石斑鱼（Epinephelus spp.）隶属于鲈形目（Perciformes）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼属（Epinephelus），是我国许多沿海地区重要的经济养殖鱼种。据统计，我国石斑鱼产量由2008 年的4.52 万t 增长到2022 年的20.58 万t，是10 种常见养殖海鱼中增速最快的鱼种[1]。随着石斑鱼养殖规模的不断扩大以及人们对水产品品质要求的逐步提升，石斑鱼相关保鲜技术和精深加工技术的发展也迫在眉睫。目前，石斑鱼主要是以鲜活销售方式为主，部分进行冷冻贮运，前者限制了其流通范围，后者不利于其优良品质的保持，这都严重制约了石斑鱼产业的发展[2]。研究表明，新鲜的海鱼类产品因其水分和蛋白质含量相对较高，极易受到微生物污染而导致腐败变质，影响经济效益。因此，既能有效抑制海鱼微生物，又能最大限度保持海产品品质，成为海鱼保鲜技术发展的关键。
超高压（ultra-high pressure，UHP）处理是一种新型的食品非热加工技术，目前已经在果蔬、肉制品、水产品和乳制品中得到广泛应用[3-4]。与传统热处理相比，超高压处理具有如下优点：传压速度快且均匀，不受物料大小和形状的影响；在较低温度下能杀菌钝酶；有效减轻食品中活性、营养成分的损失和风味物质劣化；在一定程度上改善食品的质构特性[5-6]。赵峰等[7]研究发现，超高压处理既能有效降低牡蛎体内的微生物，同时也能较好地保持牡蛎的冷藏品质。Hughes 等[8]与郭丽萍等[9]研究发现，300 MPa 超高压处理10 min，能很好地保持鲍鱼和鲈鱼的理化与感官品质。金婧彧等[10]研究表明，超高压处理在一定程度上能够减少海湾扇贝柱在冷藏过程中肌原纤维蛋白的变性和氧化，有效保证海湾扇贝柱的冷藏安全性。然而，目前有关超高压处理对石斑鱼保鲜效果的研究仍相对匮乏。
因此，本试验以斜带石斑鱼为原料，在预试验基础上，分别对其进行100～500 MPa 常温保压5 min 的超高压前处理，在4 ℃冷藏条件下，从鱼样菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile base-nitrogen，TVB-N）值、总巯基含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、pH 值的变化，并结合质构特性和色泽变化，综合分析超高压处理对石斑鱼在冷藏期间的品质及其保鲜效果的影响，旨在为超高压技术在石斑鱼制品冷藏保鲜中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活斜带石斑鱼：市售。鱼体质量0.8～1.2 kg，冰藏条件下1 h 内运回北部湾大学食品工程学院实验中心进行处理。
2-硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氧化镁、盐酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）：广东环凯微生物科技有限公司；巯基测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
L2-600/2 超高压设备：天津华泰森淼生物有限公司；S400-B pH 计：梅特勒托利多科技（中国）有限公司；EVOLUTION 201 紫外可见分光光度计：美国Thermo 科技公司；UPT-K1800 全自动凯氏定氮仪：北京优谱通用科技有限公司；CT3 质构仪：美国Brookfield 公司；CR-400 色彩色差计：柯尼卡美能达控股公司；JHZ-2 超净工作台：广州康恒仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鱼样处理
将新鲜石斑鱼去鳞、除去内脏后，用无菌生理盐水冲洗干净，取脊背肉切分成约3 cm×3 cm×1 cm 的鱼块，随机称取约100 g 鱼块作为一份装入聚乙烯袋中，抽真空后封口。分别对包装好的石斑鱼样进行100、200、300、400、500 MPa 常温保压5 min 处理，以未经超高压处理的鱼样作为对照组。将处理后的鱼样放置于4 ℃冰箱中贮藏，并于第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 天取样测定指标。
