乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是自然界中普遍存在的一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，可用于动植物汁液或浸汁的天然发酵，因其代谢产物包含多种有机酸、拮抗类化合物和多种抗真菌化合物，被认为具有改善和维持人体胃肠道平衡的功能，参与2 型糖尿病、代谢综合症和心脏病的治疗[1]。片球菌属（Pediococcus）是LAB 的重要分支，被美国食品药物管理局认证为安全的食品级微生物，能调节胃肠道菌群，维持胃肠道的生态平衡[2]，可应用于食品的生产和药品、保健品的研发[3]；能产生细菌素，在畜牧养殖中可替代抗生素，减少动物疾病的发生[4]，被欧盟批准可作为所有动物的饲料添加剂[5]。LAB 能够天然代谢产生多种对病原微生物有颉颃作用的酸类和多肽类物质，其中一种新型的天然小分子物质苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），近年来，由于被发现具有抑菌作用，成为科学家们的重点研究对象。
PLA 具有以下特点：溶解性好，易扩散于食品体系；稳定性高，pH 值耐受范围广和热稳定性好[6]；抗菌活性谱广[7]，对多种革兰氏阴性菌[8-9]、阳性菌[10]、真菌和酵母[11-12]均有明显抑制作用。此外，其晶体形态无色、无味、无结块、无腐蚀性。因此，目前PLA 被认为是继乳酸、醋酸、细菌纤维素外可添加在食品中的新型绿色防腐剂，具有广泛的应用前景[13]。目前，PLA 主要通过化学合成法和生物合成法合成。化学合成法对环境污染严重，生物合成法反应条件温和，后者具有很好的可持续性。近年来，由于LAB 胞壁较厚、机械强度大，外源基因很难导入[14]，多用大肠杆菌作为微生物底盘构建PLA 高产菌株。为使LAB 自身高效合成PLA，本研究选用PLA 天然生产菌LAB 作为微生物底盘进行改造。
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）基因ldh的表达水平显著影响LAB 中PLA 的积累。Sun 等[15]对L. plantarum LY-78 进行全基因组测序和转录组学分析，发现在发酵中添加苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA），LDH 基因ldh 上调，PLA 产量提高。Wu 等[16]对L. plantarum YM-4-3 的多组学分析中发现PLA 高产菌株中4 种LDH 基因ldh 中的3 种明显上调。证明PLA 产量与基因ldh 表达水平相关，提高ldh 表达量可以明显提高PLA 产量。因此，本研究对P. acidilactici GM 自身基因ldh 进行过表达。
本研究以天津市工业微生物重点实验室筛选的乳酸片球菌（P. acidilactici GM）作为出发菌株，采用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变结合硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）诱变的复合诱变法，选育出活力更高、产量更大的突变菌株，建立高效转化方法，以解决外源基因难导入的问题，利用基因工程手段，将质粒载体pMG36e 启动子进行替换，构建LDH 过表达载体，并运用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）验证目的基因表达量，最终实现在LAB 中高效合成PLA，以期为构建PLA 高产菌株的提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 菌株和引物
试验涉及的菌株和质粒如表1 所示，所用引物序列及特征如表2 所示。
表1 菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids
菌株和质粒菌株P. acidilactici GM P. acidilactici GM-ldh E. coli DH5α主要特征及描述实验室筛选菌株乳酸脱氢酶基因过表达菌株通用克隆宿主来源实验室保存本研究构建实验室保存
续表1 菌株和质粒
Continue table 1 Strains and plasmids
注：实验室均为天津市工业微生物重点实验室。
菌株和质粒质粒pMG36e pMG36e-ldh pYG36e-ldh主要特征及描述pWV01 复制起始位点，红霉素抗性，多克隆位点，P32 启动子，表达载体pMG36e 的Sac Ⅰ酶切位点之间插入ldh 片段pMG36e-ldh 替换P32 启动子来源实验室保存本研究构建本研究构建
