真菌毒素是某些产毒真菌在适宜条件下的次级代谢产物[1]。超过400 种真菌毒素已被正式定义[2]，其中赭曲霉毒素是最重要且毒性最强的真菌毒素之一[3]。赭曲霉毒素，包括赭曲霉素A（ochratoxin A，OTA）、赭曲霉素B 和赭曲霉素C[4]，作为一种天然存在的次生真菌代谢产物[5]，存在于许多食品中，由赭曲霉和疣状青霉菌等多种真菌产生[6]。在这些代谢产物中，赭曲霉素A 作为毒性最强、产量最高的一种，广泛存在于咖啡、豆类、葡萄、谷物制品中[6]。OTA 具有肝毒性、肾毒性、致畸性和胎儿毒性[7-9]，并被国际癌症研究机构归类为可能的人类致癌物[10]。欧盟将食物中OTA 的最高浓度设定为葡萄酒（或葡萄汁）中OTA 浓度为2 ng/mL，咖啡产品中OTA 含量为5 ng/mL[11]。意大利卫生部将婴儿食品中OTA 的限量定为0.5 pg/mL [12-13]。因此，为确保食物的品质安全，开发快速灵敏的OTA 检测方法是非常紧迫和必要的。
研究人员高度关注OTA 污染的相关问题，已经开发了不同的OTA 检测技术用于食品品质评估[14]。色谱法因其高灵敏度和可靠性，被用于OTA 的常规检测[15-16]，但价格昂贵，需要庞大的仪器、复杂的操作，不适用于OTA 的快速检测和现场分析[17-18]。免疫测定作为检测OTA 的替代方法，具有便于操作、良好的选择性和高通量筛选的优点[19-20]。免疫反应本身具有高度特异性，电化学换能器产生的电信号具有高灵敏度，换能器表面上抗体和抗原之间具有强结合力[21-22]，从而避免了繁琐的步骤和笨重的仪器[23-24]。与基于光学的方法相比，免疫传感器抗干扰能力强，可以开发便携式分析设备[25]。电化学免疫传感器通过固定抗体或抗原以形成稳定的复合物，综合了免疫分析和生物传感器的优点，在食品分析领域具有很好的应用前景[26-27]。
在过去的二十年中，由于丝网印刷技术有待成熟[28]，食品行业若使用快速检测的方法可能对检测结果造成影响，检测仍需要采用可靠的传感系统[29]。因此，相对于复杂的色谱和光谱技术，小型化现场检测系统是有效替代工具[30]。丝网印刷碳电极（screen printing carbon electrode，SPCE）是通过丝网印刷技术制作的一种电极[31]，与金属电极相比，它们表现出更宽泛的潜在应用价值[32-33]，SPCE 不需打磨和化学处理即可直接使用[34]，此外，它设计简单、选择性好、便携性好、准确度高以及成本低[35]，有很高的灵敏度及很好的特异性[36]，上述优点使电化学免疫传感器的快速发展和推广应用成为可能[37-39]。
通常，电化学免疫传感器制备的第一个关键步骤是电极表面的修饰[27，40]。在分析过程中，电极表面足量的抗体对灵敏度至关重要[26]。为了将抗体偶联到电极上，常见的一种技术是将胺、炔和羧酸等官能团修饰在电极上[41]。但非共价亲和存在自身不稳定的问题，并且常用的有机溶剂与普通复合黏合剂不相溶[42-44]。另一种常见的功能化技术是重氮盐的共价接枝[45-46]。这种类型的修饰是简单快速且稳定的[47]。研究发现，碳电极上的重氮衍生单层比金上的烷硫醇自组装单层更加稳定，稳定的偶联剂使固定的生物分子牢固地黏附在电极表面上，生物分子从而能够用于后续的分析步骤[48-50]。
为制备一种用于OTA 快速检测的电化学免疫传感器，本研究将OTA 抗体和重氮盐接枝在电极表面，利用循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法、电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）以及差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法进行相应的测定，以期为OTA 的检测提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
