蔬菜、水果等食品易随时间的推移氧化变质，诱导机体产生疾病，因此添加抗氧化剂成为常见的有效应对手段。随着人们对食品安全的不断重视，合成抗氧化剂的毒副作用日渐凸显，寻找可以应用在食品、保健品中并具有显著抗氧化作用的天然抗氧化剂已成为目前食品开发的研究热点[1]。荔枝草为唇形科鼠尾草属植物雪见草的全草，又名土荆芥、癞子草等，其作为一种药用植物，广泛分布于多个国家和地区，资源十分丰富，具有极高的营养价值和开发前景[2-3]。荔枝草具有清热解毒、止咳平喘、抗氧化、抗炎镇痛等功效，主要含有总黄酮、多酚、多糖、三萜、挥发油和微量元素等[4-5]。总黄酮类化合物作为荔枝草最主要的有效成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、调节免疫等功效[6]，而其最突出的生物活性就是抗氧化能力，因此研究荔枝草总黄酮的抗氧化活性有望为天然抗氧化剂的研发提供优质的天然植物资源。
目前，提取总黄酮的方法涉及有机溶剂萃取法、超声辅助提取法和微生物发酵法等，其中，微生物发酵法是利用微生物将中药的一些大分子物质如糖类、脂肪、蛋白质[7]等分解、释放出来，可以通过降解植物细胞壁成分，促进有效成分的溶出及成分间的转化，改变植物原有特性，增加或产生新的药效，甚至降低毒性[8]。为了使微生物发酵发挥出较好的作用效果，最关键的因素就是选择菌种，酵母菌作为最早使用的微生物，与人类有着非常密切的关系，其代谢产生的各种成分可以促进肠道中有益菌的繁殖，通过直接或间接作用维持肠道微生态平衡[9-10]，在微生物发酵中应用较为广泛。
当前，微生物发酵主要分为液态发酵和固态发酵两种类型，液态发酵存在生产成本高和污染环境的缺点，固态发酵的优点体现在产物的品质好、活性高、生产工艺简单、投资低及废弃物少、污染小[11-12]。目前有关荔枝草的开发仅仅起步于与其他植物配伍成茶饮或复合功能饮料[13-15]，尚未有采用酵母菌固态发酵的相关研究。因此，本研究首次利用酵母菌对荔枝草进行固态发酵，通过适应性研究，对固态发酵工艺进行设计与优化，测定发酵前后荔枝草总黄酮含量及其抗氧化活性，以期为天然氧化剂的研发提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与菌种
荔枝草（Salvia plebeia R.Br.）全草：采自安徽六安，采集时间2022 年9 月6 日，植物标本（TCM-SP-20220906）存放至天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室。高活性干酿酒酵母菌HY2204：安琪酵母股份有限公司。
1.2 主要试剂
酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、D-无水葡萄糖、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（均为优级纯）、芦丁标准品（分析纯）、羟自由基清除能力检测试剂盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力检测试剂盒、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]正离子自由基清除能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯）：天津市津科精细化工研究所；无水乙醇（分析纯）：天津市江天化工技术股份有限公司。
1.3 仪器与设备
UH5300 紫外可见分光光度计：日本日立公司；HZP-L502 型pH 计：华志（福建）电子科技有限公司；SB-100D 型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；AX224ZH/E 型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；SHINVA 型高压蒸汽灭菌锅：山东新华医疗器械股份有限公司；RVL-100-G 正倒置一体显微镜：美国Echo 公司；H1650 型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SHZ-82 型恒温摇床：江苏中和实验仪器制造有限公司；303-2B 型电热恒温培养箱：绍兴市尚诚仪器制造有限责任公司；SW-CJ-1D 型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；FW177 型多功能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.4 方法