表2 使用的引物序列及其特性
Table 2 Primer sequences and purposes
引物ldh-F ldh-R Pldh-F Pldh-R pMG-F pMG-R 16S-F 16S-R RTldh-F RTldh-R碱基序列（5'-3'）GACCTGCAGGCATGCAAGCTTATGA AGATTATTGCTTATGGAATTCG GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTTAGT CAAACTTAACTTCATTCTTTGAAGA GGATCTTCCAGAGATGAATTCAAAC GGTTTTTACTTCTACGTGCTC GATCGATCCCCGGGCGAGCTCTGTA ATATTACCCCTTTCTTTTTTAATCA GCGGTTACTTTGGATTTTTGTGAG GATTTTCAAACTTCGCAACAG TAATCGGCCACATTGGGACT CTCCATCAGACTTGCGTCCA TCAAATGCAAGACGGAACCT AGCTCCGGCAACTTTACCAC特征扩增乳酸脱氢酶ldh 基因扩增Pldh 启动子片段转化子菌落PCR鉴定P. acidilactici GM 16S rRNA 探针P. acidilactici GM ldh 基因探针
1.1.2 生化试剂
酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、蛋白Marker：上海赛默飞世尔科技有限公司；酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、蔗糖、甘油：北京奥博星生物技术有限公司；PLA、PPA、80 吐温、红霉素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、CaCl2、K3PO4、C6H5O7（NH4）3、Tris-HCl、CH3COONa·3H2O：上海麦克林生化科技有限公司；K2HPO4、MgCl2、NaH2PO4、C9H7NaO3·H2O、MgSO₄·7H2O、MnSO4·7H2O：天津市四通化工厂。以上化学试剂均为分析纯。
QuickCut 限制酶EcoR I、Sac Ⅰ和Hind Ⅲ、DNA Marker、细菌基因组提取试剂盒、质粒纯化提取试剂盒、DNA 片段纯化回收试剂盒、胶回收纯化试剂盒、RNA 反转录试剂盒、PrimeScript RT 试剂盒、TB Green®Premix Ex Taq™ II：宝日医生物技术北京有限公司；细菌RNA 提取试剂盒：广州飞扬生物工程有限公司；PMSF 蛋白抑制剂、革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；高保真Phanta® Max Super-Fidelity DNA 聚合酶、一步克隆试剂盒ClonExpress® II One Step：南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.1.3 培养基及缓冲液
MRS 培养基（1 L）：20 g 葡萄糖、10 g 蛋白胨、5 g牛肉粉、4 g 酵母粉、5 g CH3COONa·3H2O、2 g K2HPO4、0.2 g MgSO₄·7H2O、2 g C6H5O7 （NH4） 3、0.05 g MnSO4·7H2O、0.1 g 80 吐温；LB（Luria-Bertani）培养基（1L）：10 g胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl；用于电转化的培养基为MRS 培养基添加0.5 mol/L 蔗糖；用于转化子培养的复苏培养基为MRS 培养基添加20 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2；用于发酵的发酵培养基为MRS培养基添加30 mmol/L C9H7NaO3·H2O；用于筛选阳性克隆的培养基为MRS 培养基和LB 培养基分别加入10 µg/mL 和300 µg/mL 红霉素。
缓冲液Ⅰ：0.5 mol/L 蔗糖，0.2 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L MgCl2，pH7.8；缓冲液Ⅱ：0.6 mol/L 蔗糖，7 mmol/L K3PO4，1 mmol/L MgCl2，pH7.4；缓冲液Ⅲ：0.5 mol/L 蔗糖，7 mmol/L Na2HPO4，7 mmol/L NaH2PO4，20 mmol/L MgCl2，pH7.4；缓冲液Ⅳ：0.5 mol/L 蔗糖，10 mmol/L HEPES，pH7.8；缓冲液Ⅴ：0.5 mol/L 蔗糖，20 g/L 甘油，pH7.0。
