取出，3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，残渣用80% 乙醇洗涤，3 000 r/min 离心10 min（重复此过程2 次），剩余残渣用10 mL 2 mol/L 硫酸溶解后加水定容至25 mL，试验设置3 个平行。取1 mL 以上定容后的溶液于25 mL 比色管中，按以上葡萄糖标准溶液的处理方式处理后，待测溶液的吸光度，通过标准曲线测算出灵芝孢子粗多糖含量。
1.4.2 灵芝孢子粗多糖纯度测定
将孢子粉提取后的滤液60 ℃水浴旋蒸至20 mL左右，按4∶1（体积比）加入无水乙醇，-20 ℃醇沉4 h以上，3 000 r/min 离心10 mm 弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤，3 000 r/min 离心10 min（重复此过程2 次），剩余残渣，冷冻干燥后，研磨成粉末，备用。
称取以上灵芝孢子粗多糖粉末m0（g）（精确至0.000 1 g），加水定容至10 mL，按1.4.1 中方法测定灵芝孢子粗多糖含量mi（g），灵芝孢子粗多糖纯度（L，%）计算公式如下。
1.4.3 纯灵芝孢子多糖含量的测定
纯灵芝孢子多糖含量（D，mg/g）计算公式如下。
D = C × L
式中：C 为灵芝孢子粗多糖含量，mg/g；L 为灵芝孢子粗多糖纯度，%。
1.4.4 灵芝孢子单糖组分及含量测定
取1.4.2 中灵芝孢子粗多糖粉末0.01g（精确至0.000 1g）至玻璃试管中，加入1 mL 2 mol/L TFA 溶液，121 ℃加热2 h。通氮气，吹干。加入99.99% 甲醇清洗，再氮吹至干，重复甲醇清洗2～3 次，氮吹至干后，加入1 mL 无菌水溶解，过膜，待测。
灵芝孢子单糖含量利用离子色谱仪进行测定。色谱柱：DionexTM CarboPacTM PA20（150 mm×3.0 mm，10µm）；流动相A 为H2O，流动相B 为0.1mol/L 氢氧化钠溶液，流动相C 为0.1 mol/L NaOH、0.2 mol/L 乙酸钠溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：电化学检测器；进样体积：5µL。洗脱梯度：0 min A 相/B 相/C 相（95∶5∶0，体积比），26 min A 相/B 相/C 相（85∶5∶10，体积比），42 min A 相/B 相/C 相（85∶5∶10，体积比），42.1 min A 相/B 相/C 相（60∶0∶40，体积比），52 min A相/B 相/C 相（60∶40∶0，体积比），52.1 min A 相/B 相/C相（95∶5∶0，体积比），60 min A 相/B 相/C 相（95∶5∶0，体积比）。
1.4.5 DPPH 自由基清除能力测定
取2 mL 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的样品，加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，在暗处反应30 min，在517 nm 处测得吸光度A1。相同条件下用无水乙醇代替DPPH 溶液测得吸光度为A2，用无水乙醇代替样品液测得吸光度为A3。按照下式计算DPPH自由基清除率（E，%）。
1.4.6 傅立叶红外光谱分析（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）
分别取适量未破壁、破壁后的灵芝孢子粉，按响应面优化得到的最优条件提取得到灵芝孢子粗多糖粉末，取少量灵芝孢子粗多糖粉末与KBr 研磨均匀后压片，在4 000～500 cm-1 进行红外光谱扫描分析。
1.5 数据处理
采用SAS 8.1 和Microsoft Excel 2010、Design-Expert 12 分析整理数据，Origin 8.0 制图。
2 结果与分析
2.1 灵芝孢子粗多糖提取优化
2.1.1 不同提取方式对灵芝孢子粗多糖含量的影响不同提取方式下灵芝孢子粗多糖含量见表2。
表2 不同提取方式下灵芝孢子粗多糖含量
Table 2 Content of crude polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum spore by different extraction methods
