龙眼肉为无患子科植物龙眼（Dimocarpus longan Lour.）的假种皮，鲜品果肉呈白色透明，近似球形，果汁丰盈，味甜回甘，有特殊芳香，为药食同源物质。龙眼肉中化学成分丰富，主要含糖类、多酚类、氨基酸类、核苷类、萜类以及挥发性成分[1]，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳等生理活性[2-3]。多酚类成分是一类结构中含有一个或多个酚羟基的化合物总称，广泛存在于天然植物中，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保肝等活性，且兼具营养价值和药用价值[4-6]。龙眼肉中多酚类成分表现出明显的抗氧化活性，是果肉中重要的活性物质[7-8]。多酚类成分含量可作为评价龙眼果肉品质的指标之一。
龙眼主要种植于广西、广东、福建以及台湾等地。广西龙眼资源丰富、分布广泛，集中种植于桂南和桂西南地区，石硖、储良、大乌圆为主栽品种[9]。龙眼作为季节性水果，采摘后需要及时进行保鲜或加工处理，以防止果肉中多糖降解导致自溶，无法食用[10]。研究表明，现有龙眼保鲜技术有预冷处理、常温贮藏、低温贮藏、气调贮藏和包装等方式[11-14]。常温贮藏受季节以及地区的影响，并不能长时间维持果肉新鲜程度[15]，可加入防腐剂、保鲜剂以增长保鲜期[16-17]，常用熏硫法。低温贮藏较常温贮藏可延缓龙眼果肉中蔗糖代谢、防止果皮褐变以及龙眼果肉失重，保鲜效果明显，在龙眼肉贮藏和输送中广泛应用[18-20]。春节期间新鲜龙眼需求量增加，而广西龙眼成熟期主要在7 月中下旬～9 月[21]，可在夏季收获龙眼后通过长期冰冻贮藏的方式对龙眼进行保鲜以便春节期间食用。但是，长期冰冻贮藏是否会对龙眼果肉中多酚含量产生影响，导致抗氧化活性降低，尚未见报道。
本研究以产自广西的22 个品种龙眼肉为研究对象，探讨长期冰冻贮藏对于果肉中多酚含量和抗氧化活性的影响，为消费者科学食用龙眼肉提供建议，为选择适合长期冰冻贮藏的龙眼品种提供参考，以期推动广西地区龙眼资源的开发与利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
22 个不同品种（龙茗、灵龙、龙优、泰国热带、石石同锅T、桂香、桂广1 号、早熟广眼、畹町、博白大广眼、石硖、坡头大果、西贡1 号、安石、青皮石硖、早白露、龙垦1 号、白核、古山2 号、大乌圆、覃坤才、金秋）的新鲜龙眼于2023 年8 月采自广西农业科学院里建科学研究基地，经广西中医药大学黄荣韶教授鉴定为无患子科植物龙眼（Dimocarpus longan Lour.）。龙眼样品于-20 ℃条件下保存5 个月。
没食子酸标准品（纯度≥98%）：成都曼思特生物科技有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司；无水碳酸钠、抗坏血酸（vitamin C，VC）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度97%）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（纯度98%）、过硫酸钾、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（UV-2600）：岛津企业管理（中国）有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：国华（常州）仪器制造有限公司；超声波清洗机（JP-040）：深圳市洁盟清洗设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制
以没食子酸为对照品，分别用无水乙醇配制成浓度为10、20、30、40、50、60 µg/mL 的没食子酸标准溶液。取上述不同浓度的没食子酸标准溶液各125 µL于离心管中，再加入福林酚试剂125 µL，摇匀，避光反应6 min，加7.5%碳酸钠溶液1.25 mL，加1.5 mL 纯水补足3 mL，加盖摇匀，室温下避光放置60 min。在760 nm 波长下，用紫外可见分光光度计分别测定各浓度没食子酸标准溶液的吸光度。根据没食子酸质量浓度和吸光度，制作标准曲线[22]。
1.3.2 龙眼肉冷冻贮藏前后多酚含量的测定
