蜜二糖是由α-D-半乳糖和α-D-葡萄糖组成的还原性二糖，具有益生元特性，能够促进肠道对Ca2+和槲皮素的吸收以及双歧杆菌和乳杆菌的生长[1-2]，以改善肠道环境、促进人体健康[3]。此外，蜜二糖在人体中能稳定发挥正常的生理活性[2]，可以减少神经炎症[4]、抑制神经退行性疾病诱导物聚谷氨酰胺的聚集[5]和减缓帕金森病中多巴胺能神经元的损伤[6] ，是阿兹海默症的潜在治疗药物；也能调节辅助性T 细胞的应答并提高口服耐受性，从而预防和减缓过敏症状[7]。因此，蜜二糖在疾病治疗、功能性食品的开发等方面具有潜在的应用价值。
目前，合成蜜二糖的主要方法是利用糖苷水解酶水解棉籽糖，例如在β-呋喃果糖苷酶[8]或果聚糖蔗糖酶[9]的催化下将棉籽糖的果糖基裂解合成蜜二糖。Xu等[10]利用大肠杆菌异源表达肠膜明串珠菌的果聚糖蔗糖酶，以棉籽糖和乳糖为底物，反应获得88 g/L 的蜜二糖。Zhou 等[11]以棉籽糖为底物，利用酿酒酵母作为全细胞催化工厂合成蜜二糖，通过基因工程对菌株进行改造，提高了底物利用率和产物纯度[12]。但是由于棉籽糖的价格较高，无论是以其作为底物水解还是利用全细胞催化工厂生产蜜二糖的成本均较高，而且全细胞催化的效率以及稳定性仍有待提高，因此开发出一种低成本且稳定高效的蜜二糖生物合成方法十分必要。
蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，SPase）主要来源于肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、变形链球菌（Streptococcus mutans）、嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）以及双歧杆菌（Bifidobacterium sp.），其中肠膜明串珠菌的产酶量最高[13]，属于α-淀粉酶家族，可以水解蔗糖形成果糖和葡萄糖-1-磷酸，然后将葡萄糖-1-磷酸的葡萄糖基转移至其他单糖、二糖和多糖基受体中，形成功能性低聚糖[13-14]，其中肠膜明串珠菌 B-1149 来源的SPase 有较高的转移葡萄糖基团能力，可以以半乳糖、蔗糖、果糖等其他糖类作为受体[14-15]。除糖类受体外，SPase 还能转移葡萄糖基至一磷酸胞嘧啶[16]、酚类化合物[17]和有机酸[18]等。目前，利用SPase 转糖基能力的研究主要集中在合成糖苷类化合物（如α-熊果苷），以单糖为受体合成低聚糖的研究鲜有报道。
本研究从来源于芒果的肠膜明串珠菌基因组中克隆获得SPase 基因，发现其与肠膜明串珠菌 B-1149 来源的SPase 有99%同源性，通过异源表达对其酶学性质表征，利用其转糖基的能力，转移蔗糖的葡萄糖基至半乳糖基受体进而大量合成蜜二糖，提供了更低成本的蜜二糖合成方法，以期为蜜二糖的合成挖掘新型的酶资源，在制药、生物医学、化妆品和食品等领域展现出良好的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）菌株分离自芒果果肉；大肠杆菌（Escherichia. coli）DH5α、克隆载体pMD-18T、表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）、表达载体pET-32a：由华南农业大学食品学院实验室保存。
1.1.2 主要试剂
限制性内切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、PrimeStar Max DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶（350 U/μL）、DNA Marker、蛋白质Marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA 提取试剂盒：广州美基生物科技有限公司； BCA 蛋白浓度检测试剂盒（PierceTM BCA Protein Assay Kit）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；蔗糖磷酸化酶测试盒：苏州科铭生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、Ni-NTA 6FF 琼脂糖纯化树脂：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物、DNA 测序：广州天一辉远基因科技有限公司；乙腈（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；蜜二糖（色谱纯）：北京索莱宝科技有限公司；氨苄青霉素（ampicllin，Amp）、蔗糖、D-半乳糖、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 仪器与设备