1.1.4 仪器与设备
LRH-100-S 恒温恒湿培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；UV-5100 可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；H2050R 高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；ZF-288 凝胶成像仪：美国BIO-RAD 公司；ARTP-M 常压室温等离子体诱变育种仪：清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心；SBA-40E 型生物传感分析仪：济南佰格生物科技有限公司；数字型pH 计：上海雷磁仪器厂；Agilent 1200 型高效液相色谱、色谱柱SB-C18：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备
将活化后的P. acidilactici GM 接种于MRS 液体培养基中30 ℃培养至对数生长期，8 000 r/min 离心20 min 收集菌体，洗涤2 次，将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）缓冲液中制成107～108 CFU/mL 细胞悬浮液，备用。
1.2.2 ARTP 诱变
取出发菌株悬液10 µL 均匀涂到无菌金属诱变片上，ARTP 诱变育种仪工作电压110 V，照射距离2 mm，工作气流10 slpm，照射时间30、40、50、60、70、80 s。随后将载片于1 mL PBS 缓冲液中充分混匀，梯度稀释涂布平板，每个时间设置3 个平行，30 ℃培养1～2 d，记录每个平板的菌落数，以出发菌株的菌落数作对照，按照如下公式计算致死率。
式中：Y 为致死率，%；X1 为诱变前菌落数，CFU；X2为诱变后菌落数，CFU；X3 为诱变前菌落数，CFU。
1.2.3 DES 诱变
取对数生长期菌液5 mL，磷酸缓冲液pH7.0 洗涤2 次，无菌水稀释一定浓度，配制不同浓度的DES 溶液，加入质量分数0.6%～1.5% 的DES 溶液，30 ℃水浴振荡处理20～40 min，梯度稀释涂布平板，每个变量设置3 个平行，30 ℃培养1～2 d，观察诱变时间与剂量对死亡率的影响。
1.2.4 突变菌株的筛选
初筛：在培养基中加入不同浓度的PLA 制成抗性平板，在不同PLA 浓度的平板上涂布适当出发菌株稀释液，观察出发菌株对PLA 的抗性，确定出发菌株的产物耐受临界浓度。
复筛：进行摇瓶发酵，发酵条件为2%接种量、MRS培养基、30 ℃培养。发酵后，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定PLA 产量，挑选PLA 产量最高的菌株作为突变菌株。
1.2.5 稳定性检测
对获得的正突变株连续传代，每传代一次进行发酵试验，并测定各代发酵液中PLA 产量，以观察正突变株的遗传稳定性。
1.2.6 感受态制备及电转化条件优化
感受态制备：将活化后的P. acidilactici GM 挑取单菌落至MRS 培养基中30 ℃静置过夜，待菌株生长到对数期，按1% 接种量接种于含有不同浓度氨基酸（2% 甘氨酸、4% 甘氨酸、0.25% 苏氨酸、0.75% 苏氨酸和1.5% 苏氨酸）的MRS 培养基中，静置培养至不同生长阶段（OD600=0.2～1.0），于冰上冷却，离心（4 ℃、5 000 r/min、10 min）收集菌体，分别用不同缓冲液（缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ、缓冲液Ⅳ、缓冲液Ⅴ）洗涤菌体3 次，离心（4 ℃、6 000 r/min、10 min）收集菌体，不同浓度溶菌酶溶液（5～25 mg/mL）37 ℃处理30 min，离心（4 ℃、6 000 r/min、10 min）收集菌体，缓冲液洗涤菌体3 次，将菌体重悬于电击缓冲液中，分装备用，-80 ℃保存。
电转化：将50 µL 感受态细胞和1 µg DNA 混匀，加入经预处理的电击杯中，电压范围1 500～2 750 V。
1.2.7 转化子的培养
