青金桔（Citrus microcarpa）又称青桔、山桔等，是芸香科柑橘族金柑属，在我国其主要产自海南、台湾两省，亦分布于越南、马来西亚等东南亚国家[1]。青金桔产量较高，年亩产可达5～8 t，并且青金桔、柑橘等果实中富含有机酸、维生素C、类黄酮、酚酸、柠檬苦素等多种功能活性成分[2-5]，在抗氧化[6]、降血脂[2]、降血糖[7]等方面具有较大的潜力。但青金桔汁表现出较强的酸涩味，不能作为果汁直接食用，需进一步加工处理。并且，青金桔榨汁后产生大量的果渣废弃物，这些果渣基本被丢弃，造成环境污染和资源浪费。
果蔬自然发酵是指通过果蔬自身携带及环境中微生物的新陈代谢作用，合成具有多种生物活性的酶类和复杂代谢产物的过程。因其具有设备投入少、操作简单、发酵产品风味独特、能实现对集中收获果蔬进行快速加工等特点，现已成为果蔬加工研究的热点。
根据前期试验及相关研究，青金桔富含水、果胶、糖类、维生素以及微量元素，在不添加任何其他物质的条件下，其可作为自然发酵的天然培养基，具有良好的发酵潜力[8]。因此，采用全果浆自然发酵可有效解决青金桔资源利用率不高的问题，实现青金桔100% 全利用。并且，研究表明微生物发酵果蔬过程中可产生大量的酶类[9]，可对有机酸、糖类等进行水解[10]，改变发酵基中有机酸的种类及含量[11]，改善产品的风味[12]。Li 等[13]利用多菌种混合发酵的方式改善了柑橘汁的酸度和风味。
目前，关于青金桔中主要有机酸含量的检测方法、青金桔自然发酵过程中有机酸变化规律及滋味变化情况的研究较少。因此，本研究利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）建立发酵青金桔中7 种主要有机酸的检测方法，探究其含量随发酵时间的变化情况，并利用非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析和聚类分析对发酵青金桔中有机酸含量变化规律进行可视化分析，探讨自然发酵对青金桔果浆滋味变化的影响，以期为提高青金桔资源利用率、开发改善青金桔果浆滋味的加工方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青金桔：市售；草酸、柠檬酸、酒石酸、DL-苹果酸、乳酸（均为分析标准品，纯度均≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；琥珀酸（纯度99.0%）：德国默克公司；乙酸（纯度99.5%）：广东光华科技股份有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；甲醇（色谱纯）：德国CNW 公司。
1.2 仪器与设备
DMM-40 型胶体磨：上海秦硕化工机械设备有限公司；LGJ-10NS/GC 型冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；CenLee16X 台式高速离心机：湖南湘立科学仪器有限公司；PLUS-E2-20TJ 实验室级超纯水机：南京易普易达科技发展有限公司；XPR105 型十万分之一电子天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司；Ulti-Mate 3000 高效液相色谱仪：美国Thermo Fisher Scientific 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 有机酸标准曲线的绘制
精确称取适量草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、DL-苹果酸、乳酸、乙酸标准品，配制1～200 µg/mL 浓度的混合标准溶液，其中柠檬酸浓度为3～600 µg/mL，4 ℃贮藏备用。采用外标法定量，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
苹果酸由于手性异构体结构具有右旋体（D-苹果酸）和左旋体（L-苹果酸），DL-苹果酸为D-苹果酸和L-苹果酸的混合物，因此检测时会出现两个苹果酸标准色谱峰，共计8 个色谱峰。
1.3.2 流动相及高效液相色谱分离条件
根据前期预试验，流动相选择以甲醇∶0.01 mol/L磷酸二氢钾=2∶98（体积比）（pH2.85）为最佳。色谱柱：Acclaim 120 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温：30 ℃；进样量：10 µL；流速：0.8 mL/min；紫外检测器波长：210 nm；洗脱方式为等度洗脱。
1.3.3 样品的制备