冷冻贮藏前后不同品种龙眼均剥壳去核，取净果肉剪碎后放入具塞锥形瓶中，以1∶10 （g/mL）料液比加入无水乙醇，室温浸泡16 h。各提取液分别取125 µL于离心管中，按照1.3.1 方法操作，测定吸光度，并按下列公式计算其多酚含量（D，mg/g）。
式中：C 为提取液吸光度通过标准曲线计算得到的没食子酸浓度，µg/mL；V 为提取液的体积，mL；M 为样品的质量，g；f 为稀释倍数。
1.3.3 龙眼肉体外抗氧化能力的测定
1.3.3.1 样品的制备
根据1.3.2 测定得到的结果，选取鲜品龙眼肉中多酚含量高的前3 个品种进行体外抗氧化活性试验，研究长期冰冻贮藏前后果肉抗氧化活性的变化。各龙眼肉样品经超声辅助提取、加压浓缩，收集得粗提物浸膏，加纯水分别配制成浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 的溶液作为待测样品液。
1.3.3.2 体外抗氧化能力的测定
参考文献[22-24]的方法，以不同浓度的VC 溶液作为阳性对照，测定各样品液对于DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力，以及铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）。
DPPH、ABTS 工作液的配制：精密称取DPPH 粉末，加无水乙醇溶解，配制成0.25 mmol/L 的DPPH 工作液，避光冷藏。将7 mmol/L ABTS 工作液和2.45 mmol/L K2S2O8 溶液等体积混合，室温放置，避光12 h，配制成ABTS 工作液。DPPH、ABTS 工作液稀释适当倍数，使吸光度在正常范围，用于后续抗氧化试验。在500～800 nm 波长范围扫描，以确定检测波长。
DPPH 自由基清除能力的测定：取待测样品液各2.0 mL 于离心管中，分别加入DPPH 工作液2.0 mL，摇匀，室温避光放置30 min，测定吸光度A1。用无水乙醇代替DPPH 工作液，相同步骤测定吸光度A2 作为对照组；用无水乙醇代替样品，相同步骤测定吸光度A0作为空白组。用不同浓度的VC 溶液作为阳性对照。待测样品液对DPPH 自由基清除率（H，%）按照下式计算。
ABTS+自由基清除能力的测定：取待测样品液各1.0 mL 于离心管中，分别加入ABTS 工作液3.0 mL，摇匀，室温避光放置30 min，测定吸光度A1。用纯水代替ABTS 工作液，同法测定吸光度A2 作为对照组；用纯水代替样品溶液，同法测定吸光度A0 作为空白组。用不同浓度的VC 溶液作为阳性对照。待测样品液对ABTS+自由基的清除率（S，%）按照下式计算。
铁离子还原能力的测定：取待测样品各1.0 mL 于离心管中，分别加入磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液2.5 mL 和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，于50 ℃水浴20 min，再加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL，以3 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入纯水2.5 mL 和1% 三氯化铁溶液0.5 mL，摇匀，用紫外可见分光光度计在700 nm 波长下测定吸光度A2。用不同浓度的VC 溶液作为阳性对照。样品对铁离子的还原能力用还原率（P，%）表示，还原率按下式计算。
1.4 数据处理
数据处理分析采用Excel 和SPSS Statistics 26，图形采用Origin 85 绘制。
2 结果与分析
2.1 没食子酸标准曲线测定
没食子酸标准曲线见图1。
图1 没食子酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of gallic acid
由图1 可知，在10～60 µg/mL 质量浓度内，没食子酸标准溶液吸光度和质量浓度线性关系良好，可用于龙眼肉多酚含量的测定。其线性回归方程为Y=0.005 2X-0.008 5，R2=0.999 4（式中：Y 为吸光值；X 为没食子酸质量浓度，µg/mL）。
2.2 不同品种龙眼肉多酚含量结果分析
22 个不同品种龙眼肉长期冰冻贮藏前后的多酚含量对比见表1 和图2。
