据世界卫生组织最新报道，酒精已被国际癌症研究所列为Ⅰ类致癌物，是引发全球癌症的主要原因。目前，酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）已成为严重危害人体健康的第二大肝脏疾病[1]。ALD 主要由不良的饮酒习惯引起，发病机制可能与酒精及其代谢产物的毒害作用[2]、氧化应激[3]、免疫和炎症反应[4]、遗传、细胞凋亡[5]等因素有关。目前的治疗手段主要是在酒精戒断和营养补给的基础上对症下药，但临床效果不佳，且药物对人体有一定副作用[6-7]。因此，从天然产物中探索出有护肝作用的功能活性物质尤为重要。
植物多糖作为一种安全、高效的新型资源，其抗氧化活性成为研究热点。研究发现，植物多糖主要通过以下两方面发挥抗氧化作用：一是通过调控激活的B细胞核因子kppa-轻链增强子（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）炎症信号通路及相关细胞因子的表达，降低氧化应激对机体的损伤[8]；另一方面，通过调控MAPK/Nrf2 通路激活抗氧化体系相关基因，促进抗氧化酶的分泌，增强机体对氧化应激的抗性[9]。
细叶韭（Allium tenuissimum L.）是葱属植物中的一种，其顶端花序——细叶韭花（Allium tenuissimum L.flower，ATF）常被用来制作调味品[10]。韭花中含有多种生物活性成分，具有抑菌防腐、抗肿瘤、抗炎、增强免疫力等功效[11]，此外，韭花性温味辣，还有健胃益肝、降血糖血脂等药理作用[12]。目前对细叶韭的研究主要集中在生长习性、栽培储存以及风味[13-15]，然而，对其生物活性成分的研究相对较少。
本文通过热水浸提法提取细叶韭花多糖，经分离纯化得到组分单一的多糖，并测定其理化性质，分析其体外抗氧化活性，构建ALD 动物模型进一步探究细叶韭花多糖能否通过抗氧化途径缓解酒精引起的氧化应激损伤，以期为细叶韭花在功能性食品以及其他领域的开发利用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
细叶韭花：产地山东省聊城市；SPF 级雄性KM 小鼠[4 周龄，（18±2）g]：北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证编号为SCXK（京）2019-0010，本实验在天津科技大学动物实验中心进行，且经过天津科技大学动物伦理委员会同意。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonat），ABTS]、Sephadex-G200 凝胶：上海源叶生物科技有限公司；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）测定试剂盒、谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）测定试剂盒、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒、蛋白羰基（protein carbonyl，PC）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）小鼠酶联免疫试剂盒、葡聚糖标准品：北京索莱宝科技有限公司；总RNA 提取试剂盒（DP419）、cDNA 第一链合成试剂盒（KR116）、SuperReal 荧光定量预混试剂（FP205）：北京天根生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
水浴锅（SHJ-4A）：常州金坛良友仪器有限公司；旋转蒸发器（LC-RE-5299）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；循环水式真空泵（SHZ-D）：常州亚旺仪器有限公司；多功能酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾公司；高效液相色谱仪（1260 infinity Ⅱ）、实时荧光定量PCR仪（Stratagene Mx 3000P）：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 细叶韭花多糖的提取