1.3.2 菌落总数的测定
按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法进行测定，并以lg（cfu/g）为单位表示鱼样的菌落总数。
1.3.3 TVB-N 值测定
按照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法进行测定。
1.3.4 总巯基含量测定
首先对鱼样进行前处理，称取绞碎的鱼样2.0 g，加入10 mL 预冷的KCl 溶液（0.6 mol/L，pH7.0），混匀后经5 000 r/min 离心30 min（4 ℃），收集上清液。加入3 倍体积的预冷蒸馏水，5 000 r/min 离心20 min（4 ℃），收集沉淀，再加入等体积的预冷KCl 溶液（1.2 mol/L，pH7.0）摇匀，再次离心后得到的上清液即为样液。总巯基含量按照试剂盒操作说明进行测定。
1.3.5 pH 值测定
参考罗华彬等[11]的方法稍作修改，称取5.0 g 石斑鱼样并绞碎，加入45 mL 煮沸后冷却的蒸馏水，摇匀后静置30 min 过滤，取约30 mL 滤液用于pH 值测定。
1.3.6 TBA 值测定
称取绞碎鱼样5.0 g，加入30 mL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液混匀后静置1 h，过滤；滤液用TCA 定容至50 mL，按体积比1∶1 将5 mL 上清液与TBA 溶液（0.02 mol/L）混匀；置于100 ℃条件下水浴30 min，取出冷却，在532 nm 下测定吸光度。TBA 值用丙二醛（malondialdehyde，MDA）质量分数表示，单位为mg MDA/kg。
1.3.7 质构测定
参照郭丽萍等[9]的方法稍作改进，将鱼样切成2 cm×1 cm×1 cm 的块状置于质构仪上，在质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式下采用TA11/1000型探头对样品进行测试，测前速度2 mm/s、测试及测后速度均为1 mm/s，触发点负载20 g，循环两次，结果取5 次测量的平均值。
1.3.8 色泽测定
使用色彩色差计对鱼样的颜色进行测定，分别记录样品的L*（亮度）值、a*（红度）值、b*（黄度）值，并计算样品总色差变化ΔE*值，ΔE*值计算公式如下。
式中：L0*、a0*、b0*为鱼样的初始色泽参数；L*、a*、b*为经过处理后鱼样的色泽参数。
1.4 数据处理
试验数据使用Excel 软件进行处理，采用SPSS 22.0 进行差异显著性分析，使用SigmaPlot 14.0 绘图。
2 结果与分析
2.1 超高压处理对菌落总数的影响
微生物的生长繁殖是导致食品腐败变质的重要因素[12]，菌落总数能直观反映微生物的污染程度，是衡量食品新鲜度的一个重要指标。一般认为，水产品中菌落总数低于4 lg（cfu/g）属于一级鲜度，达到6～7 lg（cfu/g）可判定为腐败变质[13]。不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间菌落总数的变化如图1 所示。
图1 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间菌落总数的变化
Fig.1 Total bacterial count of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图1 可知，对照组石斑鱼样品的起始（第0 天）菌落总数为3.16 lg（cfu/g），经100、200 MPa 超高压处理后的样品菌落总数分别为3.11、2.98 lg（cfu/g），与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；当处理压力上升到300、400、500 MPa 时，样品的起始菌落总数分别降为2.10、1.50、1.24 lg（cfu/g），显著低于对照组（P＜0.05）。说明当处理压力达到300 MPa 及以上时能有效杀灭石斑鱼样品中的微生物，降低冷藏起始时的菌落总数。
