藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）富含优良蛋白质、维生素、脂类、膳食纤维和活性成分[1]，氨基酸种类丰富，在肠道内的吸收速度快，因此可以作为一个理想的食材，可以满足各个年龄段的需求，并且还能够促进身心健康，因此，联合国粮农组织将之评选为“最佳的全面营养食品”[2]。藜麦不仅能提高人的免疫功能，还能预防糖尿病、抵御癌症[3]，有卓越的营养和保健功效。
银耳（Tremella fuciformis Berk.）中含有丰富的营养物质[4]，如多糖、膳食纤维、蛋白质、矿物质和维生素等[5]，颇具食用与药用价值[6]。银耳还具有滋阴润肺、养胃生津的作用[7-8]，对于咳嗽、肺热、面斑、肿瘤等病症均有缓解或预防的功效[9]。
藜麦和银耳主要被应用于主食、肉制品、能量产品、即食产品、膨化食品以及饮品、保健品、化妆品中[10-12]，因此，藜麦以及它的相关产品正在迅速获得消费者的青睐，拥有极为可观的市场潜力。本研究以藜麦和银耳为主要原料，利用乳酸菌发酵制备藜麦银耳汁饮料，使用银耳和白砂糖共同调和藜麦的涩感，以此改善藜麦的不良适口性问题。通过控制乳酸菌粉、藜麦液、银耳液和白砂糖的添加量，通过响应面试验，探索出饮料的最佳制作工艺。通过对不同配方产品的感官和品质进行测定，分析乳酸菌发酵藜麦银耳汁饮料产品的特点，以期为藜麦深加工提供一种新方法，同时为藜麦的新型加工技术的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
有机白藜麦：朝阳泰然科技食品有限公司；银耳：方家铺子（莆田）绿色食品有限公司；乳酸菌粉（乳酸菌≥1×108 CFU/g）：北京川秀科技有限公司；纤维素酶（≥50 U/mg）：沧州夏盛酶生物技术有限公司；白砂糖：资阳市新纪元食品有限公司；氢氧化钠、磷酸、三氯化铝、盐酸、亚硫酸钠（均为分析纯）：成都市科隆化工试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、碳酸钠、亚铁氰化钾、乙酸钾（均为分析纯）：成都市越康贸易有限公司；葡萄糖（色谱纯）：中国计量科学研究院；芦丁、福林酚（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸（分析纯）、LB 肉汤培养基、营养琼脂培养基：上海迈坤化工有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱（SPX-80）：北京科伟永兴仪器有限公司；高速冷冻离心机（TGL-22S）：四川蜀科仪器有限公司；分光光度计（REF 511119700）：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；手持式折光仪（PAL-1）：广州市爱拓科学仪器有限公司；数控超声波清洗器（KQ3200DB）：昆山市超声仪器有限公司；电子鼻（PEN3）：德国AIRSENSE 公司；pH 计（PHSK-4A）：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
选择颗粒饱满、优质的藜麦，清洗两次去除杂质后，加入20 倍的纯净水预煮30 min，放置冷却后打浆。将0.2% 的纤维素酶溶解于45 ℃的电热恒温水浴锅中，经过2 h 的酶解反应，最终将温度升至100 ℃，以此来获得藜麦液。选择色泽金黄、干净的银耳，加入30 倍纯净水泡发后，预煮20 min，放置冷却后打浆。得到的浆液加入0.2%的果胶酶在45 ℃的电热恒温水浴锅中酶解2 h，再升温至100 ℃灭酶得到银耳液。将藜麦液和银耳液按照一定比例混合，加入纯净水使质量达到100 g，再加入一定量的乳酸菌粉[13]，同时加入一定量的白砂糖，置于37 ℃的恒温培养箱中发酵24 h。将发酵好的原液冷却后，用洁净纱布过滤，然后灌装。将灌装好的饮料在103 ℃下灭菌15 min。工艺流程如图1 所示。
图1 饮料工艺流程
Fig.1 Beverage process
1.3.2 单因素试验设计
考察乳酸菌粉添加量、银耳液添加量、藜麦液添加量和白砂糖添加量对产品感官评分的影响，并确定各因素的最佳水平。每个因素的不同水平包括：乳酸菌粉添加量为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/100 g；藜麦液添加量为40、50、60、70、80 g/100 g；银耳液添加量为10、15、20、25、30 g/100 g；白砂糖添加量为0、2.5、5.0、7.5、10.0 g/100 g。
1.3.3 响应面优化设计
以乳酸菌粉添加量（A）、藜麦液添加量（B）、银耳液添加量（C）和白砂糖添加量（D）为试验因素，以感官评分为响应值，从而对水平进行编码，通过响应面试验来优化结果[14]。具体的试验设计如表1 所示。
表1 Box-Behnken 试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental
水平-1 0 1因素A 乳酸菌粉添加量/（g/100 g）0.50 0.75 1.00 B 藜麦液添加量/（g/100 g）50 60 70 C 银耳液添加量/（g/100 g）15 20 25 D 白砂糖添加量/（g/100 g）2.5 5.0 7.5
1.3.4 感官评价