1.4.1 酵母菌固体发酵荔枝草体系的建立
1.4.1.1 荔枝草预处理
称取适量荔枝草干品于多功能粉碎机中进行粉碎，过20 目筛，置于阴凉干燥处备用。
1.4.1.2 菌种活化及发酵种子液的制备
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：分别称取酵母粉1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g 于250 mL 锥形瓶中，加入100 mL 纯水，121 ℃高压灭菌25 min。冷却到室温后置于4 ℃冰箱保存。
酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：分别称取酵母粉1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、琼脂粉2 g 于250 mL 锥形瓶中，加入100 mL 纯水，121 ℃高压灭菌25 min。冷却至50～60 ℃，倒入无菌培养皿中，凝固后置于4 ℃冰箱保存。
将酵母粉与PBS 按一定比例混匀，反应30 min后，使用接菌环将其接种在YPD 中进行筛选纯化，挑取固体培养基中的单菌落接种至YEPD 中进行扩繁，于30 ℃、180 r/min 培养20 h，得到酵母菌菌液。
1.4.1.3 固态发酵
称取适量荔枝草粉末放置于250 mL 锥形瓶中，121 ℃高压灭菌25 min，取出，接入扩繁后的菌液，搅拌均匀，置于电热恒温培养箱中分别于25、30 ℃和35 ℃进行避光发酵。
1.4.2 发酵体系适应性评价
以酵母菌的生长状况和基质消耗率来评价酵母菌荔枝草发酵体系的可行性。
1.4.2.1 活菌数的测定
采用血球计数板法进行菌落计数，步骤如下。
1）取0.1 g 样品用纯水依次稀释至一定的倍数。
2）将菌液滴加在血球计数板上，使用正倒置一体显微镜进行计数，遵从计上不计下、计左不计右的原则，根据以下公式计算出在同一稀释浓度下菌落的平均数。
式中：N 为酵母活菌数，CFU/mL；N80 为80 格内的酵母活菌数，CFU/mL；D 为稀释倍数。
1.4.2.2 基质消耗率
通过计算发酵前后质量差得到基质消耗率，计算公式如下。
式中：R 为基质消耗率，%；M0 为发酵前总质量，g；M1 为发酵后的产物质量，g。
1.4.3 发酵周期的确定
以发酵荔枝草的水、醇浸出物以及pH 值变化趋势来确定发酵周期。将酵母菌接种在高温高压灭菌后的荔枝草基质中，分别在0、24、48、72 h 取基质和阴性对照，得到不同发酵时间点的发酵荔枝草。
1.4.3.1 水浸出物和醇浸出物的含量测定
参考《中华人民共和国药典》2020 年版通则2201项[16]下热浸法测定水溶性浸出物和醇溶性浸出物含量，其中水为重蒸馏去离子水，醇为稀乙醇。
1.4.3.2 pH 值的测定
取1 g 发酵产物，加入适量纯水，1 500 r/min 离心5 min，取上清液用pH 计测定pH 值。
1.4.4 发酵条件优化
固态发酵的影响因素有很多，主要与发酵菌种、发酵温度、含水量、pH 值等相关。其中最重要的两个影响因素为发酵温度和含水量，菌体生长情况与温度高低以及水分含量的多少息息相关，当温度过高或过度干燥时，营养物质的传输速率以及菌体生长繁殖将受到抑制，导致发酵速率降低。真菌在温度过高时无法存活，最适发酵温度以30～37 ℃为佳[17]，含水量控制在10%～50%，上述条件适用于大多数真菌的培养环境。根据上述条件及前期试验，考察含水量、发酵温度以及加菌量对酵母菌发酵荔枝草过程中总黄酮含量变化的影响正交试验因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平1 2 3 A 含水量/%10 30 50 B 发酵温度/℃25 30 35 C 加菌量/%5 10 20
1.4.4.1 总黄酮提取液的制备
精密称取1 g 灭菌荔枝草（阴性对照）、发酵荔枝草粉末，放入锥形瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇溶液超声2 次（1 h/次），合并所有滤液，抽滤，测定提取液总黄酮含量。