提取流程：预处理（清洗、干燥、粉碎、过60 目筛）→热水浸提[80 ℃、2 h、1∶30 （g/mL）、提取2 次]→抽滤除渣→旋转蒸发浓缩→醇沉（4 ℃，24 h）→离心（8 000 r/min，10 min）→蒸馏水重悬→脱蛋白[Sevage 试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1， 体积比）∶多糖溶液=1∶3， 体积比]→透析（流水48 h、蒸馏水24 h）→冷冻干燥→粗细叶韭花多糖（polysaccharide of A. tenuissimum L. flower，ATFP）。
细叶韭花多糖得率（B，%）按下列公式计算。
式中：m1为粗多糖质量，mg；m2为韭花粉末质量，mg。
1.3.2 分离纯化
综合相关文献和预试验结果，采用葡聚糖凝胶柱层析法对韭花粗多糖进行纯化。将Sephadex-G200 凝胶充分溶胀，湿法装柱（1.6 cm×50 cm），以4 倍柱床体积的蒸馏水平衡。配制细叶韭花多糖溶液（20 mg/mL），0.22 µm 滤膜过滤，上样量为1 mL，蒸馏水洗脱，止水夹调节流速为0.45 mL/min，自动部分收集器收集（约1.5 个柱体积），利用苯酚-硫酸法逐管测定洗脱液中的多糖含量，绘制洗脱曲线，收集相同组分的洗脱液，经冷冻干燥得到细叶韭花多糖纯品。
1.3.3 理化性质及含量的测定
1.3.3.1 颜色反应
细叶韭花多糖分别与斐林试剂、双缩脲试剂、I2-KI试剂、三氯化铁试剂和茚三酮试剂反应，观察颜色变化。
1.3.3.2 基本成分含量的测定
参考相关文献，采用苯酚-硫酸法[16]、考马斯亮蓝法[17]、间羟基联苯法[18]测定细叶韭花多糖中的总糖、蛋白质以及糖醛酸的含量。
1.3.4 分子量的测定
参考文献[19]，利用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法测定纯化后细叶韭花多糖的分子量，并根据色谱图鉴定纯度。分别配制1 mg/mL 葡聚糖标准品（T500、T100、T70、T3）和多糖溶液，用0.22 µm 水系滤膜过滤，待基线平稳后上机检测。
色谱条件为Aglient 1260 infinity Ⅱ型高效液相色谱仪；TSK-GEL G4000 PWxL 色谱柱（7.8 mm×300 mm，10 µm）；示差折光检测器；流动相：超纯水；流速：0.6 mL/min；色谱柱温度：30 ℃；检测器温度：35 ℃；进样量：20 µL。
1.3.5 体外抗氧化活性的测定
根据预试验结果，将多糖的质量浓度定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，测定细叶韭花多糖的体外抗氧化活性，每组试验重复3 次。
1.3.5.1 对DPPH 自由基清除能力的测定
配制DPPH 乙醇溶液（0.1 mmol/L），将多糖溶液（1 mL）与等体积的DPPH 溶液混合，室温避光反应30 min，在517 nm 处测定OD 值；无水乙醇代替DPPH溶液作为试剂干扰组；无水乙醇代替多糖溶液作为空白对照组，并按下列公式计算DPPH 自由基清除率（D，%）[20]。
式中：A0 为空白对照组的OD 值；A1 为样品组的OD 值；A2 为试剂干扰组的OD 值。
1.3.5.2 对ABTS+自由基清除能力的测定
将ABTS 溶液（7 mmol/L）与过硫酸钾（2.45 mmol/L）等体积混合，混匀后在室温条件下避光反应12 h，用蒸馏水稀释至在734 nm 处的吸光度为0.70±0.02，作为ABTS+工作液。取100 μL 不同浓度的多糖溶液与等体积的ABTS+工作液混合，避光静置20 min，734 nm 处测定OD 值，记为A1；蒸馏水代替ABTS+工作液作为试剂干扰组，记为A2；蒸馏水代替待测样本作为空白对照组，记为A0，并按下列公式计算ABTS+自由基清除率（A，%）[21]。
1.3.5.3 对羟自由基清除能力的测定
采用水杨酸法[22]测定细叶韭花多糖对羟自由基的清除能力。取1 mL 多糖溶液于试管中，依次加入1 mL硫酸亚铁溶液（6 mmol/L）、水杨酸溶液（6 mmol/L）、0.1% 过氧化氢溶液，混匀后反应（37 ℃、30 min），在510 nm 处测定OD 值，记为A1；蒸馏水代替过氧化氢溶液作为试剂干扰组，记为A2；蒸馏水代替多糖溶液作为空白对照组，记为A0，并按下列公式计算羟自由基清除率（O，%）。
1.3.5.4 总还原能力的测定
