石榴(Punica granatum L.),石榴科石榴属灌木或乔木,又名安石榴、丹若等,主要分布在亚热带地区,在我国石榴主要产区有陕西临潼、新疆和田、云南蒙自、四川会理、山东峄城等[1]。石榴营养丰富,抗氧化能力强,具有调节血压、抗衰老、抗菌、抗癌等功效[2]。目前我国石榴主要以鲜食为主,对于石榴深加工产品的深入研究较少[1]。
顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)技术是一项样品前处理技术,具有样本需求量小、操作简便、灵敏度高等优点[3]。气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术是分析挥发性化合物最广泛的技术[4]。Heracles Ⅱ 快速气相电子鼻采用超快速气相色谱技术对挥发性化合物进行分离,同时具有传统电子鼻简单、高效、低成本等优点[5]。近年来,电子鼻和HS-SPMEGC-MS 技术联用,常被应用于食品中挥发性风味物质的检测,来区分不同原料种类、不同原料产地、不同生产工艺等的香气特征差异[4]。
目前国内外均有对于石榴酒的相关研究报道。Zhuang 等[6]对3 个品种石榴汁和石榴酒的抗氧化性进行研究,发现多酚类化合物含量与石榴汁和石榴酒的抗氧化能力呈正相关;Andreu-Sevilla 等[7]采用GC-MS分析石榴汁和石榴酒中的挥发性成分,发现石榴汁中萜烯类物质含量最高,发酵后石榴酒中辛酸乙酯含量最高。辛敏汉[8]对石榴酒的发酵工艺进行探究,确定石榴酒酿造最佳原料配比;李涛等[9]研究发现,新疆和田石榴酒中苯乙醇、2-壬醇、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十一酸乙酯为关键风味物质,并发现清汁发酵方式的感官品质最佳;唐柯等[10]分析红玛瑙石榴发酵不同时期香气成分变化,发现整个发酵过程酯类、醇类、酸类物质含量均较高,醛酮类、烷烃类化合物随着发酵的进行相对含量逐渐降低,且萜烯类化合物种类在发酵后明显增加。国外对石榴酒中抗氧化物质研究较多,国内主要集中在酿造工艺和香气成分分析。但对不同产地石榴原料酿造石榴酒以及酿酒石榴选择的相关研究较少,且鲜见采用电子鼻技术和GC-MS 联用分析鉴别石榴酒挥发性物质的相关报道。
由于遗传特性、环境因子和栽培措施等因素的影响,造成不同产地的石榴原料之间香气成分和品质的差异,酿酒原料的品质对酒的品质有较大影响。因此,区分不同产地石榴酒、分析各个产地石榴酒的香气特征,选择适合酿酒的石榴原料,酿造具有产区风味特色的石榴酒,对提升石榴酒酿造水平和石榴产业高质量发展具有重要意义。因此,本试验以新疆和田、陕西临潼、四川会理和云南蒙自4 个产地的石榴作为原料酿造石榴酒,采用HS-SPME-GC-MS 技术鉴定其挥发性成分,并结合Heracles Ⅱ快速气相电子鼻技术和主成分分析探究4 个产地石榴酒的挥发性成分差异,以期为选择适合的酿酒石榴、提高石榴酒整体品质以及石榴酒品质控制提供一定的参考依据。
陕西临潼净皮甜石榴、四川会理软籽石榴、云南蒙自绿籽石榴:市售;新疆和田千籽红甜石榴:策勒县和滇红酒业有限公司;CL 果胶酶(1 000 PGNU/g)、VL1酵母、焦亚硫酸钾:法国Laffort 公司;绵白糖:安琪酵母股份有限公司;2-辛醇(内标):上海泰坦科技股份有限公司;氯化钠(色谱纯):上海麦克林生化科技有限公司;苯乙醇、正庚醇、2-壬基醇、3-己烯-1-醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、辛酸、癸酸、4-萜烯醇、(+)-α-松油醇(标准品,纯度均≥99%):Sigma-Aldrich 公司。
气相色谱-质谱联用仪(TRACE 1310-ISQLT):美国Thermo Fisher 公司;石英毛细管色谱柱(DB-WAX,60 m×0.25 mm×0.25 μm):美国安捷伦公司;固相微萃取手柄、固相微萃取萃取头(75μmCAR/PDMS):美国Supelco 公司;高纯氢发生器(SGH-300):北京中科吉瑞科技有限公司;电子精密天平(FA204):天津天马衡基仪器有限公司;超级恒温水浴锅(SY-601):天津欧诺仪器股份有限公司;恒温磁力搅拌器(IT-09A5):北京信而泰科技股份有限公司;全自动空气源(SPB-3S):北京中惠普分析技术研究所;快速气相电子鼻(HeraclesⅡ):法国Alpha Mos 公司;螺杆式榨汁机(JYZ-E25):九阳股份有限公司; 医用冷藏冷冻箱(HYCD-282A):海尔电器股份有限公司;生化培养箱(HPX-250):上海跃进医疗器械有限公司。
1.3.1 石榴酒的酿造
本试验使用的石榴酒为天津农学院发酵工程实验室自制,其发酵工艺流程和操作要点参考李涛等[9]和吕真真等[11]的方法。