新鲜采摘的青金桔洗净晾干后打浆，过胶体磨研磨5 次，放置于3 个平行发酵罐中自然发酵。分别于0、1、4、7、10、15、18、21、24、27、35、42、49、56 d 取样，冷冻干燥后研磨成均匀粉状，得到青金桔发酵冻干粉。
取1.0 g 发酵冻干粉，准确加入50.0 mL 蒸馏水，360 W、50 ℃条件下超声30 min，5 000 r/min 离心10 min，收集上清液过0.22 µm 微孔滤膜后贮存备用，稀释适当浓度后测定有机酸含量。
1.3.4 方法学考察
1.3.4.1 检测限和定量限
取混合标准溶液，逐级稀释至适当浓度后检测，以信噪比（S/N）=3 确定为检测限、S/N=10 确定为定量限。
1.3.4.2 加标回收率试验
取青金桔发酵冻干粉，分别加入16、80、160 µg/mL的低、中、高3 种浓度混合标准溶液，按照方法1.3.3 进行样品制备，平行测定3 次。最终计算样品加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.4.3 精密度试验
取同一浓度混合标准溶液连续6 次重复进样，每次进样10 µL，计算7 种有机酸的峰面积及保留时间的RSD。
1.3.4.4 稳定性及重复性试验
稳定性试验：取同一待测样品于室温条件下避光放置0、3、6、9、12、24 h 后，测定7 种有机酸含量RSD。
重复性试验：取同一样品6 份，按照方法1.3.3 进行样品前处理，重复测定样品中7 种有机酸含量RSD。
1.3.5 不同发酵时间有机酸含量数据可视化分析
以7 种有机酸为研究对象，不同发酵时间为变量，采用非度量多维尺度分析和聚类分析，探讨不同发酵时间7 种有机酸的发酵变化情况。
1.3.6 不同发酵阶段发酵青金桔果浆滋味感官评价
根据样品中测定的7 种有机酸含量结合NMDS分析和聚类分析结果，选取不同发酵阶段典型时期（0、21、49 d）进行滋味感官评价。参考Yuasa 等[14]的感官评定方法并稍作修改，评价指标分别为酸味、苦味、口感温和度、口感丰富度、总体接受度，评价分数为0（弱）～5（强）。参与滋味感官评价的10 人均为食品专业领域的研究人员，经历过专业培训，其中男性6 名，女性4 名，年龄分布在24～35 岁。
1.4 数据处理与分析
试验中所有指标平行测定3 次，结果以平均值±标准差的形式表示。高效液相色谱结果采用变色龙7.0软件进行处理；使用SPSS Statistics 23 对各组均值进行单因素方差分析和显著性分析，P＜0.05 表示显著性水平；运用Origin 2021 进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 有机酸标准品色谱图及线性关系
有机酸混合标准品高效液相色谱图见图1。
图1 有机酸混合标准品高效液相色谱图
Fig.1 High performance liquid chromatogram of organic acid mixed standard
由图1 可知，各有机酸标准品分离效果较好，各标准物质保留时间集中在3～12 min，依次分别为草酸3.30 min、酒石酸3.79 min、L-苹果酸4.95 min、乳酸6.36 min、乙酸6.99 min、柠檬酸8.50 min、D-苹果酸9.25 min、琥珀酸11.37 min。流动相及高效液相色谱分离条件可用于后续样品定性分析。
以标准物质峰面积对相应浓度进行线性回归分析，其中DL-苹果酸标准品具有D-苹果酸和L-苹果酸两个手性异构体色谱峰，计算时以D-苹果酸和L-苹果酸峰面积与质量浓度进行线性回归分析，结果如表1所示。
表1 有机酸标准曲线回归分析
Table 1 Regression analysis of standard curves of organic acids
有机酸草酸酒石酸DL-苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸回归方程y=0.165 5x-0.113 5 y=0.033 2x+0.001 1 y=0.021 1x+0.006 7 y=0.009 1x-0.000 9 y=0.008 2x+0.001 1 y=0.014 6x-0.007 3 y=0.007 1x+0.001 2相关系数（R2）0.999 93 0.999 90 0.999 99 0.999 99 0.999 99 0.999 98 0.999 94线性范围/（µg/mL）1～200 1～200 1～200 1.282～200.000 1～200 3～600 1.388～200.000平均分离度3.77 7.80 7.97 3.61 7.12 3.12 2.89