赭曲霉素A、小鼠抗OTA 单克隆抗体：瑞士Alexis公司；4-氨基苯甲酸、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、1 mol/L 硫酸、氯化钾、1 mol/L 盐酸、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-（N-吗啡啉）乙磺酸[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES]、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydro chloride，EDC]（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]·3H2O）（均为分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；Ag/AgCl 丝网印刷电极：青岛波碳科技有限公司。
1.2 仪器与设备
CHI760E 型电化学工作站：上海辰华仪器有限公司；S4800 型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）：日本日立公司。
1.3 试验方法
1.3.1 电极表面重氮官能化
将1 mol/L NaNO2 和2 mmol/L 的4-氨基苯甲酸在0.5 mol/L 的盐酸溶液中混合，将其放置在室温下反应5 min 以合成重氮阳离子。随后立即在SPCE 电极上进行线性扫描，在电极表面形成4-氨基苯基的改性膜。
对电极进行电接枝之后，用EDC/NHS 激活电极表面的羧基。在室温下，将磷酸缓冲盐溶液（pH5.5）孵化到电接枝后的工作电极上。将孵化后的电极用蒸馏水进行清洗，氮气吹干。
1.3.2 抗体固定化
取20 µL 配制好的抗体溶液沉积在修饰电极表面上，并在室温下反应。用磷酸缓冲盐溶液洗涤电极，然后将BSA 滴加到电极上进行孵育。孵育后洗涤电极，氮气吹干。
1.3.3 试验条件的优化
对CV 扫描电位、电解液种类、4-氨基苯甲酸浓度、抗体沉积时间以及BSA 封闭液沉积时间进行条件优化，每个条件测试3 次。
1.3.3.1 CV 扫描电位
设定-0.3～0.6、-0.3～0.7、-0.3～0.8、-0.3～0.9 V 不同的扫描电位检测范围，通过分析响应电流值的变化量对CV 扫描电位进行优化。
1.3.3.2 电解液种类
电解液作为氧化还原探针，它的种类对免疫传感器的性能有重要影响。利用循环伏安法比较了电化学免疫传感器在不同电解液中免疫前后峰电流的变化量。选取0.1 mol/L PBS、5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L K4[Fe（CN）6]以及5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol/L KCl）4 种电解液，将OTA 待测溶液滴加到电化学免疫传感器上进行孵育，利用循环伏安法测定其响应电流值，电位范围为-0.3～0.9 V，扫描速度为0.5 V/s。
1.3.3.3 4-氨基苯甲酸浓度
通过修饰前后响应电流值的变化量探究不同4-氨基苯甲酸的电沉积浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）对修饰效果的影响。
1.3.3.4 抗体沉积时间
在免疫分析检测中，本试验对直接竞争中组装抗体进行了优化选择，以达到最适合的检测条件。通过改变自组装抗体的沉积时间，分别将抗体在电极上沉积30、45、60、75、90 min 后，测定电极CV 响应电流值。
1.3.3.5 BSA 封闭液沉积时间
测定BSA 封闭液在电极上的沉积时间分别为10、15、30、45、60、75 min 后的CV 电流响应峰值，进一步得到响应电流值的变化量。
1.3.4 电极电子传输扩散的表征
为研究所修饰电极电子传输扩散的电化学行为，对0.05、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 V/s 不同扫描速度下修饰电极的循环伏安曲线进行表征。
1.3.5 电化学免疫传感器的表征
1.3.5.1 电化学表征
为保证修饰过程的每一步都顺利进行，用CV 和EIS 两种方法表征电极修饰的每个过程。测试底液是含有0.1 mol/L KCl 的5.0 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-。其中，铁氰化钾和亚铁氰化钾用作电化学探针，氯化钾为支持电解质。
1.3.5.2 形貌表征
为研究各步骤不同材料在电极表面的修饰情况，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）对各修饰阶段的电极进行形貌表征。