从活化后的E.coli DH5α 中提取pMG36e 空载作为外源DNA，控制DNA 终浓度为1 µg/µL，添加1～3 µL，采用优化后的电转化方法转化质粒，转接抗性平板上，待转化子长出。从红霉素筛选平板上挑取单菌落，接入5 mL 含红霉素浓度为5 µg/mL 的MRS 液体培养基中，30 ℃培养24 h。
1.2.8 基因ldh 及其启动子的克隆
使用细菌基因组提取试剂盒提取P. acidilactici GM 中全基因组序列，具体操作方法见说明书。设计引物扩增ldh 基因片段和上游启动子片段，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）程序见试剂盒说明书，PCR 扩增产物经1% 琼脂糖电泳检测和测序将长度正确的条带切胶回收备用。
1.2.9 重组表达载体的构建
pMG36e-ldh 的构建：带有同源臂的ldh 片段和经过Hind Ⅲ单酶切的线性化pMG36e 以同源重组的方法连接，构建重组质粒pMG36e-ldh，并化转至E. coli DH5α 感受态细胞中，过夜培养后，经抗性筛选、菌落PCR 验证和酶切验证筛选阳性转化子，转接提取质粒进行酶切和PCR 验证，-20 ℃保存，将验证正确的菌株重新提取质粒，按上述方法将重组载体转入P. acidilactici GM。
pYG36e-ldh 的构建：将构建好的质粒pMG36e-ldh经Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化，胶回收长度正确的片段以去除启动子，带有同源臂的ldh 启动子片段以同源重组的方法连接，构建重组质粒pYG36e-ldh，并化转至E. coli DH5α 感受态细胞中，过夜培养后，经抗性筛选、菌落PCR 验证和酶切验证筛选阳性转化子，转接提取质粒进行酶切和PCR 验证，-20 ℃保存，将验证正确的菌株重新提取质粒，按上述方法将重组载体转入P. acidilactici GM。
1.2.10 SDS-PAGE 的样品制备
将过夜培养的目的菌株与对照菌株发酵在MRS培养基37 ℃静置条件下培养36 h 左右。测定OD600与对照菌株相同，取1 mL 发酵液样品；使用1.5 mol/L Tris-HCl 溶液洗涤菌体，重悬细胞沉淀，加入50 µL 100 mg/mL 溶菌酶溶液和50 µL 苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白抑制剂，冰上冷却30 min，室温下于液氮中反复冻融3～5 次，随后4 000 r/min 离心1～2 min 去除未裂解细胞。取1 mL破碎液，即为蛋白样品。将样品按照考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，按照加样量6 µg 加样。
1.2.11 RT-qPCR 的鉴定
使用细菌RNA 提取试剂盒提取RNA 基因组，使用PrimeScript™ RT reagent Kit 进行RNA 反转录，使用TB Green® Premix Ex Taq™ II 进行RT-qPCR 反应，采用SYBR® Green 荧光染料法，以细胞中表达稳定的16S rRNA 基因为参照，具体操作方法及反应条件详见说明书。试验中所有引物均在目的片段纯化后所得测序结果上进行设计，所有试验步骤均在冰盒上进行，并设置3 组平行试验。
1.2.12 发酵液的处理与检测
取发酵样品离心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），使用生物传感分析仪检测葡萄糖浓度，离心菌体洗涤后于95 ℃烘干24～48 h，记录菌体干重，使用pH 计测定上清液pH 值。使用HPLC 测定PLA 产量，方法参照Mu等[17]并作适当修改，流动相A：色谱纯水；流动相B：甲醇；进样量：10 µL；抽取：8 mm；流速：1 mL/min；洗脱程序：0～20 min 时10%～100% 的流动相B；20～23 min 时100% 的流动相B；23～25 min 时100%～10% 的流动相B；柱温：30 °C；紫外波长：210 nm。
1.3 数据处理
使用 SnapGene 软件进行引物设计和序列测序比对，使用Microsoft Excel 2019 对数据进行统计处理与分析，使用Origin 2021 软件对数据作图。
2 结果与分析
2.1 诱变与筛选条件优化
通过生长曲线确定最佳诱变时间见图1。通过分别研究ARTP 诱变和DES 诱变确定最佳诱变方式，结果见图2 和表3。
图1 出发菌株的生长曲线
Fig.1 The growth curve of the starting strai n
图2 ARTP 致死率曲线
Fig.2 The lethal rate curve of ARTP
