海马是中国水产经济中重要的高价值海水鱼类，在中药、海洋水族以及纪念品市场有很大的贸易成交量[1]，全球海马年消费量在5 000 万尾以上，产值近300 亿[2]。海马体内有多种生物活性物质[3]，素有“南方人参”之称，以干制品的形式在中医领域得到广泛应用[4]，被认为可以调理气血，壮肾补阳[5-7]，含有海马或其别名、异名的方剂有154 首[8]。研究证明海马及其提取物也具有一定的抗癌潜力[9]、降血压作用[10]、抑制肿瘤作用[11]并对某些神经退行性疾病表现出良好的缓解作用[12]。然而，近年来海洋生态环境逐渐发生变化，随着人类对近海海域的过度开发，海马的栖息环境不断恶化，同时过度捕捞也对海马种群的繁衍造成了严重的威胁[13]，目前我国海马的野生种群已日渐枯竭[14]，人工养殖已成为满足市场需求、保护海马资源的唯一选择。
目前世界上实现商业养殖的主要海马品种有膨腹海马（Hippocampus abdominalis）、巴氏海马（Hippocampus bargibanti）、虎尾海马（Hippocampus comes）等14 种[15]。2016 年，福建省开始引进澳大利亚膨腹海马，在2020 年突破了膨腹海马规模化人工育苗及病害防控关键技术[16]，2021 年福建省实现了占全国海马养殖总量近半[17]，促进了膨腹海马人工养殖在我国的产业化发展进程。
随着膨腹海马养殖技术的突破，其营养成分分析已经成为一个热门研究方向。因此，本研究采用薄层层析法以及气相色谱（gas chromatography，GC）确定膨腹海马的脂质组成，并探索雌、雄海马的脂质组成差异，以期为海马营养价值开发和高值化利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
雌、雄干海马：威海银泽生物科技股份有限公司。
十五烷酸标准品：美国NU-CHEK 公司；乙醚、乙酸、异丙醇、甲醇、石油醚、二氯甲烷（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
游离脂肪酸试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒：南京建成生物工程研究所；T-HSG10050025-S 薄层层析硅胶预制板：烟台华阳新材料科技有限公司。
7820A 型气相色谱仪、色谱柱AE.FFAP（30 m×0.32 mm×0.25 µm）：美国Aglient 公司；RE52-86A 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Tecan Spark 10M 型酶标仪：瑞士Tecan 公司。
1.2 试验方法
1.2.1 膨腹海马总脂提取
膨腹海马总脂提取参照Folch 等[18]的方法并进行适当修改。浸提溶剂为二氯甲烷-甲醇（2∶1，体积比），将一定质量的膨腹海马干粉末与13 倍体积的溶剂混合并搅拌均匀，浸提24 h 过滤后，向浸提液中加入1/4体积超纯水，充分混匀，转移至分液漏斗。静置12 h后，收集下层有机相，经真空减压浓缩去除有机溶剂后即得膨腹海马总脂。
1.2.2 甘油三酯和总胆固醇含量的测定
取适量膨腹海马总脂样品，用tritonx-100-异丙醇（1∶9，体积比）溶液溶解并稀释至适当倍数[19]，根据试剂盒说明书，向96 孔板中加入样品和工作液，37 ℃孵育10 min，在500 nm 处测定吸光度，结果用每克总脂中的甘油三酯或总胆固醇的毫克数（mg/g 总脂）表示。
1.2.3 游离脂肪酸含量的测定
采用试剂盒测定雌、雄膨腹海马总脂样品中游离脂肪酸的含量，以棕榈酸作为标准品，得到吸光度y 与游离脂肪酸含量x 的标准曲线y=0.612 7x+0.052 9（相关系数R2=0.999 2）。
取适量雌、雄膨腹海马总脂样品，用氯仿溶液溶解并稀释至适当倍数，按试剂盒说明书中步骤在550 nm处测定吸光度，记为A。根据标准曲线即可计算得到样品中游离脂肪酸的含量。
1.2.4 磷脂含量的测定
雌、雄膨腹海马总脂经湿法消化后，采用钼蓝比色法测定磷脂含量[20]。以磷酸二氢钠作为标准品，得到吸光度y 与含磷量x 的磷脂标准曲线为y=0.205 8x-0.012 4（相关系数R2=0.997 3）。
分别称取雌、雄膨腹海马总脂样品100 mg，加入0.5 mL 高氯酸后在160 ℃下消化至无色，随后加入3.5 mL 水和1 mL 显色剂（2.5 g/mL 钼酸铵与10 g/mL VC 体积比1∶1），沸水浴7 min，冷却，在820 nm 处测定吸光度，记为A，按照以下公式计算磷脂（X，mg/g）含量。