随着冷藏时间的延长，100、200 MPa 处理的菌落总数变化规律与对照组趋于一致，在冷藏第4 天，菌落总数均超过4.08 lg（cfu/g），并于冷藏第12 天达到6.51 lg（cfu/g）以上，鱼样开始腐败变质，货架期终结；而300、400、500 MPa 处理的菌落总数分别于冷藏的第10、12、14 天达到4.37 lg（cfu/g）以上，其中400 MPa和500 MPa 处理的菌落总数延长至第18 天才超过6.55 lg（cfu/g）。上述结果表明，经超高压处理（300 MPa以上）对抑制石斑鱼在冷藏期间的细菌增长具有一定作用。
2.2 超高压处理对TVB-N 值的影响
TVB-N 值是评价水产品新鲜度的一个重要参数，能直接反映水产品腐败变质的程度[14]。不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间TVB-N 值的变化如图2 所示。
图2 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间TVB-N 值的变化
Fig.2 TVB-N content of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图2 可知，各处理组石斑鱼样品的起始TVB-N值为6.52～8.10 mg/100 g，属于一级鲜度，随着冷藏时间的延长，各处理组的TVB-N 值均呈现上升趋势。在冷藏前期（前8 d 内），各处理组的TVB-N 值增加缓慢，从第8 天开始，各处理的TVB-N 值增长趋势出现差异，对照组、100、200 MPa 处理组的TVB-N 值快速上升，在冷藏的第14 天已分别达到33.03、31.24、30.66 mg/100 g，超过GB/T 18108—2019《鲜海鱼通则》要求的范围值（≤30 mg/100 g）。随着处理压力的增加，TVB-N值增长放缓，300 MPa 处理在冷藏的第16 天达到31.05 mg/100 g，而400 MPa 和500 MPa 处理组的TVBN 值到冷藏的第18 天分别为26.86、25.72 mg/100 g，仍在要求的范围内。
各处理组的TVB-N 值变化趋势总体上与菌落总数的变化趋势相似，进一步说明随着样品中微生物的快速增长，会加速鱼肉中蛋白质的分解而产生大量的胺类物质，最终导致TVB-N 值的快速上升。综上所述，经超高压处理能有效延缓石斑鱼在冷藏期间TVB-N值的增加，延长冷藏货架期。
2.3 超高压处理对总巯基含量的影响
巯基对于稳定鱼肉肌原纤维蛋白的结构起到重要作用，同时也是鱼类肌肉蛋白中最具活性的功能基团，可通过测定巯基含量的变化来反映水产品蛋白质氧化变性的程度。不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间总巯基含量变化如图3 所示。
图3 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间总巯基含量变化
Fig.3 Total sulfhydryl content of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图3 可知，各处理组样品的总巯基含量随着冷藏时间的延长均呈下降趋势。对照组的总巯基含量从开始的57.8 µmol/g 到冷藏末期的12.8 µmol/g，下降了77.83%，且在第8 天后呈现明显下降趋势，100、200 MPa处理组的总巯基含量变化趋势与对照组相比基本相似；400、500 MPa 处理组的总巯基含量在冷藏前期下降趋势缓慢，到第12 天时分别下降了22.69%、18.48%，与对照组下降的47.03% 相比差异显著（P＜ 0.05），直至冷藏末期降为25.7、26.6 µmol/g，分别下降了52.72%、50.01%；而300 MPa 处理组的总巯基含量下降趋势居中。
综上，各处理组的总巯基含量变化趋势与TVB-N值结果呈负相关，这可能与样品肌原纤维蛋白质的变性降解有关[15]，同时也说明了超高压处理能有效地减缓巯基的氧化变性趋势。但在冷藏的起始阶段（第0天），400 MPa 和500 MPa 处理组的总巯基含量分别为52.2、51.4 µmol/g，低于对照处理，这与金婧彧等[10]研究结果类似，可能是由于超高压处理导致鱼样蛋白质空间构象发生改变，致使分子内部巯基暴露而被氧化，但从第10 天后直到冷藏末期，300 MPa 及以上处理组的总巯基含量均显著高于对照组（P＜0.05）。