1.3.2 HS-SPME-GC-MS 测定挥发性风味物质
1.3.2.1 标准品处理
本试验采用外标法对HS-SPME-GC-MS 分析出的石榴酒关键香气化合物进行准确定量,标准品的处理方法采用Guo 等[12]的方法。
1.3.2.2 SPME 条件
SPME 条件参考文献[13],取8 mL 酒样于20 mL顶空进样瓶中,加入3 g 氯化钠和40 μL 2-辛醇内标物(11% 乙醇溶液,质量浓度50 mg/L),放置于恒温磁力搅拌器上。样品45 ℃平衡10 min,将萃取头深入样品瓶顶空部分;45 ℃下顶空吸附40 min 后拔出,插入GC进样口,在230 ℃解吸3 min。
1.3.2.3 GC 条件
GC 条件参考文献[13],DB-WAX 毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温:起始柱温35 ℃,保持3 min,以6 ℃/min 升温至150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min 升温至230 ℃,保持3 min;手动无分流进样;载气(He,纯度≥99.999%),流速1 mL/min;进样口温度230 ℃。
1.3.2.4 MS 条件
MS 条件参考文献[13],电子电离源;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;接口温度230 ℃;扫描质量m/z 20~550。
1.3.2.5 定性和定量分析
定性分析方法参考文献[14],通过从标准谱库(NIST 和Wiley)中检索定性、保留时间定性和保留指数(retention index,RI)定性,经GC-MS 检测C8~C30 正构烷烃混合标准品,并记录每个烷烃出峰的保留时间,采用公式(1)计算香气物质的保留指数。
式中:R 为香气物质的保留指数;n 和n+1 代表化合物碳原子数;Tx 代表化合物的保留时间,min;Tn和Tn+1 代表相应的正构烷烃的保留时间,min,且Tn>Tx>Tn+1。
定量分析方法参考文献[15]:采用内标半定量法,以2-辛醇为内标物,分析、计算石榴酒中各挥发性物质浓度。
式中:C1 为挥发性物质浓度,μg/L;C2 为内标质量浓度,mg/L;V1 为内标添加体积,mL;S1 为挥发性物质峰面积;S2 为内标物峰面积;V2 为萃取样品体积,mL。
1.3.3 特征挥发性风味物质分析
采用外标法建立物质标准曲线对GC-MS 结果进行定量分析并结合香气活度值(odor activity value,OAV),来确定样品中的特征性挥发性风味物质,无标标准品的化合物,则采用相似碳原子数、相同官能团的化合物标准品建立的标准曲线进行估算[16],本试验中无异辛酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯的标准品,故采用辛酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的标准曲线进行估算。根据公式(3)计算香气活度值。
式中:O 为香气物质的香气活度值;C 为某挥发性物质的质量浓度,μg/L;T 为该物质的感官阈值,μg/L。
1.3.4 快速气相电子鼻检测方法
电子鼻检测方法参考文献[17]采用快速气相电子鼻,测定石榴酒的香气成分。样品处理和进样方法:吸取5 mL 酒样于20 mL 顶空进样瓶中,40 ℃水浴平衡10 min;使用进样针手动进样,于顶空进样瓶中顶空抽取0.5 mL 气体,在9 s 内匀速推入进样口,每个样品做5 次平行测定。设置电子鼻试验参数:进样口温度200 ℃;进样口流量10.0 mL/min;捕集阱温度40.0 ℃;初始炉温50 ℃;以3 ℃/s 速率升温至250 ℃,升温时间21 s;数据采集时间110 s;数据采集周期0.01 s。
采用Microsoft office Excel 2019 和Origin2023b 对试验数据进行统计分析和绘图,采用快速气相电子鼻自带的AlphaSoft-多元统计进行主成分分析和判别因子分析。
石榴酒中挥发性成分分析结果见表1。
表1 石榴酒中挥发性成分的GC-MS 分析结果
Table 1 Volatile components in pomegranate wines analyzed by GC-MS