依次加入多糖溶液（1 mL）、磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L、pH6.6、2.5 mL）和铁氰化钾溶液（1%、2.5 mL）于试管中，50 ℃反应20 min，流水迅速冷却，加入三氯乙酸溶液（10%、2.5 mL），离心（3 000 r/min，10 min），取2.5 mL 上清液于试管中，加入等量蒸馏水和0.5 mL 三氯化铁溶液，室温反应10 min，700 nm 处测定OD 值，记为A1；蒸馏水代替多糖溶液作为空白对照，记为A2，以吸光度大小衡量待测样本总还原能力的强弱，总还原能力（Z）计算公式如下。
1.3.6 对酒精氧化损伤小鼠的影响
1.3.6.1 动物实验设计
实验选用40 只雄性KM 小鼠，经过一周的适应期后，按体质量随机分为5 组，每组8 只，具体分组和给药剂量如图1 所示。连续4 周在固定时间给予抗坏血酸和细叶韭花多糖溶液，末次给药12 h 后，空白组给予0.9% 生理盐水，其他各实验组灌胃50% 乙醇溶液（12 mL/kg），构建急性ALD 动物模型。
图1 动物实验方案
Fig.1 Animal experiment scheme
1.3.6.2 动物状态观察
实验期间每天记录饲喂粮重，剩余粮重，计算小鼠每日摄食量，记录小鼠体质量变化并观察小鼠的精神状态。
1.3.6.3 动物样本的收集与处理
小鼠处死前2 h 采用大腿主动脉取血的方法收集血液，室温静置，离心（3 000 r/min，15 min）后取上清液，分装密封，-80 ℃冰箱保存。颈椎脱臼处死小鼠，在无菌操作台上快速摘取小鼠的内脏器官，生理盐水清洗，滤纸吸干后称重并记录。肝脏组织一部分浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于组织病理学观察；另一部分制备肝脏组织匀浆，-80 ℃冰箱保存备用。
1.3.6.4 脏器指数计算
组织经前处理后，按下列公式计算脏器指数（X，%）。
式中：m1 为器官质量，g；m 为小鼠体质量，g。
1.3.6.5 血清中肝损伤指标的测定
血清解冻后用无菌生理盐水进行稀释，根据试剂盒说明书测定AKP、ALT、AST 活力。
1.3.6.6 肝脏组织中氧化应激指标的测定
无菌剪刀剪一小块肝脏组织于2 mL 尖头EP 管中，以1∶9 （g/mL）的比例加入无菌生理盐水，研磨棒研磨至无明显块状物质，离心（3 500 r/min，15 min）得到10%的肝脏组织匀浆。根据各试剂盒说明书要求稀释组织匀浆，并测定SOD、CAT、GSH-Px 活力、MDA、PC 的含量。
1.3.6.7 血清中炎症因子水平的测定
根据酶联免疫试剂盒说明书测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 含量。
1.3.6.8 病理切片观察
肝脏组织在4% 多聚甲醛中固定过夜，经石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色后，在显微镜下拍照观察。
1.3.6.9 Nrf2 信号通路相关基因的表达
采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定ALD 小鼠肝脏组织中核因子E2 相关因子（Nrf2）、Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）mRNA 的表达情况。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列如表1 所示。总RNA 的提取、cDNA 的合成和qRT-PCR 的测定严格按照试剂盒说明书操作，实验均在无菌条件下进行，PCR 反应程序：预变性（95 ℃、15 min）→变性（95 ℃、10 s）→退火/延伸（60 ℃、30 s），循环次数为40。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因，利用相对定量2-ΔΔCT进行计算，求出待测基因的相对表达量。