LC-2030 高效液相色谱仪（配有RID-20A 示差检测器）：日本株式会社岛津制作所；Ultimate® XB-NH2色谱柱（5.0 μm，250 mm×4.6 mm）：月旭科技（上海）有限公司；YX-280D 手提式压力蒸汽灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司；JY92-2D 超声波破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 培养基的制备
LB 培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L（固体培养基中加入琼脂20 g/L），121 ℃灭菌30 min，抗性筛选时加入氨苄青霉素（Amp）使其终浓度为100 mg/L。
MRS 培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、吐温-80 1 mL、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L（固体培养基中加入琼脂20 g/L），pH6.2～6.4，121 ℃灭菌20 min。
1.2.2 SPase 基因的克隆
从Genbank 数据库查找肠膜明串珠菌 SPase 基因序列（JAUJ01000007.1）进行引物设计，R：5'-CGGAATTCATGGAAATTCAAAATAAAGC-3'（S1），F：5'-TTGCGGCCGCTTACAATTGTTG-3'（S2），分别带有用下划线标记的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ。提取肠膜明串珠菌的基因组并以此DNA 为模板，使用Prime-Star Max DNA 聚合酶进行PCR 扩增，目的条带回收后与pMD-18T 连接，随后通过热激转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于LB 固体平板上（含Amp ）。37 ℃培养12～16 h 后挑取单菌落，验证阳性克隆pMD-18T-SPase。将阳性克隆pMD-18T-SPase 通过广州天一辉远基因科技有限公司进行测序验证。
1.2.3 大肠杆菌重组表达载体构建
对pMD-18T-SPase 和表达载体pET-32a 均用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ 进行双酶切，分别回收目的基因片段和载体框架。使用T4 DNA 连接酶将目的基因片段与载体框架在16 ℃的条件下连接12 h，连接产物转入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，菌液涂布于LB 固体平板上（含Amp ）。37 ℃培养12～16 h 后挑取单菌落，验证阳性克隆，送至广州天一辉远基因科技有限公司进行测序验证，获得重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-32a-SPase。
1.2.4 重组大肠杆菌的诱导表达
将鉴定正确的重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-32a-SPase 接种于 LB 液体（含100 mg/L Amp ）培养基中，37 ℃、200 r/min 恒温振荡过夜培养，按1% 接种量转接至50 mL LB 液体（含100 mg/L Amp ）培养基中，37 ℃、200 r/min 恒温振荡培养2.5 h，使菌液OD 值达到0.8，加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，30 ℃诱导表达3 h。
1.2.5 重组SPase 的纯化
发酵液离心 （4 ℃、8 000 r/min、15 min）后得到的菌泥，用 0.5 mol/L 磷酸钾缓冲液 （pH6.5） 洗涤并浓缩。浓缩后的菌液经高压破碎后离心（4 ℃、12 000 r/min、30 min） 得到的上清液即为粗酶液。粗酶液用Ni-NTA亲和层析法，采用含 250 mmol/L 咪唑的磷酸缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为 10 kDa 的超滤离心管离心脱除咪唑，得到纯酶液。采用聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行蛋白质分离鉴定，同时测定SPase酶活力与蛋白质浓度。
1.2.6 重组SPase 的酶学性质测定
SPase 酶活的定义：在37 ℃、pH6.8 的条件下，每分钟催化反应产生1 nmol 烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen，NADPH）所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。
相对酶活力即各条件下的酶活力与最适条件下的酶活力的百分比。
残余酶活力即各条件下保温后的酶活力与最高酶活力的百分比。
1.2.6.1 pH 值对SPase 酶活的影响及稳定性的测定