1.4.4.2 标准曲线的绘制
制备标准溶液：精密称取芦丁标准品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入适量70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到质量分数0.1 g/L 的对照品溶液，4 ℃冰箱保存备用。
绘制标准曲线：分别精密吸取0.1 g/L 芦丁乙醇溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加入1 mL 的5%亚硝酸钠，静置6 min，加入1 mL 的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入10 mL 的4%氢氧化钠溶液，最后加入70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以不加芦丁对照品溶液为空白对照，于510 nm 测吸光度，绘制标准曲线并得到回归方程[18]。
1.4.4.3 供试品溶液的测定
吸取样品液1 mL，置于25 mL 容量瓶中，按照上述标准曲线绘制步骤操作，以不加样品的溶液为空白对照，于510 nm 测吸光度，代入回归方程y=7.934 3x+0.002 6，计算出总黄酮的含量。
1.4.5 抗氧化活性测定
将提取液稀释至一定浓度，按照DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除能力检测试剂盒说明书的方法，分别测定自由基清除率。
1.5 数据处理与统计分析
采用SPSS 26 软件分析处理数据，Origin 2021 绘图，其中P＜0.05 表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酵母菌固体发酵荔枝草体系适应性研究
为探索酵母菌能否在荔枝草中良好生长，本文首先对酵母菌-荔枝草进行了适应性研究，根据酵母菌的生长状况、基质消耗率的变化，考察酵母菌荔枝草体系固体发酵的适应性，为后续发酵条件的选择提供一定参考。
2.1.1 不同发酵时间的基质消耗率
在发酵过程中，酵母菌对荔枝草基质具有一定的分解作用，被分解的荔枝草基质会转化成水、CO2 以及菌丝体，因此基质的质量减少，消耗率会上升。图1 反映了不同浓度酵母菌消耗荔枝草基质的情况。
图1 各发酵组不同发酵时间的基质消耗率
Fig.1 Changes in substrate consumption rate of each group after fermentation for different time
由图1 可知，不同浓度酵母菌对荔枝草基质的消耗随发酵时间的延长而增加，具有时间依赖性。由此可知，酵母菌可在不添加任何营养物质的条件下充分利用荔枝草中的有效成分进行发酵，荔枝草可以满足酵母菌生长的条件。随着发酵时间的延长，不同加菌量的基质消耗率也同样不断升高，其中加菌量为30%对基质的分解代谢最快，因此消耗率最高，发酵时间为72 h 时荔枝草基质的消耗率达到了11.91%，结合最佳发酵工艺分析，发酵时间为48～72 h 时，5%加菌量较10%、20%加菌量活菌数量增加适宜，对基质的分解最快，消耗率也较高。
2.1.2 不同发酵时间活菌数的变化
各发酵组不同发酵时间活菌数的变化见图2。
图2 各发酵组不同发酵时间活菌数的变化
Fig.2 Changes in viable cell count of each group after fermentation for different time
由图2 可知，酵母菌可在荔枝草培养基中大量繁殖，接种初期，活菌数会迅速增加，这是因为酵母菌开始适应新环境并消耗培养基中的营养物质，活菌数由高到低分别是30%、20%、10%、5%；在激增期（发酵0～24 h）之后，进入对数生长期，这意味着活菌数以指数级别增长，直到达最大值，其中30%加菌量的活菌数增长速率最快；发酵24～48 h，活菌数进入平稳期，这时，活菌数不再继续增加甚至开始减少，因为它们已经消耗了所有可用的营养物质，其中，30%加菌量的活菌数下降速率最快；在发酵48 h 时，各个不同加菌量的活菌数接近；发酵48～72 h，5%加菌量的活菌数仍不断增长，而其余浓度加菌量的活菌数则逐渐趋于稳定，这是因为当营养物质不足时，活菌数会停止增长并进入瓶颈效应，这时，一些酵母菌可能死亡或处于休眠状态。由此可见酵母菌适宜在荔枝草培养基中生长。