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物GAPDH Nrf2 Keap1 HO-1 GCLC正向引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'5'-CTCTGCTGCAAGTAGCCTCG-3'5'-GCCCCGGGACTCTTATTGTG-3'5'-AGGTACACATCCAAGCCGAGA-3'5'-CTACCACGCAGTCAAGGACC-3'反向引物5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'5'-AAACTTGTACCGCCTCGTCT-3'5'-TTAGGGGCCCCGCCAT-3'5'-CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT-3'5'-CCTCCATTCAGTAACAACTGGAC-3'
1.4 数据处理
利用IBM SPSS Statistics 22 软件进行统计学分析，利用Origin2018 软件绘图，实验数据均以平均值±标准差表示，多组数据采用单因素方差分析和T 检验，评估在95% 和99% 置信区间的统计学意义，P＜0.05 表示差异显著；P＜0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 理化性质分析
根据试验结果可知，细叶韭花多糖为白色的轻薄絮状物，极易溶于水；与斐林试剂、I2-KI 试剂、三氯化铁溶液、茚三酮试剂、双缩脲试剂反应均呈阴性，说明细叶韭花多糖中不含还原糖、淀粉、多酚类和蛋白质等物质。
2.2 基本成分含量分析
葡萄糖、牛血清蛋白和半乳糖醛酸的标准曲线分别为y=6.211x+0.089 6（R2=0.999 5）、y=3.923 6x+0.300 1（R2=0.990 7）、y=4.931 2x+0.106 1（R2=0.994 3），计算得到细叶韭花多糖总糖含量为（92.65±0.16）%、蛋白质含量为（0.74±0.20）%、糖醛酸含量为（16.70±0.06）%。
2.3 分子量测定
ATFP 的色谱图见图2。
图2 ATFP 的色谱图
Fig.2 Chromatogram of ATFP
由图2 可知，细叶韭花多糖的色谱图为峰形对称的单一色谱峰，说明经葡聚糖凝胶柱层析分离得到的多糖纯度较高，ATFP 的出峰时间为8.245 min，根据葡聚糖标准曲线计算出细叶韭花多糖的分子量为1.40×106 Da。
2.4 体外抗氧化活性分析
ATFP 的体外抗氧化活性见图3。
图3 ATFP 的体外抗氧化活性
Fig.3 Antioxidant activity of ATFP in vitro
由图3 可知，多糖浓度在0.5～3.0 mg/mL 范围内，ATFP 对3 种自由基的清除能力和总还原能力随着浓度增加逐渐提高，存在明显的量效关系；当浓度为3.0 mg/mL 时，对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基的清除率分别为（84.14±1.92）%、（98.16±1.64）%、（79.00±1.41）%，总还原能力为0.571±0.003，其中对ABTS+自由基的清除能力接近VC，但对DPPH·、·OH的清除率以及总还原能力均达不到同等浓度下VC 的作用效果；经计算得到细叶韭花多糖对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除能力的IC50 分别为0.79、0.60、1.26 mg/mL，结果表明细叶韭花多糖有明显的抗氧化活性。
2.5 对ALD 小鼠体质量和生长状况的影响
实验期间各组小鼠的摄食量和体质量变化如表2和图4 所示。
表2 各组小鼠体质量变化
Table 2 Weight changes of mice in each group
组别空白组模型组阳性对照组低剂量组高剂量组小鼠体质量/g 1 d 28.53±1.08 29.36±0.97 27.14±1.02 27.86±0.44 27.54±0.57 7 d 35.43±2.20 37.02±1.17 31.28±2.60 35.35±2.53 35.12±1.89 14 d 40.28±2.18 41.36±1.86 37.73±2.35 39.80±2.82 37.14±2.02 21 d 42.75±2.31 42.88±1.63 40.53±2.10 42.65±2.94 42.08±2.74 28 d 43.95±1.85 46.14±2.04 43.60±2.90 45.08±2.18 45.13±2.54