注：不同字母表示存在显著差异（p＜0.05）。
提取方式常温水浸提常温超声辅助水提取沸水回流提取粗多糖含量/（mg/g）12.797±0.815b 15.178±0.593a 15.543±0.569a
由表2 可知，常温超声辅助水提取和沸水回流提取获得的灵芝孢子粗多糖含量分别比常温水浸提提高18.606% 和21.458%。覃海元等[14]对比热水提取与超声辅助提取鹿角灵芝多糖提取率，在最佳工艺条件下，超声波提取率是热水提取率的1.37 倍。本研究中沸水回流提取获得的灵芝孢子粗多糖含量较常温超声辅助水提取提高2.40%，但两者间并不存在显著性差异，可能是品种以及试验工艺条件差异所致[15]。因此，选取常温超声辅助水提取进行后续提取条件优化。
2.1.2 超声辅助水提取单因素试验
不同超声温度、超声时间下提取的灵芝孢子粗多糖含量见图1。
图1 不同超声温度、超声时间下灵芝孢子粗多糖含量
Fig.1 Content of crude polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum spore at different ultrasonic temperatures and different ultrasonic time
由图1A 可知，超声温度与灵芝孢子粗多糖的提取效果之间存在一定的相关性，灵芝孢子粗多糖含量随着超声温度的升高呈先增加后减小的趋势，与黄生权等[16]的研究结果一致；在超声温度为50 ℃时，其灵芝孢子粗多糖的含量达到最大，为（15.439±0.155）mg/g，较30 ℃提取条件下提高8.086%。因此，选取超声温度40、50、60 ℃进行后续优化试验。
由图1B 可知，超声时间与灵芝孢子粗多糖的提取效果之间存在显著相关性，在超声时间2～8 h 范围内，灵芝孢子粗多糖含量随着超声时间的延长而增加，在超声时间为8 h 时，其灵芝孢子粗多糖的含量达到最大，为（15.934±0.087）mg/g，较4 h 时提高5.453%。因此，选取常温超声时间6、8、10 h 进行后续提取条件优化。
2.1.3 超声辅助水提取灵芝孢子粗多糖的响应面试验优化
试验方案与结果见表3，模型的方差分析见表4。
表3 CCD 试验方案与结果
Table 3 Plan and results of central composite design
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 X1/℃50 50 50 35.858 60 50 50 64.142 40 50 60 40 50 X2/h 5.172 8 8 8 6 8 8 8 1 0 8 1 0 6 10.828灵芝孢子粗多糖含量/（mg/g）试验值15.366 15.778 15.842 13.799 15.158 15.842 16.086 15.309 13.463 15.156 15.502 12.834 15.297预测值14.824 15.731 15.731 13.054 15.372 15.731 15.731 15.356 13.960 15.732 15.443 13.601 15.131
表4 模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance of the model
注：**和*分别表示在0.01 和0.05 水平下该因素有极显著和显著影响。
项目模型X1 X2 X1X2 X12 X22残差失拟项纯误差总误差平方和9.99 5.28 0.095 8 0.020 3 4.06 0.978 9 2.30 1.75 0.548 5 12.29自由度5 1 1 1 1 1 7 3 4 12均方2.00 5.28 0.095 8 0.020 3 4.06 0.978 9 0.328 8 0.584 4 0.137 1 F 值6.08 16.05 0.291 3 0.061 8 12.34 2.98 4.26 p 值0.017 4 0.005 1 0.606 1 0.810 9 0.009 8 0.128 1 0.097 6显著性*****