20 位评价员对产品进行感官（组织状态、气味和口味）评价。每个评价员可以给出的最高分数为100。具体的评价标准如表2 所示。
表2 感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard
项目组织状态（20）气味（20）口味（60）评价标准均匀细腻，无沉淀，无分层分层不明显，有轻微藜麦芽沉淀分层明显，有很多藜麦芽沉淀有较浓藜麦和银耳香味，很容易接受，无异味有一点藜麦和银耳香味，较易接受有藜麦和银耳香味，但不能接受口味纯正，酸甜柔和，酸甜适口，很容易接受口味较纯正，酸味较柔和甜味较宜，可以接受口味过酸或过甜，较难以接受分数16～20 6～＜16 0～＜6 16～20 6～＜16 0～＜6 40～60 20～＜40 0～＜20
1.3.5 理化及微生物指标的测定
为初步评估产品的品质、营养和安全性，对其总酸含量、可溶性糖含量、可溶性固形物含量、pH 值、蛋白质含量和微生物等指标进行测定。每次试验均进行3次平行，以确保数据的准确性[15-20]。
1.3.5.1 总酸含量的测定
总酸含量按照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[21]中规定的方法进行测定。
1.3.5.2 可溶性糖、还原糖含量的测定
可溶性糖、还原糖含量按照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3，5-二硝基水杨酸比色法》[22]中规定的方法进行测定。
1.3.5.3 pH 值的测定
用pH 计直接测量pH 值。
1.3.5.4 可溶性固形物含量的测定
用手持式折光仪直接测定可溶性固形物含量。
1.3.5.5 蛋白质含量的测定
蛋白质含量按照SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝法》[23]中规定的方法进行测定。
1.3.5.6 总多酚含量的测定
总多酚含量按照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定 分光光度法》[24]中规定的方法进行测定。
1.3.5.7 总黄酮含量的测定
总黄酮含量按照NY/T 1295—2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》[25]中规定的方法进行测定。
1.3.5.8 大肠杆菌的测定
大肠杆菌按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠杆菌计数》[26]中规定的方法进行测定。
1.3.5.9 菌落总数的测定
菌落总数按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[27]中规定的方法进行测定。
1.3.6 电子鼻的测定
电子鼻主要由电化学传感器阵列组成，每个传感器对被测气体都有不同的灵敏度。采用真空顶空吸气法，取10 mL 液体样品放入顶空瓶中，然后使用电子鼻进行测定。在测定过程中，采样时间为1 s/组，传感器自清洗时间为120 s，传感器归零时间为10 s，样品准备时间为5 s，分析采样时间为120 s，进行3 次平行测定以提高测定的准确性[28]。传感器与其对应的香气类型如表3 所示。
表3 传感器及其对应的香气类型
Table 3 Sensors and their corresponding aroma types
排列序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10传感器名称W1C W5S W3C W6S W5C W1S W1W W2S W2W W3S性能描述芳香化合物氮氧化合物芳香成分氰化物芳香性化合物甲基类萜烯类和有机硫化物醇类芳香化合物高浓度化合物
1.4 数据处理
每组试验均进行3 次平行。通过Microsoft Office Excel 2016 软件进行数据统计，SPSS 26 软件进行差异显著性分析，采用Origin 2018 软件绘制感官评分柱状图和电子鼻雷达图，采用Design-Expert 13 软件对藜麦银耳乳酸菌发酵饮料进行响应面试验设计及模型构建，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
乳酸菌粉添加量对饮料感官评分的影响如图2所示。
图2 乳酸菌粉添加量对饮料感官评分的影响
Fig.2 Effect of the additive amount of Lactobacillus powder on sensory score of beverage
由图2 可知，乳酸菌粉添加量不超过0.75 g/100 g时，感官评分随乳酸菌粉添加量增大逐渐上升；超过0.75 g/100 g 时感官评分则开始下降。这是因为发酵初期，微生物生长比较缓慢，处于延迟期，发酵反应不充分，导致发酵风味不足；在发酵中期，乳酸菌粉与底物充分反应，并形成良好的风味，藜麦和银耳的香味也不会被乳酸菌发酵后所掩盖。适当的酸度可以保证发酵饮料的品质。随着乳酸菌粉添加量增加，发酵过度会令饮料整体酸度值提升，乳酸的积累也会抑制乳酸菌的生长和代谢，导致饮料口味发生变化。因此，选择乳酸菌粉添加量0.50、0.75、1.00 g/100 g 进行响应面优化试验。
藜麦液添加量对饮料感官评分的影响如图3 所示。
图3 藜麦液添加量对饮料感官评分的影响