由表1 可知，7 种有机酸在线性范围内相关系数分布在0.999 90～0.999 99 之间，各标准品峰面积与质量浓度呈现较好的线性关系，且分离度良好，可进行后续样品定量分析。
2.2 检测限、定量限及精密度
有机酸检测限、定量限及方法精密度结果见表2。
表2 有机酸检测限、定量限及方法精密度
Table 2 Limit of detection， limit of quantification and method precision of organic acids
有机酸草酸酒石酸L-苹果酸乳酸乙酸柠檬酸D-苹果酸琥珀酸检测限/（µg/mL）0.263 0.165 0.118 0.385 0.300 0.114 0.270 0.416定量限/（µg/mL）0.877 0.550 0.393 1.282 1.000 0.424 0.901 1.388精密度峰面积RSD/%0.16 0.95 6.72 5.42 2.35 0.16 0.86 0.36保留时间RSD/%0.00 0.00 0.03 0.05 0.05 0.10 0.08 0.12
由表2 可知，7 种有机酸检测限为0.114～0.416 µg/mL，定量限为0.393～1.388 µg/mL。连续6 次进样，各有机酸峰面积RSD 在6.72% 以内，保留时间RSD 在0.12%以内，精密度良好。
2.3 加标回收率
样品加标回收率结果如表3 所示。
表3 样品加标回收率
Table 3 Recoveries of sample
有机酸草酸酒石酸DL-苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸低浓度加标量/（µg/mL）16.00 16.00 16.00 16.00 16.00 48.00 16.00平均测定量/（µg/mL）15.27 14.98 15.83 15.37 15.35 50.72 15.75中浓度加标量/（µg/mL）80.00 80.00 80.00 80.00 80.00 240.00 80.00平均测定量/（µg/mL）77.82 81.03 78.02 75.88 78.80 239.27 76.77高浓度加标量/（µg/mL）160.00 160.00 160.00 160.00 160.00 480.00 160.00平均测定量/（µg/mL）151.32 158.26 155.89 142.36 163.48 493.67 156.44平均加标回收率/%95.76 97.94 97.95 93.29 98.86 102.74 97.40 RSD/%2.12 4.69 6.14 5.13 4.93 6.29 3.91
由表3 可知，本方法低、中、高3 种浓度平均加标回收率在93.29%～102.74% 之间，说明该方法回收率较好，准确度较高，满足试验的检测要求。
2.4 稳定性及重复性
方法稳定性结果见表4，方法重复性结果见表5。
表4 方法稳定性
Table 4 Method stability
有机酸草酸酒石酸DL-苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸有机酸含量/（µg/mL）0 h 103.22 139.19 186.52 8.22 468.52 452.42 27.32 3 h 103.17 137.23 187.31 8.39 471.22 452.90 27.19 6 h 102.92 136.23 187.00 8.87 471.48 452.74 27.56 9 h 102.73 137.02 186.58 8.74 477.09 452.14 27.20 12 h 102.93 137.98 188.23 8.74 470.30 452.80 26.14 24 h 101.37 135.32 182.14 8.67 483.05 452.78 26.27 RSD/%0.67 0.98 1.14 2.87 1.15 0.06 2.19
表5 方法重复性
Table 5 Method repeatability
有机酸草酸酒石酸DL-苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸有机酸含量/（µg/mL）104.30 138.47 190.47 9.51 478.03 4 544.42 27.06 104.22 137.82 191.34 10.02 480.85 4 541.01 26.89 105.10 137.36 192.02 9.49 480.79 4 551.90 27.07 106.82 139.18 192.33 9.78 492.05 4 613.70 26.21 105.78 138.58 193.14 9.78 481.50 4 535.31 26.54 105.37 140.28 194.24 8.84 469.76 4 500.24 25.23 RSD/%0.93 0.74 0.69 3.67 1.49 0.81 2.66