2.2 发酵周期的确定
2.2.1 各发酵组不同发酵时间pH 值的变化
为确定发酵周期，首先对不同加菌量的发酵组进行不同发酵时间pH 值的测定，各发酵组不同发酵时间pH 值的变化见图3。
图3 各发酵组不同发酵时间pH 值的变化
Fig.3 Changes in pH value of each group after fermentation for different time
研究表明，生长阶段菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵离子，使pH 值上升[19]；随着菌体量增多，铵离子的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH 值下降，随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH 值又上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。由图3 可知，发酵初期，荔枝草发酵起点的pH 值为5.48，各发酵组在0～24 h 发酵时间内的降低值也各不相同。在24 h 由于发酵过程中酵母产生乙酸、乳酸等酸性物质，因此pH值达到最低点（pH4.8），在发酵24 h 后，随着发酵速率的加快，酒精浓度会不断升高，因此pH 值会开始升高。加菌量为10%、20%和30%的酵母菌在48～72 h发酵区间pH 值高达5.2，5%的加菌量在48 h 发酵时间点pH 值达到5.0，各组均趋于稳定，pH 值变化幅度较小，推测达到发酵终点。
2.2.2 各发酵组不同发酵时间水、醇浸出物含量变化
各发酵组不同发酵时间水、醇浸出物含量变化见图4、图5。
图4 各发酵组不同发酵时间水浸出物含量变化
Fig.4 Changes in water extract yield of each group after fermentation for different time
图5 各发酵组不同发酵时间醇浸出物含量变化
Fig.5 Changes in alcohol extract yield of each group after fermentation for different time
酵母有氧呼吸时会消耗一定量的营养物质，而营养物质不足则会导致酵母的代谢需求难以被满足，反应速率因此会降低或停止，因此水、醇浸出物也可以作为判断发酵终点的一个指标[20]。对比图4 和图5 的结果发现荔枝草醇浸出物的含量略低于水浸出物，符合相关文献中的报道[21-22]，随着发酵时间的延长，各组水、醇浸出物含量整体上呈现降低的趋势，并且在发酵48～72 h 浸出物的含量差异较小，与pH 值的变化趋势保持一致，因此最终发酵时间选择48 h。
2.3 发酵工艺优化
采用L9（33）正交试验设计对荔枝草的发酵工艺条件进行优化，结果见表2，方差分析结果见表3，验证试验结果见表4。
表2 正交试验设计及结果（n=3）
Table 2 Orthogonal test design and results（n=3）
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R A 含水量/%10 30 10 30 50 10 50 50 30 4.01 3.31 2.28 1.34 1.10 0.76 0.58 B 发酵温度/℃35 30 25 35 35 30 30 25 25 3.12 3.32 3.16 1.04 1.11 1.05 0.05 C 加菌量/%5 20 20 10 20 10 5 10 5 3.65 2.90 3.05 1.22 0.97 1.02 0.25总黄酮含量/%1.68 1.30 1.16 0.89 0.59 1.17 0.85 0.84 1.12
表3 正交试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of results from the orthogonal test
方差来源A B C误差离差平方和0.505 0.007 0.105 0.020自由度2 2 2 2均方0.252 5 0.003 5 0.052 5 0.010 0 F 值25.25 0.35 5.25显著性P＜0.05
表4 验证试验结果