2.4 超高压处理对pH 值和TBA 值的影响
不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间pH 值的变化如图4 所示。
图4 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间pH 值的变化
Fig.4 Changes in pH values of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图4 可知，各处理组的石斑鱼样品随着冷藏时间的延长，pH 值呈先降低后升高的趋势。有研究表明，在鱼肉的解僵初期，机体中的糖原通过无氧降解产生乳酸，然后在磷酸肌酸和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）作用下产生磷酸，使pH 值下降，之后鱼肉蛋白质在酶和微生物的作用下分解产生胺或其他碱性代谢物，使得pH 值回升[16-17]。对照组、100 MPa 和200 MPa 处理组在冷藏的第6 天达到最低pH 值，随后pH 值开始上升，在冷藏的第14 天均超过7.0，到冷藏末期分别达到7.19、7.16 和7.18；而300、400、500 MPa 处理组的pH 值下降较为缓慢，分别于第8、10、10 天达到最低值，随后pH 值开始上升，其中400、500 MPa 处理组的pH 值到冷藏的第18 天仍未超过7.0。上述结果表明，经超高压处理（300 MPa 及以上）能延缓石斑鱼样品pH 值在冷藏前期的下降及后期的上升。这可能与超高压处理对鱼样内源性酶及微生物生长的抑制作用有关[18]。
鱼肉中不饱和脂肪酸氧化酸败是导致其腐败变质的主要原因之一。丙二醛（MDA）是不饱和脂肪酸过氧化的分解产物，可与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应形成稳定的红色化合物，因此，TBA 值是检测鱼肉脂肪氧化和MDA 含量变化的综合衡量指标。不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间TBA 值的变化如图5 所示。
图5 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间TBA 值的变化
Fig.5 TBA values of grouper samples treated with different ultrahigh pressures during 4 ℃ refrigeration
从图5 可知，各处理组石斑鱼样品在冷藏期间的TBA 值基本呈先上升后缓慢降低的趋势，总体变化幅度不大。张进杰等[19]研究认为，TBA 值达到1～2 mg MDA/kg以上可判定鱼肉已腐败变质。但在本试验中，各处理组TBA 值的变化范围在0.28～0.65 mg MDA/kg，低于报道中的脂肪氧化值[20]，说明石斑鱼鱼肉中的脂肪氧化程度较低。这可能是因为石斑鱼本身脂肪含量相对其他鱼种偏低[21]，或是由于MDA 与鱼肉降解产生的氨基酸、醛、胺、核苷等物质结合导致[22]。
2.5 超高压处理对质构的影响
质构是评估水产品品质优劣的重要指标之一。本试验通过质地剖面分析（TPA）法分析经超高压处理后石斑鱼在冷藏期间的硬度、弹性、咀嚼性和内聚性的变化，结果如图6 所示。
图6 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间硬度、弹性、咀嚼性、内聚性的变化
Fig.6 Hardness， elasticity， chewing ability， and cohesion of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图6 可知，各处理组样品的硬度、弹性和咀嚼性均随冷藏时间的延长呈现下降趋势，其中，对照组、100、200 MPa 处理组的变化趋势相近；随着处理压力的增大，与对照组相比，400、500 MPa 处理组能显著提升样品的硬度、弹性和咀嚼性（P＜0.05），在冷藏初期（第0 天），硬度分别提升40.40%、53.87%，弹性分别提升12.50%、18.75%，咀嚼性分别提升54.12%、68.82%，且直至冷藏末期，上述3 种指标均高于对照组。但在整个冷藏过程中，各处理组的内聚性变化趋势并不明显，在0.65～0.70 内波动，变化幅度较小，组间差异不显著（P＞0.05），这与张涛[23]的研究结果相似。相关研究表明，超高压处理容易引起鱼肉蛋白构象改变、结构基团暴露[24]，促进内部化学键重组，诱导纤维组织重排[25]，进而影响鱼肉的质地。上述结果表明，超高压处理有利于保持石斑鱼在冷藏期间的硬度、弹性和咀嚼性等品质，提升石斑鱼的质构特性。