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31物质醇类正丙醇异丁醇异戊醇正己醇3-己烯-1-醇正庚醇2-壬基醇(S,S)-(+)-2,3-丁二醇3-甲硫基丙醇(Z)-5-癸烯-1-醇苯乙醇小计酯类乙酸乙酯丙酸乙酯异丁酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯乙酸异戊酯己酸乙酯乙酸己酯2-甲基丁酸 3-甲基丁酯乙酸叶醇酯庚酸乙酯乙酸庚酯辛酸乙酯异戊酸异戊酯乙酸辛酯7-辛酸乙酯壬酸乙酯辛酸异丁酯癸酸乙酯辛酸异戊酯苯甲酸乙酯乙基9-癸烯酸酯苯乙酸乙酯苯乙醇乙酸酯月桂酸乙酯羊脂酸异戊酯2-甲基-丙酸3-羟基-2,2,4-三甲基戊基酯己二酸二异丙酯10-十一烯酸乙酯十四酸乙酯保留时间/min 7.01 8.56 11.82 15.49 16.23 17.83 19.23 19.85 23.21 24.71 26.79 3.52 4.81 5.01 6.27 6.93 7.37 9.45 12.54 13.55 13.69 14.66 15.07 16.03 17.45 17.98 18.32 18.55 19.62 19.99 21.71 22.13 22.29 22.73 24.59 25.19 25.67 26.01 26.10 26.15 26.54 28.54 RI 1 036 1 088 1 203 1 348 1 378 1 449 1 513 1 533 1 712 1 789 1 910 882 949 958 1 011 1 034 1 049 1 120 1 231 1 270 1 275 1 313 1 330 1 370 1 431 1 456 1 471 1 481 1 532 1 550 1 635 1 656 1 665 1 687 1 783 1 816 1 843 1 863 1 868 1 871 1 894 2 047质量浓度/(μg/L)新疆和田1.35±0.50b 53.16±0.07a 493.37±28.56a 7.13±0.87a 3.06±1.20 1.76±0.74c 1.51±0.16b 9.22±0.07b-1.68±0.42 357.51±19.54a 929.75±52.13 93.30±8.58b-8.90±4.62a 1.22±0.22b 3.61±0.39b 14.49±2.60a 54.07±25.25ab 88.38±15.75b 3.38±3.33a 1.07±0.21 1.79±0.08--539.31±170.78a--1.28±0.00b--397.30±8.36a 8.98±4.23a 3.64±1.53b 71.54±2.58bc 4.76±0.93a 35.87±7.62a 138.01±17.4a 6.53±0.30a-2.61±0.35a-5.97±3.41a陕西临潼4.71±3.88ab 41.09±15.42a 382.18±66.84a 5.49±0.85b-2.55±1.37bc-7.45±0.06b--278.75±24.44b 722.22±126.28 75.63±0.20c 10.18±5.08ab 7.53±2.90a-2.99±0.06b 6.73±0.03bc 35.31±19.21b 90.52±6.09b 2.13±0.35a--2.42±1.27a-555.66±257.08a--1.94±0.68ab 1.10±0.45b-287.17±12.09b 5.56±3.16a 8.24±1.71a 97.00±20.99b 4.09±0.24a 18.10±3.34b 98.48±1.24b 3.02±0.00b-1.94±0.84a 6.50±3.29a 2.60±0.69ab四川会理8.39±3.27a 48.3±9.59a 402.41±72.45a 1.46±0.58c-6.28±0.62a-22.28±2.85a 4.08±0.48a-258.84±53.42b 752.04±143.26 118.67±9.62a 13.60±8.19ab-3.45±0.24a 7.48±3.76a 8.23±2.44b 126.69±43.82a 118.53±4.22a 3.01±0.93a--3.07±1.32a 4.21±0.00a 623.93±297.54a-2.01±0.21 2.24±0.64ab 2.47±0.94a 1.48±1.01 320.23±52.63b 8.86±6.21a 3.64±0.57b 156.92±28.45a-31.52±0.51a 134.34±17.72a 3.20±0.65b-2.13±1.14a 7.10±1.35a 4.63±0.96ab云南蒙自6.12±4.66ab 38.71±4.19a 450.46±206.05a 1.48±0.45c-3.78±0.58b 2.70±0.37a 27.11±6.49a 3.14±0.80b-364.44±7.56a 897.94±231.15 115.59±12.81a 22.96±16.43a 6.22±2.42a-5.96±0.72ab 4.56±0.45c 