1.3.6 免疫传感器对赭曲霉素A 的DPV 检测
用0.1 mol/L 的磷酸盐（phosphate buffer saline，PBS）缓冲溶液（pH7.4）将OTA 配制成一系列不同浓度的OTA 标准溶液，将其滴涂到制备好的电化学免疫传感器的电极表面，在室温条件下孵育20 min，于测试底液中运用差分脉冲伏安法测定免疫传感器在不同浓度标准溶液的峰电流值，并分析加标前后电流值变化量与相对应的赭曲霉素A 浓度间的关系，绘制标准曲线。
1.3.7 实际样品的检测
称取充分粉碎的玉米、小麦、大米以及咖啡样品5 g，加入25 mL 60% 甲醇溶液超声辅助提取10 min，10 000 r/min、4 ℃离心15 min，取1 mL 上清液用等体积60% 甲醇溶液稀释后备用。用移液枪取葡萄酒样品1 mL，用等体积60%甲醇溶液稀释后备用。
1.3.8 特异性测定
首先将电化学免疫传感器分别置于10 ng/mL 标准溶液[赭曲霉素A、黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、地塞米松、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）以及伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1）]中进行孵育，然后测定DPV电流响应值，根据电流的变化量进行传感器特异性的评价。
1.3.9 稳定性测定
将制备好的免疫传感器连续CV 扫描15 圈，测定电化学免疫传感器的日内稳定性。将制备好的电化学免疫传感器置于4 ℃密闭保存14 d，每2 d 进行1 次CV 扫描，以测定电化学免疫传感器的日间稳定性。
1.4 数据处理
利用2010 版Excel 对数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，利用Origin 2019 软件作图。
2 结果与分析
2.1 试验条件的优化
2.1.1 CV 扫描电位范围对电化学免疫传感器的影响
随着材料在电极上的组装以及电极上免疫反应的发生，由于电催化的特性，氧化还原峰之间的距离变大，因此，以免疫反应结束后的电极为试验材料，进行CV 扫描电位范围的优化。CV 扫描电位范围对电化学免疫传感器的影响见图1。
图1 CV 扫描电位范围对电化学免疫传感器的影响
Fig.1 Effect of CV scanning potential range on electrochemical immunosensors
由图1 可知，在不同的扫描电位检测范围内，随着电位范围的增大，氧化峰逐渐出现在范围之内，直至上限范围为0.8 V 和0.9 V 时，能看到明显的峰，且还原峰均在检测范围内。考虑到电极间存在的差异以及免疫反应对出峰位置的影响等因素，并保证氧化还原峰均在检测范围内，CV 扫描电位范围选择-0.3～0.9 V。
2.1.2 电解液种类对电化学免疫传感器的影响
电解液种类对电化学免疫传感器的影响见表1。
表1 电解液种类对电化学免疫传感器的影响
Table 1 Effect of electrolyte types on electrochemical immunosensorsµA
注：Ipc 为氧化峰峰值电流；ΔIpc 为氧化峰峰值电流差值；Ipa 为还原峰峰值电流；ΔIpa 为还原峰峰值电流差值。
电解液种类0.1 mol/L PBS 5 mmol/L K3[Fe（CN）6]5 mmol/L K4[Fe（CN）6]5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol/L KCl）Ipc反应前24.67 51.86 55.68 71.64反应后22.18 46.07 48.91 59.78 ΔIpc 2.49 5.79 6.77 11.8 6 Ipa反应前-30.54-46.27-42.25-70.88反应后-33.63-50.76-48.32-79.95 ΔIpa 3.09 4.49 6.07 9.07
由表1 可知，在5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol/L KCl）的电解液中，电化学免疫传感器免疫反应前后的氧化电流变化为11.86 µA，还原电流变化为9.07 µA，与其他电解液相比，该电解液反应前后氧化、还原电流的变化幅度最大。因此选择5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol/L KCl）的溶液为电解液。