2.6 超高压处理对色泽的影响
色泽直接影响着水产品的外观，是评价水产品品质的一个重要指标。不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间色泽的变化如图7 所示。
图7 不同超高压处理的石斑鱼样品在4 ℃冷藏期间色泽的变化
Fig. 7 Color changes of grouper samples treated with different ultra-high pressures during 4 ℃ refrigeration
由图7 可知，超高压处理对石斑鱼在冷藏期间的L*（明亮度）值和a*（红度）值影响较为明显。与对照相比，在冷藏的起始阶段（第0 天），300 MPa 及以上处理可显著提高鱼肉的L*值（P＜0.05），当处理压力达到400、500 MPa 时，鱼肉的L*值与对照组相比分别提高了44.55%、48.54%，在随后的冷藏过程中，300 MPa 及以上处理的L*值均显著高于对照组（P＜0.05），而100、200 MPa 处理组的L*值变化趋势与对照组相近。吴永祥等[24]研究表明，臭鳜鱼鱼肉的L*值随处理压力的增加而增大，这可能与超高压处理引起鱼肉中的活性色素变化或蛋白质凝固从而增加了样品表面的光反射有关[26]。与L*值变化趋势相反，a*（红度）值随处理压力的增大而减少，在冷藏开始（第0 天）时，400、500 MPa处理组的a*值比对照组分别下降了26.09%、32.30%，随着冷藏时间延长，各处理a*值呈现下降趋势，且300 MPa 及以上处理组在贮藏16 d 内的a*值均显著低于对照组（P＜0.05）。这与Grossi 等[27]研究结果相似，可能是由于超高压处理过程中肌红蛋白发生氧化形成高铁肌红蛋白（变暗）所导致。
各处理的b*（黄度）值和ΔE*（总色差）值总体上随冷藏时间的延长而不断上升，但超高压处理对鱼肉的b*值变化影响较小，处理间的差异并不明显，b*值上升可能是由于鱼肉蛋白质和其他代谢物质的不断氧化而发黄所引起。ΔE*值越大反映色泽差异越大，Silva 等[28]研究表明，ΔE*值在0.50～1.50 表示差异小，在6.00～12.00 表示差异不同，大于12.00 表示差异非常大。从ΔE*值变化分析可知，各处理组的ΔE*值在冷藏前期变化较小，其中，对照、100、200 MPa 处理组的ΔE*值于第6 天后急剧上升，到第18 天时均超过12.00；相对400、500 MPa 处理组的ΔE*值则在第10 天后急剧上升，到冷藏末期均未达到12.00；而300 MPa处理在整个冷藏期间的ΔE*值变化幅度较小，在1.86～5.10 波动。上述结果表明，超高压处理对石斑鱼在冷藏期间的总色差影响低于对照组。
3 结论
超高压处理可有效降低石斑鱼在冷藏期间的菌落总数，处理压力越大杀菌效果越明显， 300 MPa 及以上处理能显著降低石斑鱼在冷藏期间的菌落总数达1～3 个数量级。同时，超高压处理能有效延缓石斑鱼在冷藏期间的腐败变质进程，400、500 MPa 处理能有效延缓石斑鱼在冷藏中后期（8～18 d）的TVB-N 值、pH值的上升，减慢总巯基含量的下降速率，但对TBA 值变化影响不显著。质构与色泽分析表明，400、500 MPa处理能显著提高石斑鱼在冷藏期间的硬度、弹性和咀嚼性，但对内聚性的变化影响不明显；而300 MPa 及以上处理可显著提高石斑鱼在冷藏期间的L*值，但a*值则随处理压力的增大而减少，超高压处理对b*值的变化影响不明显，而总色差ΔE*值变化显著低于对照处理。综合各数据分析与能耗考量，选取400 MPa 处理5 min 作为石斑鱼超高压处理的最适加工艺条件，能较好地保持其在4 ℃冷藏期间的品质特性。本研究结果可为进一步开发石斑鱼的超高压保鲜技术以及深入探究超高压处理的保鲜机制提供一定参考。
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