2.1.3.1 模型建立与方差分析
以编码值表示的响应面模型的二次回归方程为Y=15.73+0.812 3X1+0.109 4X2-0.071 2X1X2-0.763 9X12-0.375 1X22。
由表4 可知，模型的F 值为6.08，p 值为0.017 4（p＜0.05），表明模型显著；模型失拟项F 值4.26，p 值为0.097 6（p＞0.05），表明失拟项不显著，说明模型合理，可以用模型的响应值代替试验值。X1、X2 的p 值分别为0.005 1、0.606 1，说明X1 为极显著影响因素，X2 为不显著影响因素；X1 X2 的p 值分别为0.810 9，说明X1 X2 的交互效应不显著；X12、X22 的p 值分别为0.009 8、0.128 1，说明X12 的影响极显著，X22 的影响不显著。
2.1.3.2 超声温度与超声时间交互作用的响应面分析
灵芝孢子粗多糖含量的等高线图和响应面图如图2 所示。
图2 超声温度与超声时间的交互作用
Fig.2 Interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic time
由图2 可以看出，等高线接近椭圆形，说明X1、X2的交互作用显著；但从表4 可知，p（X1X2）=0.810 9＞0.05，说明超声温度与超声时间之间的交互作用不显著。上述两种方法获得的结果相矛盾，这可能是因为p 值的大小仅表示试验数据在统计学上是否显著，不能完全代表在实际案例中的显著性。在实际应用中需将p 值与实际问题结合考虑。因此，在本研究中可以根据等高线趋近于椭圆形说明超声时间与超声温度的交互作用显著。图2 表明，当超声时间不变时，灵芝孢子粗多糖含量随着超声温度的升高先增加后减小，超声温度越高，灵芝孢子粗多糖在超声作用下的溶出能力越强，但随着超声温度的进一步升高，灵芝孢子粗多糖可能会分解[17]。在超声温度相同的情况下，灵芝孢子粗多糖含量随着超声时间的延长先增加后有下降趋势，原因可能是长时间的高温提取导致部分灵芝孢子多糖分解，说明超声温度对灵芝孢子粗多糖含量的影响更大，这与表4 中p（X1）=0.005 1（＜0.01）相符合，超声温度对提取的灵芝孢子粗多糖含量有极显著影响。
2.1.3.3 优化工艺验证试验结果
利用Design-Expert 12 软件对试验模型进行进一步典型性分析，得出最佳提取工艺：超声温度为55.270 1 ℃（55 ℃），超声时间为8.138 95 h（8 h），预测灵芝孢子粗多糖含量为15.949 4 mg/g。在此条件下进行重复试验3 次，得出灵芝孢子粗多糖含量为（15.873±0.746）mg/g，与预测值相对偏差0.479%，说明此优化工艺可行。
2.2 破壁前后灵芝孢子粗多糖含量、纯度及DPPH 自由基清除率的对比
破壁前后灵芝孢子粗多糖含量及纯度测定见表5。
表5 破壁前后灵芝孢子粗多糖含量及纯度
Table 5 Content and purity of polysaccharides from Ganoderma lucidum spore before and after wall breaking
注：同列不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
组别未破壁灵芝孢子粉破壁灵芝孢子粉灵芝孢子粗多糖含量/（mg/g）4.761±0.195b 15.873±0.746a灵芝孢子多糖纯度/%82.899±4.064a 66.404±1.377b
由表5 可知，破壁与否对灵芝孢子粗多糖含量及多糖纯度均存在显著性影响。破壁后的灵芝孢子粉，其粗多糖含量较未破壁样品提升233.396%；但是较未破壁的灵芝孢子粉样品，破壁后的灵芝孢子多糖纯度却显著性下降，原因是孢子粉破壁后，孢内多糖、蛋白质、三萜类等多种有效功能成分溶出，提取出的水溶性成分增多，经醇沉处理后，有大量蛋白也会沉淀出来，本试验中未对醇沉沉淀物中的灵芝多糖进行纯化处理，因此其多糖纯度会显著性下降。未破壁灵芝孢子粉及破壁灵芝孢子粉经超声辅助水提取得到的纯灵芝孢子多糖含量分别为3.947、10.540 mg/g，破壁处理后，纯灵芝孢子多糖含量增加167.038%。
破壁前后灵芝孢子多糖DPPH 自由基清除率对比见图3。
图3 破壁前后灵芝孢子多糖DPPH 自由基清除率对比