图4 摄食量和体质量变化
Fig.4 Changes of food intake and body weight
由表2 和图4 可知，药物摄入期间各组小鼠精神状态良好，毛发顺滑，粪便正常，无疾病出现，每日摄食量在正常范围内变化，体质量逐渐增加，且无明显差异，表明提前摄入细叶韭花多糖不会对小鼠体质量产生影响。
灌胃50% 乙醇后，小鼠立即出现呼吸急促、站立不稳、反应迟钝等现象，12 h 后观察各组小鼠的生长状态，发现模型组小鼠出现毛发杂乱、食欲不振、体质量急速下降、嗜睡、尿量增加等现象，且有个别死亡；而药物干预组小鼠上述症状有所改善，活动量明显增加，正常饮水摄食，表明细叶韭花多糖能改善酒精对小鼠生长状态的影响。
2.6 对ALD 小鼠脏器指数的影响
解剖观察小鼠肝脏的形态变化，空白组小鼠肝脏颜色鲜红，形状正常，无肿胀等病变出现；模型组小鼠肝脏颜色变深，有白色颗粒，体积增大，质量增加；而阳性对照组和ATFP 剂量组小鼠上述现象均得到不同程度的改善。
酒精主要在肝脏中代谢，大量摄入会导致肝脏肿大；脾脏和胸腺是机体内最大的淋巴器官，是免疫应答的主要场所，酒精的大量摄入也会引发机体的炎症反应，导致免疫系统失调。脏器指数变化见图5。
图5 脏器指数变化
Fig.5 Changes of organ index
由图5 可知，模型组小鼠肝脏指数和脾脏指数极显著增加32.71%、28.57%（P＜0.01），而胸腺指数极显著下降48.15%（P＜0.01），表明ALD 动物模型建立成功；与模型组相比，阳性对照组能显著降低肝脏指数和脾脏指数，显著提高胸腺指数（P＜0.05）；细叶韭花多糖剂量组虽能极显著降低脾脏指数（P＜0.01），但对肝脏肿大和胸腺萎缩的改善无统计学意义（P＞0.05）。
2.7 对血清中肝损伤指标的影响
AKP、ALT 和AST 是衡量肝脏损伤的重要指标[23]。通过比较空白组、模型组、阳性对照组和ATFP 剂量组小鼠血清中磷酸酶和转氨酶的含量变化，判断酒精对肝脏的损伤情况，探究对酒精氧化损伤的保护作用。血清中肝损伤指标变化见图6。
图6 血清中肝损伤指标变化
Fig.6 Changes of liver injury indexes in serum
由图6 可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中AKP、ALT 和AST 酶活力极显著增加，分别为69.32%、69.45%、117.56%（P＜0.01），说明小鼠肝脏受到严重损伤；与模型组相比，阳性药物VC 的摄入使小鼠血清中转氨酶（ALT、AST）的活力显著下降（P＜0.05，P＜0.01），而AKP 酶活力虽下降但无显著性差异（P＞0.05）；细叶韭花多糖剂量组能显著降低磷酸酶和转氨酶的活力，其中高剂量组小鼠血清中AKP、ALT 和AST 的酶活力分别下降44.11%、25.18%、48.89%，说明提前摄入细叶韭花多糖能减轻ALD 小鼠肝脏受损情况。
2.8 对肝脏组织中氧化应激指标的影响
氧化应激和脂质过氧化作用在ALD 发病过程中至关重要。酒精在代谢过程中会产生大量的活性氧，影响机体正常的生理功能[24-25]，并引发各种肝脏类疾病。抗氧化酶保护细胞膜结构和功能的完整性，清除机体内的活性氧，减轻机体的氧化损伤程度；MDA、PC作为脂质和蛋白过氧化产物，能反映机体氧化损伤程度。通过测定上述指标反映酒精对机体造成的氧化应激程度。肝脏组织中氧化应激指标变化见图7。
图7 肝脏组织中氧化应激指标变化
Fig.7 Changes of oxidative stress indexes in liver tissue
由图7 可知，与空白组相比，模型组小鼠SOD、CAT、GSH-Px 酶活力显著下降（P＜0.05，P＜0.01），MDA和PC 含量极显著增加（P＜0.01），这说明酒精的摄入促使机体内产生大量自由基，且发生严重的氧化损伤；药物的干预使上述指标均发生逆转，其中高剂量组的改善效果较好，与空白组相比无明显差异，与模型组相比SOD、CAT 和GSH-Px 酶活力极显著提高，分别提高34.46%、77.10%、28.11%（P＜0.01），MDA 和PC 含量极显著降低，分别降低47.75%、46.84%（P＜0.01），说明细叶韭花多糖可通过提高抗氧化酶活力、减少有害产物积累预防酒精引起的肝脏氧化损伤。
2.9 对血清中炎症因子水平的影响