96.58±52.30ab 128.60±8.91a 1.89±0.02a--2.24±1.49a 1.35±0.69b 400.98±17.83a 1.73±0.75-2.74±0.21a--155.95±27.76c 4.02±0.08a 3.23±0.17b 56.78±5.53c-38.10±0.11a 58.06±4.77c 2.19±0.22c 1.52±0.00 2.54±1.56a 2.11±0.00b 1.92±0.94b阈值/(μg/L)--3 000 4 800-200 0.1-1 000-82 7 500-15 1 600 20 19 30 8 670----5---1 300-39-4-650 83-----
续表1 石榴酒中挥发性成分的GC-MS 分析结果
Continue table 1 Volatile components in pomegranate wines analyzed by GC-MS
注:-表示未检测到该物质;同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。
序号32 33 34 35 36 37 38 39 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 1 2 1物质肉桂酸乙酯己酸-2-苯乙酯棕榈酸乙酯9-十六碳烯酸乙酯辛酸苯乙酯反油酸乙酯亚油酸乙酯邻苯二甲酸二丁酯小计酸类醋酸异戊酸正己酸辛酸正壬酸癸酸9-癸烯酸顺式-10-十七烯酸小计萜烯类乙烯苯乙烯叶醇反式-α-佛手甘油烯石竹烯4-萜烯醇(+)-α-松油醇香茅醇金合欢醇法尼醇4-羟基苯乙烯小计醛酮类乙缩醛香叶基丙酮小计酚类4-乙基苯酚2,4-二叔丁基苯酚小计呋喃类2,3-二氢苯并呋喃小计总计保留时间/min 29.50 29.86 30.59 30.83 31.75 32.57 33.05 35.20 18.00 22.42 25.78 28.68 29.80 30.76 31.29 31.73 4.61 13.11 16.22 20.61 20.85 20.97 22.83 24.10 31.43 31.43 31.87 3.57 25.87 29.93 31.09 31.87 RI 2 136 2 173 2 253 2 279 2 388 2 478 2 527 2 706 1 456 1 671 1 849 2 060 2 167 2 271 2 333 2 386 953 1 253 1 378 1 580 1 592 1 597 1 692 1 758 2 350 2 350 2 402 886 1 855 2 179 2 309 2 402质量浓度/(μg/L)新疆和田3.88±0.53a-35.52±2.47a-1.06±0.23-2.34±1.12a-1 528.81±282.87 23.92±9.15a-26.09±2.92a 164.48±8.97a 1.54±0.00a 40.03±2.87a 8.73±0.20a-264.79±24.11 108.41±30.86a-----1.26±0.22a 1.14±0.14a 2.91±0.33a--113.72±31.55 30.17±1.78a-30.17±1.78--- --2 867.24±392.44陕西临潼5.26±1.66a-20.99±11.76a--2.31±1.58ab 2.09±1.12a 2.86±0.71 1 358.35±357.82 16.52±6.30ab-20.87±5.20a 123.53±24.24b 1.42±1.10a 32.33±2.74ab 10.63±5.60a-205.30±45.18--1.77±0.78---1.94±1.10a 1.26±0.25a 3.75±1.57a--8.72±3.70 13.01±0.49c 1.41±0.00 14.42±0.49-1.92±0.95 1.92±0.95--2 310.93±534.42四川会理5.19±0.63a-31.57±21.88a 2.54±0.42-3.73±1.62a--1 754.67±509.62--20.88±2.25a 122.09±23.92b 1.66±1.11a 21.15±4.76b 13.38±8.72a 1.15±0.00 180.31±40.76 1.29±0.61b 5.98±0.07a-3.43±0.44 1.90±0.02 2.72±0.49a 1.77±0.01a 1.28±0.64a 3.20±0.96a--21.58±3.24 14.23±0.01bc-14.23±0.01---1.40±0.40 1.40±0.40 2 724.23±697.29云南蒙自1.33±0.85b 