表3 DES 诱变条件致死因子
Table 3 Conditions and lethal rates of mutagenesis by DES
诱变组1 2 3 4 5 DES 质量分数/%0.6 0.8 1.0 1.2 1.4诱变时间/min 20 25 30 35 40致死率/%47 80 88 96 100
由图1 可知，P. acidilactici GM 的生长规律符合细菌的一般生长规律，20～24 h 为对数期中后期，此时细胞生长旺盛，因此，选用20～24 h 的菌株进行诱变。
综合考虑，降低致死率，且提高正突变率，选用致死率80% 较为合适，由图2 可知，ARTP 的诱变条件最佳选择处理50 s。由表3 可知，DES 诱变条件最佳选择第2 组，即DES 质量分数0.8%，诱变时间25 min。综合考虑降低致死率，且提高正突变率，因此，选择结合两种方法进行复合诱变。
通过出发菌株耐受PLA 情况确定最佳突变株筛选浓度见表4。
表4 出发菌株PLA 耐受水平
Table 4 Tolerance of the starting strain to PLA
注： +++ 表示生长良好；+表示生长微弱；-表示不生长。
PLA 浓度/（mg/L）1 000 2 000 3 000 4 000 5 000出发菌株耐受情况++++++++++ -
由表4 可知，当PLA 添加浓度为5 000 mg/L 时菌株不能生长，因此，选择5 000 mg/L 为突变株筛选浓度。
2.2 复合诱变与验证
在最佳诱变和筛选条件下，对P. acidilactici GM进行复合诱变，HPLC 测定突变菌株产PLA 产量见图3。
图3 诱变筛选结果
Fig.3 Mutagenesis screening results
由图3a 可知，第一次进行ARTP 诱变，挑选抑菌和产酸能力加强的51 株菌株进行摇瓶培养，经过初筛和复筛，25 号菌株产PLA 产量最大达292 mg/L，较出发菌株提高了22.7%。由图3b 可知，在25 号菌株的基础上，进行第二次DES 诱变，挑选抑菌和产酸能力加强的47 株菌株进行摇瓶培养，经过初筛和复筛，12 号菌株PLA 产量最大达357 mg/L，较出发菌提高了50.0%。由图3c 可知，在12 号菌株基础上，进行第三次DES 诱变，挑选抑菌和产酸能力加强的36 株菌株进行摇瓶培养，经过初筛和复筛，16 号菌株PLA 产量最大达309 mg/L，较出发菌提高了29.8%。由于，第二次诱变的12 号菌株的PLA 产量最大，所以，选择二次复合诱变更合适，并将其命名为菌株2-DES-12。
将突变菌株2-DES-12 与出发菌株DSM20284 进行摇瓶发酵验证，结果见图4。
图4 菌株摇瓶发酵结果
Fig.4 Shake flask fermentation results of strains
由图4a 可知，两菌株残糖量变化趋势相似，对葡萄糖消耗情况基本相同。发酵前6 h，随着菌体快速生长，残糖量均迅速下降。6～54 h，残糖量均下降缓慢。54～72 h，残糖量均趋于耗尽。由图4b 可知，两菌株pH 值变化趋势相似，产酸情况基本相同。随着发酵的进行，前18 h，pH 值均呈直线快速下降。18～48 h，pH 值均下降缓慢。48～72 h，pH 值均无明显变化。由图4c可知，两菌株生物量变化差异性较大。发酵前30 h，随着菌体快速生长，生物量均上升。36～72 h，出发菌株和菌株2-DES-12 分别在60 h 和36 h 达到最大生物量1.44 g/L 和1.51 g/L，菌株2-DES-12 的生长速率是出发菌株的1.8 倍。由图4d 可知，两菌株PLA 产量变化差异性较大。发酵前24 h，PLA 产量均快速增加。24～72 h，PLA 产量均缓慢增加。66 h，两株菌PLA 产量均达最高，菌株2-DES-12 最高PLA 产量达365.8 mg/L，相较于出发菌株提高了23.2%。
对突变菌株2-DES-12 进行遗传稳定性验证，结果见图5。
图5 菌株2-DES-12 的遗传稳定性
Fig.5 Genetic stability of strain 2-DES-12
由图5 可知，菌株2-DES-12 在连续10 次传代中，每次传代PLA 产量均在343.8～349.2 mg/L 之间，相对标准偏差仅为0.5%，说明突变菌株2-DES-12 遗传稳定性良好。
2.3 P. acidilactici GM 电转化条件优化与鉴定
2.3.1 不同电转化条件优化
不同电转化条件优化结果见图6。
图6 不同电转化条件优化
Fig.6 Optimization of electroporation conditions