式中：P 为标准曲线中被测液含磷量，mg；M 为样品质量，g；Vl 为样品待测液定容体积，mL；V2 为样品被测液取用的体积，mL；25 为每毫克磷相当于磷脂的毫克数。
1.2.5 脂质分离制备
采用薄层层析法分别制备雌、雄膨腹海马的不同脂质组分。雌、雄海马总脂经带状点样，以石油醚∶乙醚∶乙酸=85∶15∶1（体积比）为展开剂进行展开，碘蒸气显色确定各脂质位置后，刮板收集各脂质组分，用于气相色谱分析。
1.2.6 甲酯化衍生
将总脂2 mg 及薄层层析法制备的不同脂质组分分别置于2 mL 甲酯化液（盐酸∶甲醇=1∶5，体积比）中并加入一定量的十五烷酸标准品溶液，涡旋，置于90 ℃金属浴中2 h，冷却后加入1.5 mL 正己烷进行萃取，涡旋均匀，静置分层，取上清液1 mL 于1.5 mL 离心管中用于气相色谱分析。
1.2.7 气相色谱条件
进样口温度：250 ℃；分流模式，分流比10∶1；进样量：2 µL；恒流模式；检测器和进样器的温度分别保持在250 ℃和240 ℃，温度以3 ℃/min 的速度从170 ℃升至240 ℃，并在240 ℃保持35 min。氮气作为载气，流速为1.0 mL/min，整个分析过程48.5 min。
1.3 数据处理
利用SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析， 数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 膨腹海马脂质基本组成分析
通过薄层层析法分离鉴定出膨腹海马主要脂质，如图1 所示。
图1 膨腹海马脂质薄层层析分析色谱图
Fig.1 Thin-layer chromatogram of lipid of the H. abdominalis
由图1 可知，雌、雄海马脂质均主要由游离脂肪酸、甘油三酯、磷脂组成。
进一步测定各脂质组成含量，结果如表1 所示。
表1 膨腹海马主要脂质组成
Table 1 Lipid composition of H. abdominalis mg/g 干重
膨腹海马雄性雌性总脂65.8 57.8甘油三酯7.40±0.45 6.96±0.93磷脂12.04±1.36 10.39±0.15总胆固醇4.79±0.08 3.10±0.13游离脂肪酸28.19±1.98 34.67±1.07
由表1 可知，雌、雄性膨腹海马中总脂含量分别是57.8 mg/g 干重和65.8 mg/g 干重，其中甘油三酯含量分别为6.96 mg/g 干重和7.40 mg/g 干重，总胆固醇含量分别为3.10 mg/g 干重和4.79 mg/g 干重，磷脂含量分别为10.39 mg/g 干重和12.04 mg/g 干重，游离脂肪酸含量分别为34.67 mg/g 干重和28.19 mg/g 干重。研究显示，膨腹海马中磷脂含量明显高于克氏海马（3.8 mg/g）、大海马（3.28 mg/g）和三班海马（6.16 mg/g）[21]。
2.2 膨腹海马总脂脂肪酸组成分析
膨腹海马总脂经甲酯化处理和GC 定性定量分析，结果见表2。
表2 膨腹海马总脂的脂肪酸组成
Table 2 Fatty acid composition of lipid components in H. abdominalis
注：EPA 为二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid）；DHA 为二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）；SFA 为饱和脂肪酸（saturated fatty acid）；MUFA 为单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid）；PUFA为多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid）；UFA 为不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid）。