1.87±0.25 13.19±4.86--3.20±0.78a--1 137.41±162.91 5.46±4.06bc 2.95±0.00 24.63±3.93a 123.74±2.97b 1.25±0.03a 27.23±7.83ab 11.92±7.76a-197.18±26.58-1.65±0.15b---1.19±0.29b 1.41±0.01a 1.40±0.48a-3.70±2.44 5.50±1.85 14.85±5.22 16.07±1.53b-16.07±1.53 1.30±0.14-1.30±0.14--2 264.75±427.53阈值/(μg/L)50-40.44 100--4-200 000-6 700 500 500 1 400-- --400--5 330 100--- -6 0-200-
如表1 所示,4 个产地石榴酒中共检出74 种挥发性成分,其中检出醇类11 种、酯类39 种、酸类8 种、萜烯类11 种、醛酮类2 种、酚类2 种和呋喃类物质1 种。4 个产地石榴酒中检测出共有物质34 种。新疆和田、陕西临潼、四川会理和云南蒙自4 个产地石榴酒中分别检测出47、48、53 种和52 种挥发性成分,总质量浓度分别为(2 867.24±392.44)、(2 310.93±534.42)、(2 724.23±697.29)μg/L 和(2 264.75±427.53)μg/L。
为更清晰地展示不同产地石榴酒中挥发性物质差异情况,采用韦恩图进行分析,结果见图1。
图1 4 个产地石榴酒中挥发性物质韦恩图
Fig.1 Venn diagram of volatile compounds in pomegranate wines from four origins
由图1 可知,4 个产地的石榴酒中共检测出74 种挥发性成分,其中共有成分有34 种,新疆和田石榴酒中特有成分5 种,陕西临潼石榴酒中特有成分4 种,四川会理石榴酒和云南蒙自石榴酒中特有成分均为7 种。
4 个产地石榴酒中各类挥发性物质浓度对比关系如图2 所示。
图2 石榴酒中各类挥发性物质总量对比
Fig.2 Comparison of total contents of various volatile components in pomegranate wines
由图2 可知,4 个产地的石榴酒中醇类、酯类和酸类物质含量较高,新疆和田石榴酒中萜烯类物质含量最高,4 个产地石榴酒中仅有四川会理石榴酒中检测出了呋喃类物质。在4 个产地石榴酒的挥发性成分构成中,醇类占比均超过28%,酯类占比均超过50%,这说明,醇类和酯类物质是构成石榴酒香气特征的主要成分,这与张卜升等[18]、李美萍等[19]研究结果一致。
2.1.1 石榴酒中醇类挥发性成分分析
酿酒酵母在生长代谢酒精发酵期间通过Ehrlich途径将氨基酸转化为醇类物质[20],醇类物质是构成果酒香气的重要组成部分[21],其在果酒中的浓度变化会对果酒产生积极或消极的影响,郝瑞颖等[22]和孙中贯等[23]研究表明当葡萄酒、果酒中醇类物质浓度低于3×105 μg/L 时可以使酒体更加圆润协调,增加酒体结构感。本试验中新疆和田石榴酒中挥发性醇类化合物浓度最高[(929.75±52.13) μg/L],其次是云南蒙自[(897.94±231.15) μg/L]和四川会理[(752.04±143.26) μg/L],陕西临潼中最低[(722.22±126.28)μg/L],含量远小于300 mg/L,4 款石榴酒中的醇类物质对酒体香气的形成均有积极作用。4 个产地石榴酒中检测出醇类物质11 种,共有7 种,分别为正丙醇、异丁醇、异戊醇、正己醇、正庚醇、(S,S)-(+)-2,3-丁二醇、苯乙醇。其中浓度最高的均为异戊醇,具有苹果白兰地的香气和辛辣味[13]。仅在新疆和田石榴酒中检测出3-己烯-1-醇且新疆和田石榴酒中正己醇浓度较其余3 种高,说明新疆和田石榴酒中的青香味更加浓郁。
2.1.2 石榴酒中酯类挥发性成分分析
酯类化合物的形成受果汁成分及发酵条件的影响,在果汁乙醇发酵时期,酯酶催化酰基Co 和乙醇合成脂肪酸乙酯,乙酰CoA 和醇类合成乙酸酯[24-25]。酯类对酒的香气构成有重要作用,酯类物质多具有浓郁的水果香气[26]。结合表1 和图2 可知,4 个产地石榴酒的挥发性成分中酯类物质质量浓度最高,新疆和田石 榴 酒(1 528.81±282.87)μg/L、陕 西 临 潼 石 榴 酒(1 358.35±357.82)μg/L、四川会理石榴酒(1 754.67±509.62)μg/L、云南蒙自石榴酒(1 137.41±162.91)μg/L。4 个产地的石榴酒中共检测出39 种酯类物质,共有19 种,其中脂肪酸乙酯占68.42% 是石榴酒香气的重要组成部分,包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯等。