表1 不同品种龙眼肉鲜品及冻品中多酚含量对比
Table 1 Comparison of polyphenol content in fresh and frozen longan pulp of different varieties
品种大乌圆早熟广眼泰国热带金秋龙垦1 号多酚含量/（mg/g）鲜品84.83 71.21 64.98 61.27 64.48冻品6.64 5.79 6.25 6.14 6.56变化幅度/%92.17 91.87 90.38 89.98 89.83
续表1 不同品种龙眼肉鲜品及冻品中多酚含量对比
Continue table 1 Comparison of polyphenol content in fresh and frozen longan pulp of different varieties
品种青皮石硖覃坤才早白露石硖古山2 号坡头大果博白大广眼安石桂香西贡1 号桂广1 号龙优龙茗石石同锅T白核畹町灵龙多酚含量/（mg/g）鲜品70.01 69.71 63.28 49.66 49.81 54.31 51.46 29.84 35.17 19.43 33.63 37.30 30.54 16.42 18.94 6.74 7.39冻品8.55 8.86 9.10 7.96 8.07 8.80 10.05 7.45 9.14 5.38 10.25 11.55 9.71 5.97 10.05 7.23 7.83变化幅度/%87.79 87.29 85.62 83.97 83.80 83.80 80.47 75.04 74.01 72.32 69.52 69.03 68.21 63.64 46.95 7.29 5.96
图2 冰冻贮藏前后不同品种龙眼肉的多酚含量
Fig.2 Polyphenol content in the pulp of different longan varieties before and after frozen storage
由表1 可知，灵龙和畹町多酚含量变化幅度小，其余品种受长期冰冻贮藏的影响，多酚含量变化明显。这与冷冻贮藏导致灵武长枣、山竹果肉多酚含量下降的研究结果一致[25-26]。大乌圆、早熟广眼和泰国热带多酚含量变化最大，分别下降92.17%、91.87% 和90.38%。鲜品多酚含量为6.74～84.83 mg/g，冻品多酚含量为5.38～11.55 mg/g。
由图2 可知，在鲜品龙眼肉中不同品种的多酚含量差异明显，长期冰冻贮藏后，冻品龙眼品种间多酚含量差异化减小。鲜品中大乌圆多酚含量最高，畹町多酚含量最低，两者之比为12.59。冻品中龙优多酚含量最高，西贡1 号的多酚含量最低，两者之比为2.15。由此可知，长期冰冻贮藏导致龙眼肉多酚含量明显下降。
为评价龙眼品种与果肉中多酚含量的相关性，用SPSS Statistics 26 软件对22 个鲜品龙眼肉多酚含量测定结果采用聚类分析法进行分析，结果见图3。
图3 不同品种龙眼肉聚类分析树状图
Fig.3 Cluster analysis of different longan varieties based on the polyphenol content in the pulp
由图3 可知，当平均欧氏距离d=9 时，22 个品种龙眼可聚分为3 类，其中大乌圆多酚含量最高，聚为1 类；石硖、古山2 号、博白大广眼、坡头大果、青皮石硖、覃坤才、早熟广眼、泰国热带、龙垦1 号、早白露和金秋果肉多酚含量较高，聚为1 类；龙茗、安石、桂香、桂广1 号、龙优、灵龙、畹町、西贡1 号、白核和石石同锅T 果肉多酚含量相对较少，聚为1 类。
2.3 龙眼肉冰冻贮藏前后抗氧化活性
根据2.2 多酚含量测定结果，选择大乌圆、早熟广眼和青皮石硖这3 个品种进行体外抗氧化活性研究。
2.3.1 DPPH 自由基清除能力
根据紫外可见分光光度计测定得到DPPH 溶液最大紫外吸收波长为516 nm，故选择在516 nm 波长条件下，进行龙眼肉样品液的吸光度测定，计算各样品液对DPPH 自由基的清除率，结果见图4。
图4 龙眼肉冰冻贮藏前后的DPPH 自由基清除率
Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of longan pulp before and after frozen storage