脂肪酸C14：0 C16：0 C16：1 C17：0 C17：1 C18：0 C18：1 C18：2n-6 C18：3n-6 C18：3n-3 C20：0 C20：1n-9 C20：2 C20：3 C20：4n-6 C21：0 C20：5n-3（EPA）C22：0 C22：1 C22：2 C22：6n-3（DHA）∑SFA∑MUFA∑PUFA∑PUFAn-3∑PUFAn-6∑UFA EPA+DHA雄性相对定量/%2.84 18.37 5.95 1.42 1.42 7.74 16.65 2.42 0.35 1.80 0.32 0.53 0.22 0.19 2.31 0.20 6.61 0.34 1.19 0.14 11.44 31.22 25.73 25.47 19.85 5.08 51.20 18.05绝对定量/（mg/g 总脂）15.93 102.95 33.37 7.95 7.96 43.31 93.18 13.55 1.97 10.09 1.80 2.94 1.24 1.05 12.90 1.10 36.93 1.91 6.40 0.74 65.30 174.95 143.85 143.76 112.32 28.41 287.60 102.23雌性相对定量/%3.01 20.02 6.40 1.48 1.25 8.01 18.52 2.32 0.38 1.80 0.33 0.52 0.22 0.18 2.12 0.19 7.00 0.31 0.72 0.14 11.06 33.35 27.41 25.23 19.86 4.82 52.64 18.06绝对定量/（mg/g 总脂）19.67 130.72 41.75 9.66 8.18 52.35 121.12 15.19 2.47 11.79 2.19 3.40 1.46 1.21 13.89 1.23 45.84 2.06 4.82 0.87 72.59 217.89 179.26 165.32 130.22 31.56 344.58 118.43
由表2 可知，雄性膨腹海马总脂共分析鉴定出21种脂肪酸，由C14～C22 脂肪酸组成，以C16：0、C18：0、C18：1、C20：5n-3（EPA）、C22：6n-3（DHA）为主。饱和脂肪酸（SFA）含量为31.22%，主要为C16：0（18.37%）、C18：0（7.74%）和C14：0（2.84%）。不饱和脂肪酸（UFA）14 种，含量为51.20%，这与同属脊索动物门鱼纲海龙科的大海马、刺海马、克氏海马的UFA 比例比较接近[21]。其中单不饱和脂肪酸（MUFA）5 种，以C18：1（16.65%）、C16：1（5.95%）为主；多不饱和脂肪酸（PUFA）9 种，以C22：6n-3（11.44%）、C20：5n-3（6.61%）为主。雌性膨腹海马总脂脂肪酸以C18：1（18.52%）、C16：0（20.02%）、C22：6n-3（11.06%）、C20：5n-3（7.00%）为主，其中SFA 占总含量的33.35%，MUFA 占27.41%，PUFA 占25.23%。此外，雌性膨腹海马SFA 和UFA总量均高于雄性膨腹海马，这可能与雌性个体在生长发育过程中需要为性腺发育做准备，因此较雄性个体积累更多脂肪酸等营养物质相关[22]。
膨腹海马雌、雄个体中的总脂脂肪酸含量以及组成成分较为接近，且DHA+EPA 含量高达18.06%，含量远超目前已列入药典中的三斑海马[23]和大海马，与刁海龙相近[24]，表明膨腹海马具有很高的营养价值和脂质功能因子的开发潜力。目前中国膳食指南推荐的n-6/n-3 PUFA 比值为4∶1～6∶1，美国膳食指南推荐的比例为2.3∶1[25]，而我国国民均已超出此范围（7.9∶1～8.6∶1）[26]，表明我国居民应增加n-3 PUPA 摄入量，而通过对海马总脂进行分析发现，海马中n-6/n-3 PUFA比值约为1∶4，说明n-3 PUFA 含量明显高于n-6 PUFA，食用海马有助于我国居民调整n-6 和n-3 PUFA 的摄入比例。
2.3 膨腹海马各脂质组分的脂肪酸组成分析
膨腹海马总脂通过硅胶板薄层层析制备甘油三酯、胆固醇酯、游离脂肪酸和磷脂，通过气相色谱分别分析其脂肪酸组成，结果见表3。
表3 膨腹海马各脂质组分的脂肪酸组成
Table 3 Fatty acid composition of various lipid components in the H. abdominalis%
注：nd 表示未检出。