新疆和田石榴酒中共检测出26 种酯类,其中辛酸乙酯质量浓度[(539.31±170.78)μg/L]最高,且癸酸乙酯浓度[(397.30±8.36)μg/L]在4 个产地的酒中最高;四川会理石榴酒检测出29 种酯类,其中乙酸异物酯[(126.69±43.82)μg/L]、9-葵酸乙酯[(156.92±28.45)μg/L]和辛酸乙酯[(623.93±297.54)μg/L]含量在4 个产地的酒中均最高,呈香蕉和菠萝的香气,说明四川会理石榴酒果香更加浓郁复杂。陕西临潼和云南蒙自石榴酒均检测出28 种酯类,且质量浓度最高的均为辛酸乙酯[555.66±257.08、(400.98±17.83)μg/L]。
2.1.3 石榴酒中酸类挥发性成分分析
脂肪酸是发酵过程中酵母菌和乳酸菌生长代谢的副产物,可与醇类物质反应生成脂肪酸酯,给果酒带来愉快酯香。脂肪酸在低浓度时可以增加果酒香气的复杂性,挥发酸大于20 000 μg/L 时会产生刺激性酸味、腐败味,使酒体粗糙[27],本试验中新疆和田的石榴脂肪酸质量浓度最高[(264.79±24.11)μg/L],仍远小于20 000 μg/L。果酒中适量脂肪酸的存在可以抑制相应酯的水解[25],为果酒提供奶酪或奶油等风味。4 个产地石榴酒中共检测出8 种酸类物质,共有物质5 种(正己酸、辛酸、正壬酸、癸酸、9-癸烯酸)。此外,4 个产地的石榴酒中含量最高的均为辛酸,其浓度较低时,呈令人愉悦的脂肪香和果香。
2.1.4 石榴酒中萜烯类挥发性成分分析
萜烯类物质一般以糖苷的形式存在于果实中,李涛等[9]研究表明,萜烯类物质在石榴汁中含量最高,占挥发性成分总量的55.3%,如芳樟醇存在于石榴果实中,但在石榴酒中萜烯类物质含量较低。萜烯类物质有较低的香气阈值,这使其在浓度较低的情况下对果酒的香气形成也能有较大的贡献。4 个产地的石榴酒中共检测出11 种萜烯类物质,其中共有2 种,分别是(+)-α-松油醇和香茅醇。(+)-α-松油醇是柠檬烯的降解产物[13],具有果香和似紫丁香的木质花香,香茅醇可为石榴酒带来浓郁的玫瑰花香。
2.1.5 石榴酒中醛酮类挥发性成分分析
醛酮类物质一般由醇类物质氧化或还原生成,也有部分是糖的代谢产物,醛酮类物质是果酒重要的呈味物质[28],对果酒整体的香气起着重要的修饰作用[13]。4 个产地的石榴酒中,仅检测出了2 种醛酮类物质(乙缩醛、香叶基丙酮),乙缩醛在4 个产地的石榴酒中均可检测到,该物质赋予石榴酒浓郁的果香、醛香和青香;香叶基丙酮仅在陕西临潼石榴酒中检测到,为酒提供了玫瑰花香、果香、醛香。
2.1.6 石榴酒中酚类和呋喃类挥发性成分分析
酚类物质来源于石榴果实或乙醇发酵阶段酵母菌的代谢产物或酚酸水解产生[9]。苯酚类物质浓度高时体现出类似中草药的木质香气[29]。4 个产地的石榴酒中只有陕西临潼和云南蒙自石榴酒中检测出2 种酚类物质,分别为4-乙基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚,为石榴酒带来了强烈的木酚气味和石炭酸味。本试验中,只在四川会理石榴酒中检测到呋喃类物质2,3-二氢苯并呋喃。
本试验采用外标法对GC-MS 鉴定结果中感官阈值较小、相对含量较高的物质进行准确定量,并结合OAV 法来分析4 个产地石榴酒中挥发性成分的贡献大小。当OAV≥1 时,该香气可以被人感知到,属于主要成分;当OAV<1 时,该香气物质对石榴酒的整体香气起到重要的修饰和协调作用[30]。石榴酒中挥发性香气物质OAV 分析结果如表2 所示。
表2 石榴酒特征挥发性物质OAV 分析
Table 2 OAV analysis of characteristic volatile components in pomegranate wines
序号1234123456类别醇类酯类物质苯乙醇正庚醇2-壬基醇3-己烯-1-醇丁酸乙酯己酸乙酯辛酸乙酯癸酸乙酯乙酸异戊酯苯乙酸乙酯阈值[9,30](μg/L)82 200 0.1 40 20 853 9 30 650 OAV新疆和田5.16 0.05 25.07 0.03 0.15 11.54 327.94 11.30 3.00 0.03陕西临潼4.02 0.07--0.12 11.82 337.88 8.17 1.96 0.03四川会理3.73 0.16--0.31 15.48 379.40 9.11 7.04-云南蒙自5.26 0.10 44.64-0.25 16.79 243.83 4.44 5.37-香气特征甜花香、新鲜面包、玫瑰花油脂、辛辣,柑橘生水果、脂香、青香、瓜类绿色嫩叶菠萝酒曲、菠萝甜香、菠萝椰子、酯类香蕉蜂蜜香气类别[25]花香味脂肪味、刺激味、果香味植物味、脂肪味、果香味植物味果香味果香味果香味果香味、脂肪味果香味花香味、脂肪味