由表4 可知，不同检测时间有机酸含量RSD 在0.06%～2.87%之间，稳定性好。由表5 可知，各有机酸含量RSD 在0.69%～3.67% 之间，具有较为良好的重复性。
2.5 青金桔发酵过程中7 种有机酸含量变化情况
有机酸广泛分布于柑橘类水果，是柑橘水果酸味来源的主要原因之一[15]。采用上述试验方法对发酵青金桔样品中有机酸含量进行测定，样品中有机酸分离图谱见图2。
图2 样品中有机酸高效液相色谱图
Fig.2 High performance liquid chromatography of organic acids in samples
由图2 可知，7 种有机酸在样品中均有检出，各有机酸分离情况较好，可用于定性及定量分析。
不同发酵时间7 种有机酸含量变化情况如图3所示。
图3 不同发酵时间有机酸含量变化
Fig.3 Changes in organic acid content at different fermentation times
由图3 可知，0～56 d 的自然发酵过程中7 种有机酸含量均产生了明显变化。发酵过程中各有机酸含量变化范围分别为草酸3.37～5.38 g/kg、酒石酸6.61～7.69 g/kg、DL-苹 果 酸18.75～25.43 g/kg、乳 酸0.47～0.86 g/kg、乙酸0.05～24.11 g/kg、柠檬酸225.94～238.75 g/kg、琥珀酸0.19～1.42 g/kg。青金桔中草酸、乙酸、琥珀酸含量随着发酵时间延长整体呈增加趋势。酒石酸与柠檬酸含量变化情况相似，随着发酵时间的延长表现出先增加后降低的趋势。DL-苹果酸和乳酸含量则整体呈下降趋势。
与其他柑橘类水果类似，柠檬酸、苹果酸是青金桔中主要的有机酸，而琥珀酸的含量要低得多，这与Cheong 等[16]的研究结果相同。相关研究表明柠檬酸可支持发酵乳杆菌生长繁殖[10]，同时柠檬酸盐可以丙酮酸作为中间体进行代谢，转化为甲酸、乙酸、二氧化碳等[17-18]，这与本文发酵过程中乙酸含量明显增加的结果相一致。发酵前期柠檬酸和酒石酸含量增加可能与益生菌对柠檬酸的弱代谢[19]以及微生物对于可溶性糖的生物转化相关[20]。发酵后期柠檬酸和酒石酸含量降低的原因可能是1）益生菌类微生物分解成乙酸、双乙酰等产物[21]；2）乳酸菌将酒石酸转化为草酰乙酸，草酰乙酸进一步用于三羧酸循环[22]，从而产生琥珀酸代谢产物。Chen 等[23]研究表明，发酵过程中苹果酸含量逐渐降低，可能是发酵过程中乳酸菌通过三羧酸循环消耗了苹果酸。此外，苹果酸可在苹果酸脱氢酶的作用下参与三羧酸循环，生成草酰乙酸，并进一步产生草酸及柠檬酸。而乙酸和琥珀酸含量不断堆积的结果也与Dessie 等[24]的发酵结果相似。
2.6 不同发酵时间有机酸含量NMDS 结果
NMDS 是基于Bray-Curtis 距离的非线性模型，以不同样品点之间的距离来反映不同样本之间以及组内的差异[25]，根据不同发酵时间与7 种有机酸含量变化情况将信息反映在二维平面上。NMDS 结果如图4 所示，应力系数（stress）＜0.05 表示数据排序真实，具有良好的代表性。
图4 不同发酵时间有机酸含量NMDS 结果
Fig.4 NMDS results of organic acid content at different fermentation times
由图4 可知，不同发酵时间有机酸变化情况数据点分区状况良好，不同区域之间差异较为明显。根据有机酸含量变化情况将发酵时间分为3 个类群，即Ⅰ组（0、1、4、7 d）、Ⅱ组（10、15、21、24、27、35 d）、Ⅲ组（42、49、56 d）。Ⅰ组主要位于NMDS 左侧，各样点间距离相对分散，表明该组内随着发酵的进行有机酸含量产生较为显著的变化。发酵第7 天的样品点D7 相对较为离散且趋于过渡状态，说明发酵时间在第7 天后进入了下一阶段。Ⅱ组样品点主要位于NMDS 右上区域，各样品点之间距离相对比较接近，表明该组内不同发酵时间样品点之间的相似性系数高，有机酸含量变化较为稳定。Ⅲ组样品点位于NMDS 右下区域，样品点相对较少且相对于Ⅱ组较为分散，后续研究可适当延长发酵时间和增加样本数。7 种发酵有机酸含量变化结合NMDS 结果表明，发酵时间具有明显的阶段化特征。
2.7 不同发酵时间有机酸含量聚类分析结果