Fig.3 Effect of the additive amount of quinoa liquid on sensory score of beverage
由图3 可知，藜麦液添加量在不超过50 g/100 g时，感官评分随藜麦液添加量增加呈现上升趋势；当藜麦液添加量超过50 g/100 g 时，感官评分开始下降。藜麦液中含有大量的碳水化合物，在碳水化合物发酵过程中，乳酸菌利用糖酸酶将碳水化合物分解为各种单糖，然后利用乳酸脱氢酶把单糖转化为乳酸，并产生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。在此过程中会产生大量的乳酸，而大量乳酸也是造成酸度值上升的原因。随着藜麦液添加量的增加，发酵产生的乳酸含量相应增加，导致发酵体系中的酸度值上升，对饮料的风味造成不利影响。因此，选择藜麦液添加量50、60、70 g/100 g 进行响应面优化试验。
银耳液添加量对饮料感官评分的影响如图4 所示。
图4 银耳液添加量对饮料感官评分的影响
Fig.4 Effect of the additive amount of tremella liquid on sensory score of beverage
由图4 可知，当银耳液添加量为10～20 g/100 g时，感官评分随银耳液添加量增加出现上升趋势。银耳液添加量超过20 g/100 g 时，感官评分开始逐渐降低。原因可能是，银耳多糖含量丰富，在参与乳酸菌发酵的过程中，不仅体现本身的风味，也是一些重要风味物质的前体物质。乳酸作为发酵产生的重要有机酸，会在发酵过程中逐渐积累，当乳酸含量到达一定程度时，pH 值下降也会抑制乳酸菌的代谢，对饮料风味也会带来影响。因此，选择银耳液添加量15、20、25 g/100 g进行响应面优化试验。
白砂糖添加量对饮料感官评分的影响如图5 所示。
图5 白砂糖添加量对饮料感官评分的影响
Fig.5 Effect of the additive amount of sugar on sensory score of beverage
由图5 可知，当白砂糖添加量为0～7.5 g/100 g 时，感官评分随白砂糖添加量增加有明显的提高。但是，当白砂糖添加量超过7.5 g/100 g，感官评分会有所下降。可能的原因是，当白砂糖的添加量适宜时，白砂糖本身的甜度会提升饮料整体的风味；当白砂糖添加量过多时，较高的渗透压会阻碍发酵过程，导致发酵不充分，饮料整体风味下降。另外，随着白砂糖的加入，适宜乳酸菌发酵的酸性环境被改变，对乳酸菌发酵过程也会带来一些不利影响。因此，选择白砂糖添加量2.5、5.0、7.5 g/100 g 进行响应面优化试验。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 Box-Behnken 试验设计与回归方程分析
为提高准确性，对每个指标进行3 次平行试验，并使用Excel 2016 和Design-Expert 13 软件对结果进行优化处理。响应面试验结果见表4。
表4 响应面试验结果
Table 4 Response surface test results
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29因素A-1 0 1 1-1 0 0 0-1 0 1 0 0 1 0 0 0 0-1 0 0 1-1-1 0 0 1 0 0 B0 1 0 1 1-1 1-1 0 0 0 0 1 0 0 1-1-1 0 0 0 0 0-1 0 0-1 0 0 C1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0-1-1 0-1-1 1-1 0 0-1 0 0 0 0 D0 1 1 0 0 1 0 0 1 0-1 1-1 0 0 0 0-1 0 1-1 0-1 0-1 0 0 0 0 Y 感官评分75.0 82.0 80.0 73.2 77.0 78.3 74.0 78.0 82.0 81.0 74.0 78.0 72.0 77.3 79.3 76.0 74.0 72.8 76.0 79.0 73.0 72.0 74.0 76.0 71.0 80.0 77.0 80.3 80.0
经Design-Expert 13 统计软件分析，得到饮料感官评分的方差分析（analysis of variance，ANOVA），见表5。
表5 感官评分方差分析
Table 5 ANOVA of sensory scores
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）；***表示影响高度显著（P＜0.001）。