续表2 石榴酒特征挥发性物质OAV 分析
Continue table 2 OAV analysis of characteristic volatile components in pomegranate wines
注: -表示未检测到该物质。
序号781212类别酸类萜烯类物质月桂酸乙酯2-甲基丁酸乙酯辛酸癸酸4-萜烯醇(+)-α-松油醇阈值[9,30](μg/L)83 19 500 1400 5 330 OAV新疆和田1.70 0.66 1.00 0.02--陕西临潼1.21 0.30 0.75 0.01-0.03四川会理1.66 0.37 0.74 0.01 0.73 0.03云南蒙自0.72 0.21 0.75 0.01 0.31-香气特征花生、水果苹果皮、菠萝皮、未成熟李子皮果香热带油脂香木质、花紫丁香花香气类别[25]坚果味、果香味果香味、植物味果香味脂肪味木材味、花香味花香味
根据李涛等[9]、李娜娜等[30]提到的挥发性物质感觉阈值和已报道的物质特征描述,结合GC-MS,4 个产地石榴酒中共检测出8 种主要挥发性物质。由表2 可知,新疆和田产地石榴酒中检测出8 种主要物质,陕西临潼、四川会理、云南蒙自石榴酒中均检测出6 种主要物质。4 个产地石榴酒检测出共有主要物质5 种,包括苯乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯,乙酸异戊酯,说明该5 种物质是石榴酒中的主要呈味物质,辛酸乙酯在4 个产地石榴酒中OAV 均大于200,是构成石榴酒果香的最主要物质。月桂酸乙酯在新疆和田、陕西临潼、四川会理石榴酒中均有检出且OAV>1,赋予了石榴酒花生、坚果的香气。新疆和田石榴酒中主要物质有苯乙醇、2-壬基醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯,这与李涛等[9]研究结果一致。四川会理石榴酒中具有果香的主要风味物质OAV 总和较其余3 个产地的石榴酒最大,说明四川会理石榴酒的果香味更加浓郁。具有生青味(植物香)的2-壬基醇仅在新疆和田石榴酒和云南蒙自石榴酒中检出且OAV>20,该物质的OAV 在云南蒙自石榴酒中更大,说明云南蒙自石榴酒的生青味更浓,酒体香气更加清爽。因此,4 个产地石榴酒均具有较为明显的辨识度。
2.3.1 4 个产地石榴酒电子鼻雷达图对比分析
Heracles Ⅱ 快速气相电子鼻是气相色谱原理和电子鼻功能的集合,雷达图能够客观反映出气味响应值的大小和数量,根据气相色谱峰面积和出峰个数,制作3 个产地石榴酒的雷达图,结果如图3 所示。
图3 4 个产地石榴酒电子鼻雷达图
Fig.3 Electronic nose radar chart of pomegranate wines from four origins
由图3 可知,4 个不同产地石榴酒的雷达图有明显区别,说明电子鼻可以较好地区分出4 个产地的石榴酒。由图3 可以看出,采用快速气相电子鼻在4 个产地的石榴酒中检测出5 种共有的特征香气成分,这与2.2 中OAV 法分析结果一致。
2.3.2 快速气相电子鼻结合主成分分析和判别因子分析区分4 个产地石榴酒
4 个不同产地石榴酒的快速气相电子鼻主成分分析结果如图4 所示。
图4 4 个产地石榴酒的主成分分析
Fig.4 Principal component analysis of pomegranate wines from four origins
由图4 可知,主成分1 的贡献率为99.835%,主成分2 的贡献率为0.077 04%,二者累计的总贡献率为99.912%,大于95%,说明此图可以反映出4 个产地石榴酒中挥发性风味物质的主要特征和风味物质的整体性。4 个产地的石榴酒分别位于4 个象限内,且相互无交叉,说明快速气相电子鼻结合主成分分析法可以将4 个不同产地的石榴酒的挥发性风味物质完全区分开。同时,识别指数在80~100 时,可以表征样品之间的区分度大小,识别指数越大则数据所呈现的效果越好。本试验分析中识别指数为86,说明4 个产地石榴酒之间的区分为有效区分,且区分效果较好。图4 中可以看出,SAJ 与SCJ 之间的距离较近,说明4 个产地的石榴酒中,新疆和田石榴酒和陕西临潼石榴酒风味较为接近。
为进一步验证主成分分析结果,对4 个产地石榴酒快速气相电子鼻结果进行判别因子分析(discriminant factor analysis,DFA),结果如图5 所示。
图5 4 个产地石榴酒的判别因子分析
Fig.5 Discriminant factor analysis of pomegranate wines from four origins