1）最适pH 值测定：将纯化的酶置于50 mmol/L 的柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液（pH4.0～5.0）和50 mmol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH6.0～7.0）以及 50 mmol/L的Tris-HCl（8.0～9.0），在37 ℃下反应5 min，煮沸终止反应，测定酶活力，以相对酶活力表示，每组试验重复3 次以确定最佳pH 值。
2）pH 稳定性测定：将纯化的酶置于不同pH 值（pH5.5～8.0）的缓冲液中，在37 ℃下保温2 h 后反应5 min，煮沸终止反应，测定残余酶活力，每组试验重复3 次以研究pH 稳定性。
1.2.6.2 温度对SPase 酶活的影响及稳定性的测定
1）最适温度测定：将纯化的酶置于最适pH 值中，在不同的温度（30～80 ℃）下反应5 min，煮沸终止反应，测定酶活，以相对酶活力表示，每组试验重复3 次以确定最佳反应温度。
2）热稳定性测定：将纯化的酶置于最适pH 值中，在不同的温度（20～45 ℃）下保温2 h 后反应5 min，煮沸终止反应，测定残余酶活力，每组试验重复3 次以研究反应温度的稳定性。
1.2.7 蜜二糖合成条件单因素试验
1.2.7.1 底物浓度对蜜二糖合成的影响
等质量混合蔗糖与D-半乳糖，加入一定量的纯化酶液与pH6.0 的Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，配制底物浓度为300、400、500、600 g/L 和700 g/L 的混合液，酶液添加量为100 U/L。将混合物置于30 ℃反应5 h 后取样，放入100 ℃灭活10 min，通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测蜜二糖产量，试验重复3 次。
1.2.7.2 蔗糖占比对蜜二糖合成的影响
更换蔗糖占比即更换蔗糖与D-半乳糖混合物的质量比，使蔗糖与D-半乳糖比例分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5，对应的蔗糖占比分别为80%、67%、50%、33%、20%、17%，加入一定量的纯化酶液与pH6.0的Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，配制底物浓度为600 g/L的混合液，酶液添加量为100 U/L。将混合物置于30 ℃反应5 h 后取样，放入100 ℃灭活10 min，通过HPLC 检测蜜二糖产量，试验重复3 次。
1.2.7.3 反应温度对蜜二糖合成的影响
等质量蔗糖与D-半乳糖的混合物中加入一定量的纯化酶液与pH6.0 的Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，配制底物浓度为600 g/L 的混合液，酶液添加量为100 U/L。将混合物置于20、30、40、50、60 ℃中反应5 h 后取样，放入100 ℃灭活10 min，通过HPLC 检测蜜二糖产量，试验重复3 次。
1.2.7.4 酶液添加量对蜜二糖合成的影响
在最适底物浓度、蔗糖占比的条件下，更改酶液添加量分别为30、50、100、180、390、585 U/L，在最适反应温度下反应5 h 后取样，放入100 ℃灭活10 min，通过HPLC 检测蜜二糖产量，试验重复3 次。
1.2.7.5 反应时间对蜜二糖合成的影响在上述所有最适条件下反应40 h，每2 h 取样一次，放入100 ℃灭活10 min，通过HPLC 检测蜜二糖产量，试验重复3 次。
1.2.8 响应面设计优化蜜二糖合成条件
利用响应面优化蜜二糖的合成条件，使用Design-Expert 13 软件进行Box-Behnken 试验设计和分析。根据单因素试验得到的结果，选择底物浓度、蔗糖占比、反应温度为自变量，以蜜二糖合成量为响应值，各因素变化根据单因素试验而定，在最适酶液添加量与最适反应时间下进行试验，每个试验重复3 次，试验因素与水平编码如表1 所示。
表1 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test
水平- 1 01 A 底物浓度/（g/L）400 500 600 B 蔗糖占比/%33 50 67 C 反应温度/℃20 30 40
1.2.9 蔗糖和蜜二糖的检测条件
色 谱 柱：Ultimate® XB-NH2 色 谱 柱（5.0 μm，250 mm×4.6 mm）；温度：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：75%乙腈；进样量：20 μL。
1.3 数据处理
上述所有试验均重复3 次，数值以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8.0 以及SPSS Statistics 27.0 软件完成数据处理与分析。
2 结果与分析
2.1 SPase 基因的克隆及重组质粒构建
使用引物（S1）和（S2）从肠膜明串珠菌的基因组中扩增得到了SPase 序列，结果见图1。
图1 SPase 基因克隆
Fig.1 SPase gene cloning