Fig.3 DPPH free radical scavenging of polysaccharides from Ganoderma lucidum spore before and after wall breaking
由图3 可知，随着测试样品中纯灵芝孢子多糖含量的增加，DPPH 自由基清除率逐渐增大，且破壁样品的增加速率明显高于未破壁样品，当未破壁样品纯灵芝孢子多糖质量为2.487 mg 时，其DPPH 自由基清除率达（80.544±2.071）%，而破壁样品纯灵芝孢子多糖质量为1.992 mg 时，其DPPH 自由基清除率已达（84.300±0.965）%。原因是破壁灵芝孢子粉虽然灵芝孢子多糖的纯度较未破壁灵芝孢子粉低，但由于破壁处理释放出更多的有效功能成分，包含多糖类、三萜类、核苷类、生物碱类、维生素类、油脂类、矿物质类等，这其中多种成分具有抗氧化功能，因此纯度较低的破壁灵芝孢子粉的灵芝孢子粗多糖较纯度较高未破壁灵芝孢子粉的灵芝孢子粗多糖的抗氧化能力更强。
2.3 破壁前后灵芝孢子粗多糖的主要单糖组成对比
灵芝孢子粉破壁前后提取灵芝孢子粗多糖中单糖组成及含量见表6。
表6 灵芝孢子粉破壁前后提取灵芝孢子粗多糖中单糖组成及含量
Table 6 Monosaccharide composition and content of polysaccharides from Ganoderma lucidum spore before and after wall breaking
注：ND 表示未检出。
名称岩藻糖（Fru）鼠李糖（Rha）阿拉伯糖（Ara）半乳糖（Gal）葡萄糖（Glc）木糖（Xyl）甘露糖（Man）果糖（Fru）核糖（Rib）半乳糖醛酸（Gal-UA）古罗糖醛酸（Glu-UA）葡萄糖醛酸（Glc-UA）甘露糖醛酸（Man-UA）灵芝孢子粗多糖中单糖含量/（mg/g）未破壁灵芝孢子粉1.985±0.066 ND ND 20.114±0.792 503.123±2.505 ND 16.824±0.264 ND ND ND ND 0.747±0.041 ND破壁灵芝孢子粉27.177±0.934 ND ND 110.701±2.508 429.367±7.063 ND 32.878±0.998 ND ND ND ND 0.823±0.003 ND纯灵芝孢子多糖中单糖含量/（mg/g）未破壁灵芝孢子粉2.394±0.080 ND ND 24.263±0.955 606.903±3.022 ND 20.294±0.318 ND ND ND ND 0.901±0.049 ND破壁灵芝孢子粉42.436±1.406 ND ND 166.719±3.097 646.637±10.637 ND 49.515±1.502 ND ND ND ND 1.240±0.004 ND
由表6 可知，破壁灵芝孢子粉与未破壁灵芝孢子粉在单糖组成上没有差异，主要单糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖，结果与张芝华[18]的研究一致；但是微量单糖的种类之间存在差异。江和栋等[9]研究发现灵芝孢子多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，不同产地的单糖含量之间存在差异，以来自安徽的S5 样品为例，6 种单糖含量分别为（1.022±0.022）、（5.060±0.142）、（2.260±0.015）、（6.918±0.443）、（12.032±0.687）、（3.990±0.169）mg/g。本研究中破壁前后灵芝孢子中提取灵芝孢子粗多糖由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸5 种单糖组成，其单糖含量的分别为1.985、20.114、503.123、16.824、0.747 mg/g和27.177、110.701、429.367、32.878、0.823 mg/g，各单糖含量分别增加1 269.118%、450.368%、-14.660%、95.423% 和10.174%，其中岩藻糖、半乳糖、甘露糖含量在破壁后大幅度提升，而葡萄糖含量在破壁后有所下降，原因在于破壁后的灵芝孢子提取的灵芝孢子粗多糖中含有蛋白质、氨基酸、三萜等大量杂质，导致灵芝孢子多糖的纯度降低。