来源模型A B C D AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和平方和276.95 3.52 0.30 4.44 150.52 5.76 9.92 1.00 9.00 5.06 2.25 20.38 30.61 60.24 13.59 13.06 11.56 1.51 290.02自由度14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28均方19.78 3.52 0.30 4.44 150.52 5.76 9.92 1.00 9.00 5.06 2.25 20.38 30.61 60.24 13.59 0.93 1.16 0.38 F 值21.20 3.77 0.32 4.76 161.30 6.17 10.63 1.07 9.64 5.42 2.41 21.84 32.81 64.55 14.56 3.07 P 值＜0.000 1 0.072 5 0.579 2 0.046 7＜0.000 1 0.026 2 0.005 7 0.318 1 0.007 7 0.035 3 0.142 8 0.000 4＜0.000 1＜0.000 1 0.001 9 0.145 8显著性************************
通过使用Design-Expert 13 统计软件对试验数据进行多元回归拟合与方差分析（ANOVA），得到了感官评分（Y）与自变量因素之间的二次多元项回归模型方程。该方程为Y=80.12-0.54A-0.16B+0.61C+3.54D-1.2AB+1.57AC-0.50AD-1.50BC+1.13BD-0.75CD-1.77A2-2.17B2-3.05C2-1.45D2。
由表5 可知，该模型影响高度显著（P＜0.001），失拟项不显著（P＞0.05），说明方程能准确反映感官评分和各因素之间的关系。由表5 可知，D、A2、B2、C2 影响高度显著（P＜0.001），AC、BC、D2 影响极显著（P＜0.01），C、AB、BD 影响显著（P＜0.05）。由F 值的大小判断影响饮料的感官评分的主次顺序为D＞C＞A＞B。
2.2.2 各因素交互作用分析
利用Design-Expert 13 统计软件对数据进行二次多元回归拟合，A、B、C、D 4 个因素对感官评分（Y）的影响交互作用关系如图6～图11 所示。
图6 乳酸菌粉添加量及藜麦液添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.6 Contour and response surface of the effect of the interaction between the additive amount of Lactobacillus powder and that of quinoa liquid on the sensory score of beverage
图7 乳酸菌粉添加量及银耳液添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.7 Contour and response surface of the effect of the interaction between the additive amount of Lactobacillus powder and that of tremella liquid on the sensory score of beverage
图8 乳酸菌粉添加量及白砂糖添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.8 Contour and response surface of the effect of the interaction between the additive amount of Lactobacillus powder added and that of sugar on the sensory score of beverage
图9 藜麦液添加量及银耳液添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.9 Contour and response surface of the effect of the interaction between the additive amount of quinoa liquid and that of tremella liquid on the sensory score of beverage
图10 藜麦液添加量及白砂糖添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.10 Contour and response surface of the effect of the interaction between the additive amount of quinoa liquid and that of sugar on the sensory score of beverage
图11 银耳液添加量及白砂糖添加量交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.11 Contour and response surface of the influence of the interaction between the additive amount of tremella liquid and that of sugar on the sensory score of beverage