LAB 培养过程中常用的细胞壁弱化剂有L-甘氨酸、L-苏氨酸和部分抗生素等[14，18-19]。由图6a 可知，L-甘氨酸的添加对细胞生长和电转化起负面效果，可能是由于L-甘氨酸能影响原核细胞双糖单位的交联，使肽聚糖层上N-乙酰胞壁酸的肽段混乱，影响了外源基因进入细胞[20]。适当浓度的L-苏氨酸能够促进细胞生长，可能是由于L-苏氨酸可与低聚糖链结合，影响细胞壁的形成，但过高浓度的L-苏氨酸会对细胞产生毒害作用，因此选取0.75% L-苏氨酸为初始氨基酸浓度。
感受态制备过程中，适宜的洗涤缓冲液有利于维持细胞形态。根据常见的电转化缓冲液成分[17，21-22]，制定了5 种不同的缓冲液方案。由图6b 可知，缓冲液Ⅳ和缓冲液Ⅴ基本无转化子生长，可能HEPES 和甘油是不利因素，且Mg2+缺失也可能会使电转化效率降低。缓冲液Ⅲ电转化效率最高，因此选取缓冲液Ⅲ为缓冲液体系。
由图6c 可知，由于不同生长阶段细菌的胞壁成分不同，pH 值也随之产生变化，所以对不同生长阶段进行电转化。由图6d 可知，当OD600=0.8 时转化子最高为110.8 CFU/μg，当菌体生长至稳定期OD600≥2.0 时，电击敏感度低，转化效率为零，可能是在对数期时细菌生长旺盛，胞壁结构较为松散，易于接受外源DNA[17]。这与P. acidilactici P60 电转化最佳OD600=1.25 存在较大差异，可能与菌株的不同有关[20]。因此选取OD600=0.8 为电转化时的菌体浓度。
溶菌酶能够破坏肽聚糖组装，降解片球菌胞壁形成原生质体，增加外源DNA 的转化率[23]。由图6e 可知，溶菌酶浓度的增加使得菌体的转化效率也相应增加，当添加30 mg/mL 溶菌酶时，转化子最高为152.8 CFU/μg，但过量的溶菌酶会降低电转化效率且对细胞壁的破坏较大，因此选取30 mg/mL 为溶菌酶终浓度。
提供适当的电场强度易于增加感受态细胞膜渗透性，增加外源DNA 进入细胞的机率[24]；过高的电场强度容易击穿细胞造成细胞死亡，较低的电场强度难以使细胞上产生临界渗透性，使得外源DNA 无法转入[25]。由图6f 可知，当电场强度为20 kV/cm，转化子最高为147.2 CFU/μg，由于过高电场强度对细胞结构伤害过大，电转化后无法继续生长，因此选取20 kV/cm为电场强度。
2.3.2 转化子的鉴定
为确保鉴定的准确性，分别采用两种方法鉴定转化子，结果见图7。
图7 P. acidilactic GM 转化子的鉴定
Fig.7 Identification of P. acidilactic GM transformants
由图7a 可知，凝胶电泳条带与目的条带大小一致（1 000 bp 左右），表明PCR 鉴定结果正确；由图7b可知，从P. acidilactic GM 转化子中提取的质粒与从E.coli DH5α 中提取的质粒的凝胶电泳条带大小一致（3 610 bp），表明质粒鉴定结果正确；以上均表明质粒pMG36e 已成功且高效转入P. acidilactic GM 中。
2.4 基因ldh 表达优化与验证
2.4.1 启动子和转录水平的影响
为研究启动子强度对LDH 基因ldh 表达的影响，构建了两个重组质粒pMG36e-ldh 和pYG36e-ldh，见图8 和图9。在最优电转化条件下，将质粒分别电转化导入P. acidilactici GM。对重组菌株进行了SDSPAGE 验证，结果见图10。
图8 pMG36e-ldh 重组载体构建示意图
Fig.8 Schematic diagram of the construction of the recombinant vector pMG36e-ldh
图9 pYG36e-ldh 重组载体构建示意图
Fig.9 Schematic diagram of the construction of the recombinant vector pYG36e-ldh
图10 重组菌株LDH 蛋白表达
Fig.10 LDH expression of recombinant strains
由图10 可知，出现了与LDH 蛋白分子量大小（38 kDa 左右）[26]一致的条带，表明重组菌株可以正常表达LDH 蛋白，且当P32 为启动子时，LDH 表达量和底物利用率并无明显提高；当Pldh 为启动子时，LDH表达量和底物利用率明显提高，这与在对木质纤维素依赖型P. acidilactici 外源基因表达的研究相似[27]，因此，启动子强度对LDH 基因表达有明显影响。
重组菌株LDH 基因ldh 转录水平见图11。
图11 重组菌株ldh 基因的相对转录水平