由图1 可知，距离1 200 bp 处有单一且明亮的条带，与预期条带大小相符。将PCR 产物与pMD-18T载体进行相连，构成克隆质粒pMD-18T-SPase，将其转入大肠杆菌DH5α 后，挑选转化子提其质粒，质粒测序结果显示该片段大小为1479 bp。
肠膜明串珠菌 B-1149 来源的SPase 显示以半乳糖作为受体时，有较高的转移葡萄糖基团能力[14]。目的基因测序结果与B-1149 来源的酶对比，有99.39%的同源性，仅有3 个氨基酸残基的差异（F8L、D335N、S382N），因此初步推断本研究的酶具有相似的葡萄糖基团转移能力。
将pMD-18T-SPase 和质粒pET-32a 同时进行双酶切，利用T4 连接酶对表达载体框架与目的条带进行重组连接，构建pET-32a-SPase，将其转入E.coli BL21（DE3）后，挑选转化子提其质粒，对质粒进行双酶切验证，结果见图2。
图2 表达质粒鉴定
Fig.2 Identification of expression plasmid
由图2 可知，在泳道1 处有两条条带，分别为SPase 目的条带与酶切后表达载体pET-32a 的条带，结果与预计条带大小一致，测序结果显示SPase 基因序列无突变，该结果表明SPase 基因表达重组菌株E.coli BL21（DE3）-pET-32a-SPase 构建成功。
2.2 SPase 的表达与蛋白纯化
挑选测序正确的重组菌株E.coli BL21（DE3）-pET-32a-SPase 摇瓶诱导培养。收集其菌体，破碎后离心取上清液，上清液经聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE），结果如图3 所示。
图3 SPase 蛋白的SDS-PAGE 分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of SPase protein
由图3 可知，经过IPTG 诱导后，在74.1 kDa 处有较深的条带，条带大小与SPase 蛋白分子量大小相符。经Ni- NTA 亲和层析后，即可得到纯酶液，泳道2 中显示为单一的目的条带，说明SPase 已成功得以纯化。通过BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定，纯化前后的蛋白质含量分别为 24.84 mg/mL 和 12.52 mg/mL ，纯化比例达到 50.42% 。试剂盒测得纯化前后比酶活分别为42 U/mg 和 78 U/mg。
2.3 重组SPase 的酶学性质分析
2.3.1 pH 值对重组SPase 的影响
不同pH 值对重组SPase 的影响见图4。
图4 pH 值对重组SPase 的影响
Fig.4 Effect of pH on recombinant SPase
由图4A 所示，SPase 的酶活力随着pH 值的增加呈先上升后下降的趋势，SPase 在pH 值为6.0 时相对酶活力最高，在pH 值为7.0～9.0 时，相对酶活力可保持在85% 以上。由图4B 可知，SPase 经37 ℃下保温2 h 后，在pH 值为6.0～7.0 时，残留酶活力仍保持90%以上，当pH 值低于6.0 和高于7.0 时，残留酶活力呈现较大幅度下降，但仍保持70% 以上的酶活力，这说明SPaes 有良好的酸碱适应能力。不同来源的SPase有相似的pH 稳定性，长双歧杆菌（Bifidobacterium longum JCM1217）的最适pH 值范围为6.0～6.5[19]，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的最适pH 值范围为7.0～7.5[20]，当pH 值大于 8.0 时，不同来源的SPase 的酶活力会发生明显的下降趋势。
2.3.2 温度对重组SPase 的影响
不同温度对重组SPase 的影响见图5。
图5 温度对重组SPase 的影响
Fig.5 Effect of temperature on recombinant SPase
由图5A 可知，SPase 的最适温度为40 ℃；当温度在30～40 ℃间时，SPase 均保持较好的催化活性，有90%以上的相对酶活力，但温度超过40 ℃后，酶活力损失增加。在工业生产中，酶的热稳定性是非常重要的应用参数，由图5B 可知，在25～35 ℃的条件下保温2 h 后，SPase 的残留酶活力仍保持在95% 以上。目前，用于合成糖苷类化合物的蔗糖磷酸化酶主来源于肠膜明串珠菌（L. mesenteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium sp）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），Bifidobacterium sp[21]和Bacillus megaterium[20]的最适温度范围是50～70 ℃，与其他来源的SPase 热稳定性相比，利用肠膜明串珠菌来源的 SPase 合成蜜二糖更有利于节约在工业生产时因温度所带来的耗能成本。
2.4 蜜二糖合成的单因素分析
2.4.1 底物浓度对蜜二糖合成的影响