脂肪酸C14：0 C16：0 C16：1 C17：0 C17：1 C18：0 C18：1 C18：2n-6 C18：3n-6 C18：3n-3 C20：0 C20：1n-9 C20：2 C20：3 C20：4n-6 C21：0 C20：5n-3 C22：0 C22：1 C22：2 C22：6n-3∑SFA∑MUFA∑PUFA∑PUFAn-3∑PUFAn-6∑UFA EPA+DHA雄性甘油三酯4.24 23.82 5.35 1.75 2.26 7.71 18.00 2.82 0.32 1.77 0.47 0.39 0.40 nd 1.29 0.21 5.01 0.41 0.49 1.55 7.76 38.61 26.49 20.92 14.54 4.43 47.41 12.77胆固醇酯3.78 12.13 4.39 1.07 4.83 4.24 13.98 1.72 nd 0.97 0.31 2.02 nd 0.36 2.06 nd 3.78 nd 3.93 nd 6.74 21.53 29.15 15.63 11.49 3.78 44.78 10.52游离脂肪酸2.83 21.70 6.59 1.52 1.80 8.89 27.68 2.94 0.36 1.90 0.24 0.29 0.38 0.12 1.86 0.19 5.46 nd 0.19 1.69 3.43 35.37 36.55 18.14 10.79 5.16 54.69 8.89磷脂3.27 17.11 4.02 1.58 2.42 9.08 19.65 1.97 0.28 1.02 0.36 0.43 0.18 nd 2.55 0.13 4.81 0.37 0.62 0.43 14.09 31.90 27.14 25.33 19.92 4.80 52.47 18.90雌性甘油三酯3.10 25.77 5.29 1.96 1.87 8.77 19.54 2.41 0.33 1.60 0.51 0.36 0.55 0.20 1.25 0.21 4.90 0.41 0.57 2.15 7.51 40.73 27.63 20.90 14.01 3.99 48.53 12.41胆固醇酯3.18 15.38 3.50 0.31 5.63 4.66 16.49 1.45 nd 1.11 nd nd nd nd 1.89 nd 4.14 nd 2.95 0.55 5.73 23.53 28.57 14.87 10.98 3.34 43.44 9.87游离脂肪酸3.11 27.88 5.71 2.05 1.49 11.98 24.30 2.16 0.39 1.38 0.35 0.21 0.57 0.11 1.02 0.14 3.11 nd 0.26 3.05 1.98 45.51 31.97 13.77 6.47 3.57 45.74 5.09磷脂3.84 20.01 3.99 1.56 1.80 11.24 18.49 1.67 0.36 0.84 0.59 0.35 0.32 nd 1.92 0.11 3.92 1.25 1.93 1.38 11.45 38.60 26.56 21.86 16.21 3.95 48.42 15.37
由表3 可知，雌、雄膨腹海马的4 种脂质成分中的饱和脂肪酸均以C16：0 和C18：0 为主，特别是在甘油三酯和游离脂肪酸中C16：0 所占比例超过20%，且C18：0 在磷脂和游离脂肪酸中的占比明显高于甘油三酯和胆固醇酯。此外，在雌、雄膨腹海马胆固醇酯中，均未检出C21：0。
单不饱和脂肪酸在4 种脂质成分中主要以C18：1和C16：1 形式存在，且雌雄差异不大。C20：1n-9 在雄性膨腹海马胆固醇酯中占比达到2.02%，而在雌性海马的胆固醇酯中未检出。
雌、雄膨腹海马中多不饱和脂肪酸在磷脂中的含量为20% 左右，明显高于甘油三酯、胆固醇酯和游离脂肪酸中的含量。4 种脂质成分的共同特征为n-3 PUFA 含量大于n-6 PUFA 含量，且DHA+EPA 含量丰富，EPA 是游离脂肪酸中含量最高的不饱和脂肪酸，DHA 则是其余3 种脂质成分中含量最高的不饱和脂肪酸。综合磷脂组成和磷脂脂肪酸组成结果可知，膨腹海马中富含DHA/EPA 磷脂，已有研究证明，相比于大豆磷脂和卵黄磷脂等陆基食品原料来源磷脂，海洋EPA/DHA 磷脂的功能活性更优[27]。目前，大豆磷脂和卵黄磷脂已作为抗氧化剂被广泛使用[28]，膨腹海马磷脂在抗氧化方面的作用效果值得研究。
3 结论
膨腹海马脂质组成和含量对其在营养功能方面的应用有重要作用。本研究分别对雌、雄膨腹海马的脂质组成和含量进行解析，其中总脂中游离脂肪酸含量最高，磷脂和甘油三酯含量较高，胆固醇酯含量较低且雄性整体高于雌性；总脂富含C16：1、C18：1 等单不饱和脂肪酸以及DHA、EPA 等多不饱和脂肪酸，表明膨腹海马在功能性脂质方面具有较高的营养价值；进一步分析发现，膨腹海马中性脂成分中共检出21 种脂肪酸，其中n-3 多不饱和脂肪酸含量丰富，且多以磷脂形式存在，本研究结果为膨腹海马的综合利用提供了一定的理论依据。
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