酒精及其中间代谢产物可通过病原体相关分子模式和损伤相关分子模式释放促炎介质（如肿瘤坏死因子和白介素等），加重肝脏损伤[26]。血清中炎症因子水平变化见图8。
图8 血清中炎症因子水平变化
Fig.8 Changes of the levels of inflammatory cytokines in serum
由图8 可知，酒精的大量摄入可以极显著提高ALD 小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量（P＜0.01），极显著降低IL-10 含量（P＜0.01），表明肝细胞受到损伤，且释放了大量促炎细胞因子；阳性药物VC 和细叶韭花多糖的提前摄入能显著抑制促炎细胞因子的过量表达，并增加抗炎因子含量，缓解酒精引发的炎症应激反应，高剂量组对促炎细胞因子的作用效果与VC 相当，对IL-10 含量的影响最明显，这说明细叶韭花多糖对炎症因子的调节存在剂量依赖。
2.10 对ALD 小鼠肝脏组织病理形态学的影响
各组小鼠肝脏组织病理形态如图9 所示。
图9 肝脏组织病理学变化
Fig.9 Histopathological changes in the liver
由图9 可知，空白组小鼠肝脏组织结构正常，肝细胞有规律分布，细胞多为单核，无固缩溶解现象出现；模型组小鼠肝脏组织中有炎症细胞浸染、出现大量双核肝细胞、细胞体积变大且分布较分散，细胞界限模糊，肝血窦扩张；阳性对照组和细叶韭花多糖剂量组细胞界限相对清楚，双核细胞明显减少且无炎症细胞浸润，但低剂量组仍有少量肝细胞发生溶解。由此可见，细叶韭花多糖呈剂量依赖性地缓解酒精引起的肝脏病理损伤。
2.11 对ALD 小鼠氧化应激通路的影响
Nrf2 是抗氧化反应体系中的关键转录因子[27]。在正常无应激条件下，Nrf2 与其抑制因子Keap1 形成复合体处于细胞质中，不发挥抗氧化活性。当机体受到外界刺激时，Keap1 结构改变使两者结合不稳定，Nrf2进入细胞核，识别抗氧化原件ARE 上的位点并与之结合，启动下游靶基因抗氧化蛋白酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达[28]，从而激活Nrf2 信号通路，发挥抗氧化活性。
通过qRT-PCR 法测定ALD 小鼠肝脏组织中核内蛋白Nrf2 和胞质内蛋白Keap1、HO-1 及GCLC 的mRNA 表达情况。细叶韭花多糖对酒精氧化损伤小鼠肝脏组织中氧化应激相关基因表达的影响见图10。
图10 对酒精氧化损伤小鼠肝脏组织中氧化应激相关基因表达的影响
Fig. 10 Effect on expression of oxidative stress-related genes in liver tissues damaged by alcohol oxidation
由图10 可知，与空白组相比，模型组Keap1 mRNA相对表达量极显著增加（P＜0.01），Nrf2、HO-1 和GCLC mRNA 相对表达量极显著下降（P＜0.01），这说明酒精通过抑制Nrf2 介导的氧化信号通路破坏小鼠体内氧化还原稳态。与模型组相比，阳性对照组和ATFP 剂量组Nrf2、GCLC、HO-1 和Keap1 的表达量均得到正向调节（P＜0.01），且高剂量组的效果更显著。研究结果表明，细叶韭花多糖能够下调ALD 小鼠肝脏Keap1 mRNA 表达量，Nrf2 mRNA 表达量因Keap1 抑制降低而上调，Nrf2 进入细胞核后，启动下游抗氧化靶基因GCLC、HO-1 的表达发挥抗氧化活性。综上所述，阳性药物VC 和细叶韭花多糖可以通过激活抗氧化通路相关基因的表达缓解ALD 小鼠氧化应激损伤。
3 结论
通过对细叶韭花的提取、分离纯化得到分子量为1.40×106 Da 的酸性多糖，总糖含量为（92.65±0.16）%；体外抗氧化试验证明其能高效清除DPPH·、ABTS+·和羟自由基，动物实验进一步探究细叶韭花多糖发挥抗氧化活性的作用机制，发现其可能通过激活Keap1/Nrf2/ARE 信号通路，提高抗氧化酶基因的表达，增强下游抗氧化酶活力等降低氧化应激对肝脏的损伤，炎症因子也有潜在的调节，但具体的作用机制还需进一步探究。本研究表明细叶韭花多糖对酒精性肝病有潜在的治疗效果，可为天然药物的开发利用提供理论参考，为实现细叶韭花的高值利用创造条件。
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