由图6～图8 可知，A（乳酸菌粉添加量）和C（银耳液添加量）之间的响应面图坡度更陡，等高线更趋向于椭圆，表明其交互作用强；而A（乳酸菌粉添加量）和B（藜麦液添加量）、A（乳酸菌粉添加量）和D（白砂糖添加量）的响应面曲线坡度较平缓，说明二者交互作用小。由图9～图11 可知，B（藜麦液添加量）和C（银耳液添加量）之间的响应面图坡度更陡，等高线更趋向于椭圆，表明其交互作用强；而B（藜麦液添加量）和D（白砂糖添加量）、C（银耳液添加量）和D（白砂糖添加量）的响应面曲线坡度较平缓，说明二者交互作用小。由此可知，乳酸菌粉添加量和银耳液添加量对饮料的感官评分的影响较为显著，具体表现在其响应面图形坡度较陡；而乳酸菌粉添加量与藜麦液添加量、白砂糖添加量的响应面图形相对来说坡度较为平缓，说明相比之下交互作用较不显著，这一现象与方差分析结果呈现一致性。乳酸菌可以利用乳糖及大部分其他糖类为主要碳源和能量来源，银耳可以为乳酸菌发酵提供充足的碳源。藜麦液添加量和银耳液添加量对饮料的感官评分的影响较为显著，具体表现在其响应面图形坡度较陡；而白砂糖添加量与藜麦液添加量、银耳液添加量交互作用的响应面图形相对来说坡度较为平缓，说明相比之下交互作用较不显著，这一现象与方差分析结果呈现一致性。乳酸菌能与藜麦中的蛋白质反应，利用胞外蛋白酶水解酪蛋白形成寡肽和氨基酸，再将这些物质利用起来合成多肽和其他生物活性分子。乳酸菌也参与银耳液中的糖代谢过程，因此藜麦液和银耳液交互作用强。
2.3 验证试验
由响应面试验结果，经Design-Expert 13 软件分析得出的藜麦银耳乳酸菌发酵饮料最优配方组合是乳酸菌粉添加量为0.6 g/100 g、藜麦液添加量为64.88 g/100 g、银耳液添加量为18.52 g/100 g，白砂糖添加量为7.50 g/100 g，在此配方条件下藜麦银耳乳酸菌发酵饮料的感官评分预测值为82.78，但考虑试验的实际操作性，将工艺配方调整为乳酸菌粉添加量为0.6 g/100 g、藜麦液添加量为65 g/100 g、银耳液添加量为19 g/100 g，白砂糖添加量为7.5 g/100 g。在此配方下进行3 次重复验证试验，得出的藜麦银耳乳酸菌发酵饮料感官评分为83，与预测值的误差较小，在合理范围之内，所以此模型运用响应面优化得到的配方具有可靠性。
2.4 饮料成品理化指标测定结果
饮料成品的理化指标如表6 所示。
表6 藜麦银耳汁发酵饮料的理化指标及微生物
Table 6 Physiological and biochemical indexes of quinoa tremella juice fermented beverage
总酸含量/（g/L）1.66±0.10可溶性糖含量/（g/100 g）12.98±0.53还原糖含量/（g/100 g）4.18±0.06 pH 值3.42±0.01可溶性固形物含量/%10.45±0.05蛋白质含量/（g/100 g）0.02±0.01总多酚含量/（mg/100 g）68.20±2.91总黄酮含量/（mg/100 g）30.30±0.01大肠杆菌计数/（CFU/mL）未检出菌落总数/（CFU/mL）56±4
由表6 可知，饮料中蛋白质含量偏低，可能是由于藜麦在发酵过程中，乳酸菌参与蛋白质水解反应，生成芳香族化合物的前体物质，也会产生其他与乳酸菌益生作用相关的生物活性肽[29]。饮料发酵过程中会产生一定量的多酚和黄酮，酸甜度均适宜，成品大肠杆菌数和菌落总数均符合GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》中菌落总数≤102 CFU/mL、大肠杆菌≤1 CFU/mL的要求。
2.5 饮料成品电子鼻测定结果
根据饮料电子鼻相应曲线图在81～120 s 时曲线基本保持不变，传感器电阻比值稳定，选取86～88 s 的数据进行分析，雷达图见图12。
图12 饮料电子鼻雷达图
Fig.12 E-nose radargram of beverage
由图12 可知，W5S、W1S、W1W、W2W 相对其他传感器电阻高[30-34]，说明随着发酵的进行，氮氧化合物、甲基类物质、无机硫化物、有机硫化物含量增高。W1C、W6S、W3C、W3S 相对其他传感电阻低，说明饮料中芳香物及长链烷烃的含量低，对饮料风味的贡献较少。在发酵过程中，将产生乳酸，在酸性条件下促进发酵，生成其他有机酸、醛类等风味物质。
3 结论
本试验通过对乳酸菌粉发酵藜麦银耳汁饮料的感官评分、理化指标、风味物质电阻比值等指标的测定，得出最佳制作配方为乳酸菌粉添加量0.6 g/100 g，藜麦液添加量65 g/100 g，银耳液添加量19 g/100 g，白砂糖添加量7.5 g/100 g，发酵温度与时间为36 ℃、24 h。总酸含量为（1.66±0.10） g/L，可溶性糖含量为（12.98±0.53） g/100 g，还原糖含量为（4.18±0.06） g/100 g，pH值为3.42±0.01，可溶性固形物含量为（10.45±0.05）%，蛋白质含量为（0.02±0.01） g/100 g，总多酚含量为（68.20±2.91） mg/100 g，总黄酮含量为（30.30±0.01） mg/100 g，未检出大肠杆菌，菌落总数为（56±4） CFU/mL，响应面试验得出乳酸菌粉添加量和银耳液添加量是影响产品风味的最主要因素，乳酸菌发酵使得成品有独特的风味。利用银耳的较好适口性提升饮料整体的可接受度，并且具有银耳和藜麦的独特风味和一定的营养价值，为进一步填补藜麦饮料市场的空白做出贡献。综上，此研究建立的模型能较好地用于藜麦银耳汁发酵饮料的开发。
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