2.1.3 4-氨基苯甲酸浓度对电化学免疫传感器的影响4-氨基苯甲酸浓度对电化学免疫传感器的影响见图2。
图2 4-氨基苯甲酸浓度对电化学免疫传感器的影响
Fig.2 Effect of 4-aminobenzoic acid concentration on electrochemical immunosensors
4-氨基苯甲酸在整个电极修饰过程中起到的是提供基团以连接抗体的作用，而其本身是一个不导电的物质，所以电沉积过多会导致对氨基苯甲酸聚合膜厚度过厚，从而大大降低电化学传感器检测的灵敏度；但是电沉积过少也会使得4-氨基苯甲酸没有完全覆盖到电极表面，导致聚合膜不均匀、容易脱落，进而影响后续材料的连接效果。由图2 可知，随着4-氨基苯甲酸浓度的增加，响应电流的变化量逐渐增大，说明电沉积到电极上的4-氨基苯甲酸增多，可以连接更多的抗体来进行特异性结合，当4-氨基苯甲酸浓度为2.0 mmol/L时，响应电流变化量达到最大值，随后继续增加4-氨基苯甲酸浓度，响应电流变化量大幅降低，这是由4-氨基苯甲酸的绝缘性所引起的。因此，4-氨基苯甲酸的浓度选用2.0 mmol/L。
2.1.4 抗体沉积时间对电化学免疫传感器的影响
抗体沉积时间对电化学免疫传感器的影响见图3。
图3 抗体沉积时间对电化学免疫传感器的影响
Fig.3 Effect of antibody deposition times on electrochemical immunosensors
在电化学免疫传感器中，抗体作为识别元件，其修饰固定对于传感器的后续检测至关重要。合适的抗体沉积时间能够将抗体在保证其最佳生物活性的前提下最大限度的修饰于电极表面，使免疫电极的响应电流最大化。由图3 可知，随着抗体沉积时间的延长，电流响应值的变化量也不断增大，当抗体沉积时间延长至60 min 时，电流变化量达到最大值，随后继续延长抗体沉积时间，电流响应值的变化量减小。造成这种现象的原因是随着抗体沉积时间的延长，有越来越多的抗体被修饰到电极上，进而可与抗原进行特异性结合，电流响应增大，当抗体沉积时间超过60 min 时，由于沉积时间过长，抗体的活性受到影响，其与抗原的结合受到限制，最终导致电流响应值的变化量降低。因此，选定60 min 作为抗体沉积时间。
2.1.5 BSA 封闭液沉积时间对电化学免疫传感器的影响
BSA 封闭液沉积时间对电化学免疫传感器的影响见图4。
图4 BSA 封闭液沉积时间对电化学免疫传感器的影响
Fig.4 Effect of deposition times of BSA blocking buffer on electrochemical immunosensors
BSA 封闭液是免疫组化试验中最常用的封闭液，适用于大多数情况。BSA 封闭液的沉积效果会直接影响抗原抗体的免疫反应，进而对检测结果造成影响。由图4 可知，随着BSA 封闭液沉积时间的延长，电流响应值的变化量先增加后降低，当BSA 封闭液沉积时间为60 min 时，电流响应值的变化量达到最大值，BSA封闭液沉积时间继续延长，电流响应值的变化量减小。这是因为随着BSA 封闭液沉积时间的延长，修饰到电极上的封闭液增多，电流响应值的变化量增大，当BSA封闭液沉积时间超过60 min 时，有越来越多的BSA 沉积到电极上，形成了一层蛋白膜，蛋白质作为一种不导电的物质，阻碍了电子的传递，电子的转移速率下降，最终导致电流响应值的变化量降低。因此，BSA 封闭液沉积时间选为60 min。
2.2 电极电子传输扩散的影响
电极电子传输扩散的影响见图5。
图5 电极电子传输扩散的影响
Fig.5 Effect of electron transmission and diffusion of electrode
由图5A 可知，在0.05～0.80 V/s 的范围内，氧化还原峰响应电流值随着扫描速率的增加而增加，峰位置逐渐稳步分离，并且与扫描速率的平方根成正比。由图5B 可知，扫描速率平方值与峰值电流的相应线性关系：1）氧化峰y=4.179×10-4x+2.619×10-5，R2=0.999 9；2）还原峰y=-4.349×10-4x-4.568×10-5，R2=0.998 1。扫描速率平方值与峰值电流间呈线性关系，表明该电子传输过程受扩散控制。
2.3 电化学免疫传感器的表征