利用肠膜明串珠菌来源的SPase 合成蜜二糖时，为考察不同底物浓度对蜜二糖产量的影响，选用不同底物浓度进行试验，试验结果见图6。
图6 不同底物浓度对蜜二糖产量的影响
Fig.6 Effect of different substrate concentrations on yield of melibiose
由图6 可知，蜜二糖产量随着底物浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。底物浓度过低时，SPase 会将大量糖基供体的葡萄糖基转移至水分子上，进而发生水解反应，仅有小部分的葡萄糖基转移至D-半乳糖的受体上，发生转苷反应[22-23] ，因此底物浓度较低时，蜜二糖产量较少。当底物浓度达到500 g/L 时，此时蜜二糖产量最高，但随着底物浓度持续增加，蜜二糖产量反而显著下降。这与SPase 的活性口袋与糖基供体和受体的接触概率降低有关，此时酶促反应受到了抑制[24-25]。因此，选择底物浓度400、500、600 g/L 进行响应面优化试验。
2.4.2 蔗糖占比对蜜二糖合成的影响
为考察蔗糖占比对蜜二糖产量的影响，选用不同的蔗糖占比进行试验，试验结果见图7。
图7 不同蔗糖占比对蜜二糖产量的影响
Fig.7 Effect of different sucrose ratios on yield of melibiose
由图7 可知，蔗糖占比过高或者过低都会导致供体或受体不足，当蔗糖占比为 50% 时，蜜二糖产量最高，说明该条件下，SPase 与两种底物的总亲和能力达到最大，这结果与Xu 等[10]利用棉籽糖和乳糖合成蜜二糖研究结果相似，当两种底物浓度比相等时所获得的产量最高。因此，选择蔗糖占比33%、50%、67% 进行响应面优化试验。
2.4.3 反应温度对蜜二糖合成的影响
为考察不同反应温度对蜜二糖产量的影响，选用不同反应温度进行试验，试验结果见图8。
图8 不同反应温度比对蜜二糖产量的影响
Fig.8 Effect of different reaction temperature ratios on yield of melibiose
反应温度在蜜二糖的合成中起着关键作用，因为温度的升高可以提高底物的溶解度，同时也会提高或制约酶的反应速率，因此找到酶促反应的平衡点尤为重要。由图8 可知，蜜二糖合成的最适温度为30 ℃，这与Xia 等[26]利用SPase 转糖苷能力催化合成α-熊果苷研究的反应温度一致。在20～30 ℃的条件下，蜜二糖产量逐渐增多，但超过30 ℃时，蜜二糖生成量急剧下降。推测原因是虽然温度提升对底物溶解度有提高，进而提高底物与酶的碰撞概率，但SPase 的三维结构会随着温度上升而发生不可逆的变化。结合上述温度对酶活力影响的结果分析，在30 ℃时，SPase 的稳定性是最好的，三维结构是最稳定的，转糖苷活性最好，因此有利于反应合成蜜二糖。与另外两种葡萄糖基转移酶（纤维二糖磷酸化酶与麦芽糖磷酸化酶）相比，SPase 转移葡萄糖基到半乳糖基受体的温度更低，反应更容易进行，更有利于工业化生产[27]。因此，选择反应温度20、30、40 ℃进行响应面优化试验。
2.4.4 酶液添加量对蜜二糖合成的影响
为考察不同的酶液添加量对蜜二糖产量的影响，选择不同的酶液添加量进行试验，试验结果见图9。
图9 不同酶液添加量对蜜二糖产量的影响
Fig.9 Effect of different enzyme liquid addition on yield of meliobiose
由图9 可知，随着酶液添加量的增加，蜜二糖产量逐渐上升，当酶液添加量高于390 U/L 后，蜜二糖产量无明显的上升趋势。根据试验结果，最终选择酶液添加量为390 U/L。
2.4.5 反应时间对蜜二糖合成的影响
为考察不同反应时间对蜜二糖合成量的影响，选择不同的反应时间进行试验，试验结果见图10。
图10 不同反应时间对蜜二糖产量的影响
Fig.10 Effect of different reaction time on yield of meliobiose
由图10 可知，当酶液添加量为 390 U/L 时，反应24 h，蜜二糖产量达到平台期。即当蔗糖 250 g/L、D-半乳糖 250 g/L，酶液添加量为 390 U/L 时，在 30 ℃下反应 24 h，蜜二糖产量达到（29.22±0.41）g/L。
2.5 蜜二糖合成的响应面优化分析
2.5.1 响应面试验设计及回归方程模型的建立
根据单因素试验得到的结果，以蜜二糖产量为响应值（Y），选择底物浓度（A）、蔗糖占比（B）、反应温度（C）为自变量进行响应面中心组合试验，确定酶法合成蜜二糖的最佳配方，试验设计和结果如表2、表3所示。
表2 中心组合试验设计结果
Table 2 Experimental design results of center combination