Table 4 Validation results
发酵批次1 2 3总黄酮含量/%2.04 2.03 2.08
由表2 中R 值可以看出，各因素影响总黄酮含量由强到弱的顺序为含水量＞加菌量＞发酵温度。直观分析结果可知酵母菌固态发酵荔枝草的最佳水平组合为A1B2C1，即发酵温度30 ℃、含水量10%、加菌量5%。按照优选的发酵工艺发酵3 批样品进行验证试验，结果显示荔枝草发酵后的总黄酮含量为（2.05±0.04）%，相对标准偏差为1.28%，说明本研究所优选的发酵工艺稳定可行。
2.4 总黄酮含量测定结果分析
芦丁与总黄酮具有相似的化学结构，因此可以用来粗略的测定总黄酮含量，芦丁标准曲线见图6。
图6 芦丁标准曲线
Fig.6 Rutin standard curve
如图6 所示，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线回归方程y=7.934 3x+0.002 6，线性范围为：0～0.020 mg/mL，R²=0.998 3，在线性范围内呈良好的线性关系。
荔枝草发酵前后总黄酮含量变化见图7。
图7 总黄酮含量变化
Fig.7 Flavonoid content before and after fermentation
在发酵的过程中，酵母菌产生的酶使小分子的释放提高，纤维降解，提高了溶出率并且使总黄酮的含量增加。如图7 所示，未发酵荔枝草总黄酮含量为1.42%，发酵后的总黄酮含量为2.09%，与未发酵荔枝草相比，发酵荔枝草总黄酮含量极显著升高了47.18%，说明酵母菌发酵可以使荔枝草总黄酮含量提高。
2.5 体外抗氧化活性
2.5.1 荔枝草总黄酮的DPPH 自由基清除能力
荔枝草发酵前后产物的DPPH 自由基清除能力见图8。
图8 DPPH 自由基清除能力
Fig.8 Scavenging activity against DPPH free radicals
由图8 可知，在0.01～0.30 mg/mL 的浓度范围内，随着荔枝草总黄酮浓度的增加，对DPPH 自由基清除率没有明显的变化，发酵前后清除率分别维持在23%和26%左右，与阳性对照VC相比，对DPPH 自由基的清除率低于VC，但仍然具有一定的DPPH 自由基清除能力。
2.5.2 荔枝草总黄酮的ABTS+自由基清除能力
荔枝草发酵前后产物的ABTS+自由基清除能力见图9。
图9 ABTS+自由基清除能力
Fig.9 Scavenging activity against ABTS+free radicals
由图9 可知，在0.1～0.8 mg/mL 的浓度范围内，随着荔枝草总黄酮浓度的增加，荔枝草发酵前后总黄酮对ABTS+自由基的清除率均呈现剂量依赖性增加。当未发酵荔枝草总黄酮浓度达到0.8 mg/mL，发酵荔枝草浓度达到1.0 mg/mL 时，二者清除率分别最高，达50.49% 和82.82%，而在0.8～1.0 mg/mL 的浓度范围内，发酵荔枝草组的ABTS+自由基清除能力超过VC，未发酵组则出现下降趋势，说明二者均有较高的ABTS+自由基清除能力且发酵组明显强于未发酵组。
2.5.3 荔枝草总黄酮的羟自由基清除能力
荔枝草发酵前后产物的羟自由基清除能力见图10。
图10 羟自由基清除率
Fig.10 Scavenging activity against hydroxyl free radicals
由图10 可知，荔枝草总黄酮提取物对羟自由基具有一定的清除能力，且发酵组明显强于未发酵组。在0.2～0.8 mg/mL 的浓度范围内，二者的抗氧化能力均呈逐渐上升的趋势，在0.8～2.0 mg/mL 的浓度范围内，二者对羟自由基的清除率趋于稳定并伴有不同程度的下降趋势，发酵荔枝草总黄酮在浓度为0.8 mg/mL 时对羟自由基清除率最高。
3 结论
本研究利用酵母菌对荔枝草进行固态发酵，筛选出最佳发酵工艺为发酵温度30 ℃、含水量10%、加菌量5%、发酵时间48 h，对比未发酵组，发酵组荔枝草总黄酮含量在此条件下极显著升高。体外抗氧化活性结果表明，发酵后的荔枝草抗氧化性能明显高于未发酵组。本研究首次使用酵母菌对荔枝草进行固态发酵及工艺优化，对荔枝草发酵前后的抗氧化活性进行分析，以期为天然抗氧化剂的研发提供优质的植物资源，同时为荔枝草药用植物资源的综合开发利用提供参考。
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