2.3.1 电化学表征
电极组装各步骤的电化学表征见图6。
图6 电极组装各步骤电化学表征
Fig.6 Electrochemical characterization of electrode assembly steps
由图6A 可知，4-氨基苯甲酸本身具有不导电性，当其修饰在电极上时极大的阻碍了电极表面电子的传递，因此峰电流明显降低；之后经MES 缓冲液修饰，电极表面的羧基得到活化，导电性增大，表现为峰电流明显增大；赭曲霉素A 的抗体通过酰胺键合的方式固定在电极表面后，抗体作为一种免疫蛋白相当于一层电子传递的阻挡膜，排斥电极中氧化还原系统的电子转移，从而使电流下降；BSA 本质是一种大分子蛋白质，其作为一种惰性分子，同样阻碍电子的传递，在经过BSA 封闭液封闭之后，峰值电流明显降低；加标后抗原抗体的特异性结合导致工作电极表面与电解液中氧化还原对的接触受到阻碍，电子转移的速率进一步下降，表现为响应电流降低。随着电极材料的逐步修饰，还原峰电流逐渐增大，氧化峰电流逐渐减小，且还原峰电位负移，表现为典型的电催化特性，也进一步说明每一步修饰过程的成功。
在电化学阻抗谱图中半圆形部分为高频区，表示电子转移受限过程，其中半圆的直径表示电子转移电阻，其大小是由修饰电极表面和电解液界面之间的绝缘能力决定的。由图6B 可知，裸电极的阻抗图中半圆部分很小，说明当前电极具有良好的导电性；当4-氨基苯甲酸修饰到电极上时，阻抗的半圆部分急剧增大，这是由于4-氨基苯甲酸的不导电性使得[Fe（CN）6]3-/4-探针分子很难到达电极的表面，阻抗值增大；经MES缓冲液对电极表面羧基进行活化后，提高了电子转移的速率，从而阻抗值明显降低；将抗体通过化学键合的方式修饰到电极表面后，又阻碍了电化学探针分子向电极表面扩散，因此，阻抗值又有所回升；BSA 作为封闭液封闭未占据的位点，其不导电性进一步阻碍电子的转移，导致工作电极表面的等效电阻增大；滴加标品后，标品中游离的OTA 与电极上固定的抗体进行特异性免疫反应，抗原抗体之间的结合不断阻断电子的转移，阻抗值进一步增加，表明抗原抗体反应的成功进行。
2.3.2 SEM 表征
不同修饰阶段电极表面扫描电镜图见图7。
图7 电极修饰各步骤扫描电镜图
Fig.7 SEM images of electrode modification steps
由图7A 可知，裸电极的表面展现出典型的片状石墨颗粒以及大空腔；由图7B、图7C 可知，通过电沉积的方式将4-氨基苯甲酸修饰到电极表面，电极表面变得粗糙不平滑，继而对羧基进行活化生成表面4-羧基苯基，将羧基固定在电极表面。同时，SPCE 表面的尖端、浮雕和凹陷会受到不均匀电荷分布的影响，促进片状石墨颗粒非均匀尺寸的形成；由图7D 可知，抗体已经分布在电极表面，这是因为抗体的氨基基团与先前已被修饰于电极表面的羧基之间通过共价键合形成酰胺键，从而完成抗体的固定化；由图7E 可知，电极表面有明显的一层网状结构，BSA 均匀分布在电极表面以封闭非特异性结合位点，保证后续抗原抗体的特异性结合；由图7F 可知，在经BSA 封闭后的电极上滴加OTA 后，抗原与抗体的特异性位点特异性结合，实现目标物质的检测。
2.4 标准曲线的建立
差分脉冲伏安法具有高灵敏度和高分辨率的特点，在最优试验条件下，修饰电极对目标物OTA 的电流响应能力见图8。
图8 修饰电极对目标物OTA 的电流响应能力
Fig.8 Current response ability of modified electrodes to OTA of target object
由图8 可知，当赭曲霉素A 的浓度为2～200 ng/mL时，电流响应峰值与赭曲霉素A 的浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为ΔI=1.14×10-7COTA+2.07×10-6，线性相关系数R2=0.992 5，OTA 的检测限（limit of detection，LOD）为0.5 ng/mL。
2.5 样品加标回收试验
为评价所制备的电化学免疫传感器在实际应用中的可行性，以玉米、小麦、大米、咖啡和葡萄酒作为样品的基质，于赭曲霉素A标准品的3 个浓度（10、20、50 ng/mL）下进行添加回收试验。3 种浓度OTA 的加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）见表2。
表2 3 种浓度OTA 的加标回收率及精密度