结合表5，经换算得到所测定单糖在纯灵芝多糖的占比及含量，破壁前后灵芝孢子中提取灵芝孢子粗多糖中岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸5 种单糖的含量分别为2.394、24.263、606.903、20.294、0.901 mg/g 和42.436、166.719、646.637、49.515、1.240 mg/g，各单糖含量分别增加1 672.598%、587.133%、6.547%、143.988% 和37.625%。梁琰等[19]采用超声辅助酸解-超高效液相色谱-电雾式检测器测定灵芝子实体中多糖的单糖组成，结果表明，子实体灵芝多糖中，木糖和阿拉伯糖的含量较高，其值分别为（27.25±0.67）、（11.99±0.29）mg/g；而甘露糖和葡萄糖的含量则较低，其值分别为（0.45±0.01）、（0.85±0.04）mg/g。本研究进一步证实灵芝子实体多糖的单糖组成和含量与灵芝孢子多糖的组成和含量之间存在差异，两者之间的活性成分及功效不完全相同[20-21]。
2.4 破壁前后灵芝孢子粗多糖结构组成分析
为了进一步确定破壁对灵芝孢子粗多糖组成和结构的影响，分别对破壁前后的灵芝孢子粗多糖进行红外光谱分析，结果如图4 所示。
图4 破壁前后灵芝孢子粗多糖红外光谱
Fig.4 Infrared spectrum of crude polysaccharides from Ganoderma lucidum spore powders before and after wall breaking
由图4 可知，对比破壁与未破壁灵芝孢子粉提取的灵芝孢子粗多糖，两者在峰形、峰数、峰位上的一致性较高。3 380 cm-1 处出现较强的吸收峰，为O—H 伸缩振动[15]；2 928、2 853 cm-1 处出现的较强尖峰，是甲基—CH3 和亚甲基—CH2 的C—H 伸缩振动吸收峰[22]；1 648 cm-1 为糖醛酸中羧基的伸缩振动吸收峰[23]，峰强度越高，说明多糖含量高，与2.2 中研究结果一致；1 417、898 cm-1 处的吸收峰，可推断灵芝孢子多糖是含有D-吡喃葡萄糖环的多糖，该多糖由β-糖苷键连接[24]；1 378 cm-1 处出现的峰可能是因为—COOH 的羰基双键伸缩振动或者C—H 的变角运动引起的，由此推断灵芝多糖中含有羟基和氨基或亚氨基键，说明多糖中可能含有蛋白质成分[25]。
3 结论
灵芝孢子经破壁处理能释放大量的活性物质，灵芝多糖是主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫力等多种功效。水提醇沉法是提取灵芝孢子多糖最简单也是最常用的方法，本研究以灵芝孢子粗多糖含量为指标，对比常温水浸提法、常温超声辅助水提取法和沸水回流提取法，结果发现常温超声辅助水提取与沸水回流提取获得的灵芝孢子粗多糖含量分别比常温水浸提提高18.606% 和21.458%，沸水回流提取获得的灵芝孢子粗多糖含量较常温超声辅助水提取提高2.40%，但两者间并不存在显著性差异，因此选取超声辅助水提取法进行后续工艺优化。通过单因素试验、响应面优化试验，确定灵芝孢子粗多糖超声辅助水提取的最佳工艺参数：超声温度为55 ℃，超声时间为8 h，此工艺条件下提取的灵芝孢子粗多糖含量为（15.973±0.746）mg/g。采用离子色谱法测定破壁前后灵芝孢子粉提取得到的灵芝孢子粗多糖中的单糖含量及组成，结果表明两者在单糖组成上没有差异，主要组成单糖包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸，但在含量上存在显著性差异，特别是岩藻糖、半乳糖和甘露糖，破壁后分别提高1 269.118%、450.368%、95.423%。对比两种灵芝孢子多糖对DPPH 自由基的清除能力，结果表明：虽然破壁后的灵芝孢子提取的灵芝孢子粗多糖纯度仅为66.404%，但其DPPH 自由基清除率达（84.300±0.965）%，说明破壁灵芝孢子的抗氧化能力更强。红外光谱结果显示，灵芝孢子粗多糖含有D-吡喃葡萄糖环的多糖。
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