由图4 可知，3 个品种龙眼肉冰冻贮藏前后的样品液均对DPPH 自由基表现出清除作用，且清除能力随质量浓度的增加，整体呈上升趋势，龙眼肉长期冰冻贮藏可增强DPPH 自由基的清除能力。不同品种龙眼肉对于DPPH 自由基清除能力存在明显差异，通过SPSS Statistics 26 计算各自样品的IC50 值进行排序，清除能力从强到弱依次为大乌圆（冻品）＞大乌圆（鲜品）＞青皮石硖（冻品）＞早熟广眼（冻品）＞青皮石硖（鲜品）＞早熟广眼（鲜品），IC50 值分别为0.645、1.373、2.027、2.049、2.321、2.818 mg/g。大乌圆、早熟广眼和青皮石硖受长期冰冻贮藏影响，抗氧化能力分别增强53.02%、27.29%、12.67%（基于各IC50值计算）。在0.5～2.5 mg/mL浓度下，阳性对照组VC 对DPPH 自由基的清除能力均大于3 个品种龙眼肉的样品液，当大乌圆（冻品）的浓度为3.5 mg/mL 时，对DPPH 自由基的清除能力与阳性对照组相近。
2.3.2 ABTS+自由基清除能力
采用紫外可见分光光度计测定ABTS 溶液的最大紫外吸收波长为731 nm，故选择在731 nm 波长条件下，进行龙眼肉样品液的吸光度测定，并计算各样品液对ABTS+自由基的清除率，结果见图5。
图5 龙眼肉冰冻贮藏前后的ABTS+自由基清除率
Fig.5 ABTS+ free radical scavenging rate of longan pulp before and after frozen storage
由图5 可知，3 个品种龙眼肉冰冻前后的提取液均可抑制ABTS+自由基，且抑制率随浓度增加而升高，同一浓度下阳性对照组VC 对ABTS+自由基的清除率明显高于各龙眼肉样品。根据样品各自的IC50 值，清除率从高到低依次为大乌圆（鲜品）＞大乌圆（冻品）＞早熟广眼（鲜品）＞青皮石硖（鲜品）＞早熟广眼（冻品）＞青皮石硖（冻品），IC50 值分别为0.973、1.124、1.311、1.757、2.058、3.074 mg/g。龙眼肉长期冰冻贮藏对ABTS+自由基的清除能力小幅度降低。当浓度为3.5 mg/mL时，大乌圆冰冻贮藏前后的样品与阳性对照组VC 清除能力相近，清除率接近100%；早熟广眼的鲜品、冻品和青皮石硖的鲜品、冻品在3.5 mg/mL 浓度下，清除率分别为79.61%、74.56%、78.43%、54.55%；青皮石硖受冰冻贮藏的影响最大，ABTS+自由基的清除率下降了23.88%。
2.3.3 铁离子还原能力的测定
3 个品种冰冻贮藏前后龙眼肉样品对铁离子还原能力的变化见图6。
图6 龙眼肉冰冻贮藏前后对铁离子的还原能力
Fig.6 Ferric reducing antioxidant power of longan pulp before and after frozen storage
由图6 可知，阳性对照组VC 的还原能力明显高于各龙眼肉样品，但随着各龙眼肉样品浓度的增加，对于铁离子还原能力也逐渐增强，高浓度龙眼肉样品对铁离子还原能力良好。当样品浓度为2.5 mg/mL 时，还原能力从强到弱依次为大乌圆（鲜品）＞青皮石硖（鲜品）＞早熟广眼（鲜品）＞大乌圆（冻品）＞早熟广眼（冻品）＞青皮石硖（冻品）。龙眼肉长期冰冻贮藏后对铁离子还原能力小幅度降低，通过比较2.5 mg/mL 浓度下各品种的还原率，大乌圆、青皮石硖、早熟广眼对铁离子还原率分别下降3.46%、6.11%、3.78%。
鲜品龙眼肉对ABTS+自由基清除能力和对铁离子还原能力均高于冻品，而DPPH 自由基清除试验中冻品表现出更强的清除能力，可能是因为ABTS+自由基和DPPH 自由基的清除机制不同，其机制分别涉及电子转移和氢原子转移，造成冰冻贮藏后抗氧化活性变化情况出现差异。龙眼提取物的浓度与其抗氧化活性呈现正相关性，这与已报道的研究结果一致[27]。
3 结论
通过考察长期冰冻贮藏条件下对广西产22 个不同品种龙眼肉中多酚含量的影响情况，分析得到大乌圆、青皮石硖和早熟广眼的鲜品多酚含量高、抗氧化活性强，建议应季鲜果食用。冰冻贮藏会导致大多数品种龙眼肉中多酚含量下降，而龙优和桂广1 号冷冻贮藏后多酚含量高于其他品种，可用于冰冻贮藏。本研究可为蔬果长期冰冻贮藏品种筛选提供参考。后续将深入研究不同贮藏方式对龙眼肉活性成分的影响。
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