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 底物浓度/（g/L）400 600 400 400 600 500 500 500 500 500 500 600 600 500 500 400 500 B 蔗糖占比/%50 50 67 33 33 67 50 50 67 33 33 67 50 50 50 50 50 C 反应温度/℃40 20 30 30 30 40 30 30 20 40 20 30 40 30 30 20 30 Y 蜜二糖产量/（g/L）14.18 10.80 12.14 18.20 29.26 19.26 22.82 25.72 10.55 26.59 18.79 21.58 34.2 26.44 22.94 13.42 23.81
表3 响应面模型的方差分析结果
Table 3 ANOVA results of response surface model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型A 底物浓度B 蔗糖占比C 反应温度AB AC BC A2 B2 C2总残差失拟项净误差总和平方和730.32 179.56 107.35 206.83 0.65 128.17 0.2 23.23 12.17 62.38 19.79 8.91 10.88 750.11自由度91111111117341 6均方81.15 179.56 107.35 206.83 0.65 128.17 0.2 23.23 12.17 62.38 2.83 2.97 2.72 F 值28.7 63.51 37.97 73.15 0.23 45.33 0.072 8.22 4.3 22.06 1.09 P 值0.000 1＜0.000 1 0.000 5＜0.000 1 0.645 3 0.000 3 0.795 7 0.024 1 0.076 7 0.002 2 0.448 8显著性*************
通过Design-Expert 13 软件对试验结果进行分析，建立二次多项回归方程：Y=24.35+4.74A-3.66B+5.08C-0.41AB+5.66AC+0.23BC-2.35A2-1.70B2-3.85C2，并对回归模型进行方差分析。
由表3 可知，该模型P＜0.01，说明模型效应影响极显著，与实际试验拟合程度高；R2=0.973 6，失拟项1.09，表明试验值与预测值之间的误差不显著，能很好预测蜜二糖产量。在一次项中A、B、C 对蜜二糖产量均影响极显著（P＜0.01），根据F 值大小可判断影响蜜二糖产量主次顺序为反应温度（C）＞底物浓度（A）＞蔗糖占比（B）；而相互作用项中底物浓度与反应温度AC（P＜0.01）对蜜二糖的合成影响极显著。
2.5.2 各因素之间相互作用对蜜二糖产量的影响
基于回归模型方差分析，根据相互作用项的等高线与坡度图可以看出影响蜜二糖产量的因素，曲面坡度越陡峭，表明两者交互作用的显著性越强；等高线弯曲幅度越大，表明两者交互影响性越强[28]。
蜜二糖产量与底物浓度、温度、蔗糖占比交互作用的响应面见图11。
图11 蜜二糖产量与底物浓度、温度、蔗糖占比交互作用的响应面关系
Fig.11 Response surface of interaction between melitose yield and substrate concentration，temperature，and substrate ratio
如图11 所示，底物浓度（A）与蔗糖占比（B）交互作用的等高线和蔗糖占比（B）与反应温度（C）交互作用的等高线都相对平缓，说明两者的交互效应较弱；底物浓度（A）与蔗糖占比（B）的曲面坡度较蔗糖占比（B）与反应温度（C）的陡峭，说明底物浓度与蔗糖占比（AB）之间的交互作用比蔗糖占比与温度（BC）之间的交互作用要强。底物浓度（A）与反应温度（C）的等高线呈现椭圆趋势，表明此两因素对蜜二糖的产量有较强的影响，且曲面坡度较为陡峭，表明此两因素对蜜二糖的合成影响越显著。综合上述分析，两因素之间的交互作用对蜜二糖产量的影响大小为AC＞AB＞BC，与表3 中的结果一致。
2.5.3 响应面优化验证
由响应面的模型分析预测所得，合成蜜二糖的最佳条件为底物浓度600 g/L、蔗糖占比 33%、反应温度40 ℃，即蔗糖200 g/L、D-半乳糖400 g/L、酶液添加量为390 U/L，40 ℃反应24 h，预测的蜜二糖最高产量为35.773 g/L，在此条件下进行验证试验，得到蜜二糖最大产量为（34.20±0.92） g/L，与模型拟合率高达95.8%，故该模型具有实际参考应用价值。
3 结论
本试验从芒果源的肠膜明串珠菌中克隆了SPase基因，进行原核表达获得可溶性蛋白，纯化后测得比酶活为78 U/mg，最适的反应温度和pH 值分别为40 ℃和6.0。利用纯化后的酶液与蔗糖和D-半乳糖进行反应合成蜜二糖，通过单因素试验和响应面优化分析，获得合成蜜二糖的最优工艺配方为蔗糖200 g/L、D-半乳糖400 g/L、酶液添加量为390 U/L，反应温度为40 ℃，反应时间为24 h，在此条件下反应可获得功能性蜜二糖的产量高达（34.20±0.92） g/L。本研究利用蔗糖磷酸化酶的转糖苷能力合成蜜二糖，成功实现了利用廉价底物合成高值功能性低聚糖，建立了以成本低、易获取的蔗糖为底物的反应体系，为绿色高效合成蜜二糖提供了技术支持。
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