Table 2 Standard recovery and precision of three OTA concentrations
样品葡萄酒玉米小麦大米咖啡加标量/（ng/mL）10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 10 20 50 OTA 回收量/（ng/mL）9.05±0.42 19.63±1.30 47.15±0.84 9.22±0.26 19.72±0.73 49.84±1.75 9.82±0.49 20.18±0.83 47.59±0.77 9.40±0.12 19.39±0.62 48.79±1.76 9.55±0.14 19.88±0.63 50.17±1.83回收率/%90.54±0.04 98.16±0.06 94.30±0.02 92.24±0.03 98.61±0.04 99.67±0.04 98.20±0.05 100.92±0.04 95.18±0.02 94.03±0.01 96.96±0.03 97.58±0.04 95.54±0.01 99.40±0.03 100.35±0.04 RSD/%4.60 6.61 1.78 2.83 3.72 3.51 5.02 4.12 1.61 1.25 3.22 3.62 1.50 3.18 3.64
由表2 可知，5 种样品在3 个浓度下的回收率为90.54%～100.92%，表明本试验中开发的赭曲霉素A电化学免疫传感器可以准确可靠地对谷物（玉米、小麦、大米）、咖啡及葡萄酒样品中的赭曲霉素A含量进行定量分析。
2.6 特异性分析
电化学免疫传感器特异性结果见图9。
图9 电化学免疫传感器特异性
Fig.9 Electrochemical immunosensor specificity
由图9A 可知，在各种真菌毒素中，该电化学免疫传感器对赭曲霉素A 的电流响应值最高，其他检测物与其相比，电流变化量极小，不超过4.27%，说明固定在电极表面的抗体与OTA 之间发生特异性结合，当游离的OTA 与抗体结合之后，相当于在电极表面形成一层新的薄膜，由于薄膜具有绝缘性，阻碍了氧化还原探针与电极表面的接触，从而引起明显的电流变化。由图9B 可知，依次在OTA 标准溶液中加入其他干扰物（黄曲霉毒素B1、地塞米松、玉米赤霉烯酮以及伏马菌素B1），DPV 电流响应值的变化量不超过4.35%。由图9C 可知，将不同梯度浓度的各种真菌毒素标准溶液分别滴加到制备的免疫传感器的电极表面进行孵育，发现除OTA 的DPV 电流变化量明显之外，其他物质的电流变化量几乎不随浓度的变化而变化，且几乎无电流变化量。综上，该电化学免疫传感器具有良好的特异性。
2.7 稳定性分析
电化学免疫传感器稳定性结果见图10。
图10 电化学免疫传感器稳定性
Fig.10 Electrochemical immunosensor stability
由图10A 可知，电流响应值变化不超过4.62%。由图10B 可知，贮存14 d 的电化学免疫传感器的电流值为初始电流值的95.77%，基本无变化，这是因为抗体和电极表面改性膜上的活化羧基通过酰胺键固定在电极表面，有效阻止了抗体从电极表面脱离，从而可以更持久和牢固地保持抗体的活性与数量。结果表明该电化学免疫传感器具有较好的稳定性。
3 结论
本研究将电化学技术与免疫传感器相结合，将重氮盐作为修饰电极的偶联剂，通过重氮盐的原位电化学还原和电接枝过程将羧基共价连接在电极表面，形成一层均匀、致密且稳定的薄膜，使用碳二亚胺交联方式将OTA 抗体接枝到薄膜上。再利用循环伏安法和电化学阻抗谱以及扫描电子显微镜对复合结构的物理和化学进行表征，通过差分脉冲伏安法测试免疫传感器以用于谷物（玉米、小麦、大米）、葡萄酒、咖啡样品中OTA 的检测，并评估该电化学免疫传感器的LOD、选择性和稳定性。结果表明，所制备的电化学免疫传感器显示出优异的电化学性能，OTA 的检测范围为20～200 ng/mL，LOD 为0.5 ng/mL。此外，由于抗原抗体之间的特异性结合，抗体在电极表面的固定化实现了传感器的特异性识别，具有较高的结合效率。此外，在干扰物存在的情况下，所制备的电化学免疫传感器对OTA 具有良好的选择性，并可以稳定贮存14 d。该电化学免疫传感器易于构建、灵敏、快速且稳定，为食品中OTA 的检测提供了思路。
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