为进一步探讨青金桔发酵过程中发酵时间与有机酸变化之间的联系，进行聚类热图分析，不同发酵时间与有机酸含量之间的差异特征如图5 所示。
图5 不同发酵时间有机酸含量聚类分析
Fig.5 Cluster analysis of organic acid content at different fermentation times
由图5 分析可知，发酵过程可分为3 个时期，即发酵初期（0～7 d）、发酵稳定期（10～35 d）、发酵后期（42～56 d）。结合图3 和图5 分析可知，在整个发酵时期柠檬酸和DL-苹果酸都是优势有机酸。发酵初期有机酸总量呈上升趋势，其中柠檬酸、酒石酸、草酸、乙酸、琥珀酸含量明显提高。发酵稳定期有机酸总量保持在峰值范围内，柠檬酸、酒石酸含量趋于稳定。发酵后期有机酸总量逐渐降低，柠檬酸、酒石酸、DL-苹果酸、乳酸含量均明显降低。其中在56 d 的发酵期内DL-苹果酸、乳酸含量均呈下降趋势，乙酸和琥珀酸则逐步明显增加至峰值。
2.8 不同发酵时间青金桔果浆的滋味感官评价结果
有机酸在维持感官品质方面具有十分重要的作用，为探究不同发酵时间内青金桔果浆的滋味变化情况，选取0、21、49 d 3 个不同发酵时间的样品进行滋味感官评定，结果如图6 所示。
图6 不同发酵时间滋味感官评价结果
Fig.6 Taste sensory evaluation results of different fermentation times
由图6 可知，酸味是柑橘水果的重要口味之一，相较于0 d 和49 d，以21 d 为代表的样品（即发酵稳定期）具有较高酸味，这与有机酸总量保持了相同的变化情况。同时这与Yuasa 等[14]探究发酵柑橘汁酸味与总有机酸含量变化展现出相似的结果。Yu 等[10]研究表明，发酵柑橘的酸度变化时，发酵过程中的益生菌会调节柠檬酸和乙酸的含量，这表明发酵过程中酸度的变化与有机酸含量的改变处于动态调整过程。柠檬苦素是柑橘类水果呈现苦味的主要原因之一，图6 中不同发酵阶段苦味强度变化可能与青金桔果浆发酵过程中柠檬苦素含量的变化相关[26]。此外，柠檬酸、乙酸等有机酸可在不同浓度条件下与苦味口感相互作用，从而对苦味具有增强或掩盖（抑制）效果[27-28]。苹果酸可产生强烈而刺激的酸味，是重要的风味混合成分，发酵稳定期和后期（21 d 和49 d）发酵青金桔果浆的口感温和度得到改善可能与苹果酸含量的降低相关[29]，而口感丰富度得到改善可能是因为草酸、乙酸、琥珀酸等多种有机酸含量逐渐增加，从而使口感更具层次性。在总体接受度方面，发酵后期（49 d）因酸味、苦味以及口感丰富度的改善表现出更高的总体接受度。这可能与不同有机酸可对咸味、鲜味、甜味、苦味等其他基础味觉发生二元或三元的不对称相互作用相关[30-33]，这将带来更加丰富的口感和风味。综上，发酵过程中滋味的变化可能与有机酸含量的变化具有相关性，但具体变化机理仍待更加深入的研究。
3 结论
本研究通过高效液相色谱法对自然发酵青金桔中草酸、酒石酸、DL-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸含量进行测定，在线性浓度范围内所得7 种有机酸标准曲线相关系数R2 在0.999 90～0.999 99 之间，且分离度 较 高，检 测 限 为0.114～0.416 µg/mL，定 量 限 为0.393～1.388 µg/mL，精密度峰面积RSD 在6.72%以内，保留时间RSD 在0.12%以内，加标回收率在93.29%～102.74% 之间，稳定性、重复性试验RSD 均在3.67%以内。该检测方法快速，具有较好的准确度和精密度，可适用于发酵柑橘样品中有机酸含量的测定。
通过对发酵青金桔样品中有机酸含量检测，柠檬酸、DL-苹果酸是发酵青金桔中的主要有机酸。自然发酵可明显改变7 种有机酸含量，结合NMDS 和聚类分析结果，可将0～56 d 的发酵时间分为3 个时期。发酵初期0～7 d，该时期内有机酸总量逐渐增加，柠檬酸、酒石酸、草酸含量明显增加，青金桔果浆酸味口感增强。发酵稳定期10～35 d，期间柠檬酸、酒石酸等含量变化趋于稳定，口感丰富度和口感温和度得到改善。发酵后期42～56 d，该时期柠檬酸、酒石酸均呈现显著性降低，酸苦味降低，口感丰富度和口感温和度进一步改善，总体接受度增加。在整个发酵时期乙酸、琥珀酸均明显增加，DL-苹果酸、乳酸均明显降低。综上所述，本研究建立了自然发酵青金桔中7 种有机酸含量的检测方法，并对青金桔自然发酵过程中7 种有机酸含量变化情况进行了探讨，为后续发酵青金桔果浆及其相关产品的开发与利用提供借鉴和指导。
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