Fig.11 Relative transcription level of ldh of the recombinant strain
通过RT-qPCR 分析，比较重组菌株（pYG36e-ldh）和出发菌株，由图11 可知，在合成PLA 的不同时段中，重组菌株的基因ldh 转录水平均有提高，尤其在12～24 h 提升最大，可能与此时菌体活力旺盛，产酸量高有关，因此，基因ldh 的转录水平对LAB 合成PLA有明显影响。
2.4.2 5 L 发酵罐验证
在5 L 发酵罐中，出发菌株和重组菌株（pYG36eldh）的发酵情况见图12。
图12 菌株发酵参数
Fig.12 Fermentation parameters of strains
由图12 可知，两个菌株的生长趋势相似，均在4～16 h 生长较快，之后进入平稳期，但重组菌株最大生物量是出发菌株的84.7%，可能是LDH 表达导致菌体代谢负担加重所致；两个菌株的耗糖和产酸趋势与生长趋势偶联，均在4～16 h 生长较快，重组菌株葡萄糖消耗速率是出发菌株的1.1 倍，而重组菌株pH 值下降速率是出发菌株的96.9%。这可能是LDH 表达加强了菌株积累有机酸的能力所致。
对于重组菌株（pYG36e-ldh），合成PLA 限制步骤在于中间产物PPA 的积累，为了进一步提高PLA 产量，添加不同浓度PPA 底物进行发酵，结果见图13。
图13 添加PPA 前后的PLA 产量及底物转化率
Fig.13 PLA production and substrate conversion rate after addition of PPA
由图13 可知，当不添加PPA，出发菌株PLA 产量很低，仅为0.3 g/L；当添加2 g/L PPA，重组菌株PLA产量为3.2 g/L，是出发菌株的1.7 倍，重组菌株底物转化率为83.7%，是出发菌株的1.6 倍；当添加30 g/L PPA 时，重组菌株PLA 产量高达56.3 g/L，是出发菌株的1.8 倍，重组菌株底物转化率高达94.8%，是出发菌株的1.7 倍。因此，外源添加PPA 可以有效缓解中间产物积累对PLA 合成的抑制作用，使重组菌株PLA 产量得到明显提升。
3 讨论
目前PLA 的合成主要通过化学合成法和生物合成法。化学合成法技术路线复杂、反应条件苛刻、易产生环境污染[28]。生物合成法反应条件温和，具有可持续性，符合绿色发展要求。Zhou 等[29]在E.coli BL21 中异源表达基因ldh，以PPA 为底物，高效合成PLA。Luo 等[30]在E.coli BL21 中异源表达基因ldh，在发酵过程中补料PPA，高效合成PLA。异源表达转化率虽高，但存在生物不稳定性，且E.coli 作为致病菌对人体有害，相比而言，LAB 作为PLA 天然的生产菌株，可以应用在食品行业，更利于工业化生产。
Li 等[31]利用质粒pMG36e 构建甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，FDH）表达载体，成功导入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）中，有效提高了NADH/NAD+的比率和PLA 的积累。在此基础上，本研究通过加强P. acidilactici 中LDH 的过表达，促进了LAB中PLA 的过量积累，但研究中发现较长目的片段（＞1 000 bp）与pMG36e 连接困难，极大限制了菌株的改造。由于LAB 菌株特异性较强，构建LAB 工程菌株高效合成PLA，并简化操作流程，仍是未来需要解决的问题。
4 结论
本研究以实验室筛选的P. acidilactici GM 作为出发菌株，通过复合诱变筛选出高产PLA 的突变菌株，即先采用ARTP 诱变50 s，再采用0.8%DES 诱变25 min，且通过了摇瓶发酵验证和遗传稳定性验证；通过单因素试验建立高效电转化方法，得到最优电转化条件：添加0.75% L-苏氨酸的MRS 培养基，培养菌体至OD600=0.8，使用缓冲液Ⅲ（0.5 mol/L 蔗糖、7 mmol/L Na2HPO4、7 mmol/L NaH2PO4、20 mmol/L MgCl2）洗涤菌体3 次，溶菌酶浓度30 mg/mL 于37 ℃处理菌体30 min，电场强度20 kV/cm；通过替换启动子，构建了过表达重组质粒pYG36e-ldh 并成功高效电转化于LAB，通过RTqPCR 分析，实现了自身LDH 过表达；通过5 L 罐发酵培养，并添加底物PPA，使得PLA 产量提高至56.3 g/L，底物转化率提高至94.8%。
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