由图5 可知,判别因子1 和判别因子2 的贡献率分别为77.369% 和17.852%,总贡献率为95.221%。判别因子分析,对于新疆和田石榴酒和陕西临潼石榴酒之间的分辨率小于主成分分析。但4 个产地的石榴酒之间无相互交叉,4 个产地的石榴酒均可被较好地区分,这与主成分分析结果一致。因此,通过快速气相电子鼻技术和主成分分析相结合,进一步验证了GC-MS分析的4 个不同产地石榴酒之间的气味特征的差异;此外,快速气相电子鼻技术可用于区分不同产区的石榴所酿造的石榴酒,为快速鉴别石榴酒的产地提供参考。
4 个产地石榴酒中共检出74 种挥发性成分,其中醇类11 种、酯类39 种、酸类8 种、萜烯类11 种、醛酮类2 种、酚类2 种和呋喃类物质1 种。4 个产地石榴酒香气质量浓度从高低为新疆和田[(2 867.24±392.44)μg/L]、四川会理[(2 724.23±697.29)μg/L]、陕西临潼[(2 310.93±534.42)μg/L]、云南蒙自(2 264.75±427.53)μg/L。
4 个产地石榴酒中共分析出8 种特征挥发性物质,可明显分辨出4 个产地石榴酒,其中共有的特征挥发性风味物质5 种(苯乙醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯)。新疆和田产地石榴酒中检测出47 种挥发性风味物质,其中关键风味物质7 种(苯乙醇、2-壬基醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯)。为了更准确地确定石榴酒中的特征香气物质,在后续研究中有必要收集其他产区的石榴和石榴酒以及不同品种石榴为原料酿造的石榴酒,采用外标法对石榴酒中的挥发性成分进行准确定量,进一步分析不同产地石榴原料和石榴酒的特征。
此外,快速气相电子鼻结合主成分分析,也可对4个产地的石榴酒进行有效区分,且与GC-MS 得出的结果基本一致。基于本研究,可以利用GC-MS 和快速气相电子鼻技术联用的方式对不同产地石榴酒挥发性风味物质进行综合评价和区分,这将为石榴酒品质控制和产区鉴别提供技术参考。
[1] 李浩然,张磊,李建贵,等.不同品种石榴加工特性及风味物质的比较研究[J].食品与发酵工业,2024,50(7):286-292.LI Haoran, ZHANG Lei, LI Jiangui, et al. Comparative study on processing characteristics and flavor substances of different varieties of pomegranate[J]. Food and Fermentation Industries, 2024,50(7):286-292.
[2] WANG D D, ÖZEN C, ABU-REIDAH I M, et al. Vasculoprotective effects of pomegranate (Punica granatum L.)[J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 544.
[3] 王洪乾, 寇亚平, 姚晨阳, 等. 基于HS-SPME-GC-MS 测定5 种蔷薇属植物花瓣挥发性成分[J]. 植物遗传资源学报, 2023, 24(6): 1626-1638.WANG Hongqian, KOU Yaping, YAO Chenyang, et al. Detection of volatile organic compounds in five rose petals based on headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2023, 24(6): 1626-1638.
[4] 周昀菲, 孙志强, 杜庆鑫, 等. 基于电子鼻和HS-SPME-GC-MS分析蒸汽爆破对杜仲嫩叶和成熟叶茶香气特征的影响[J]. 食品科学, 2024, 45 (1): 91-100.ZHOU Yunfei, SUN Zhiqiang, DU Qingxin, et al. Effect of steam explosion on the aroma characteristics of eucommia ulmoides tender and mature leaf tea based on electronic nose and HS-SPME-GCMS[J]. Food Science, 2024, 45 (1): 91-100.
[5] 高雅慧, 徐良, 董亚欣, 等. 基于Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻对不同加工方式牛奶的快速鉴别[J]. 食品工业科技, 2019, 40(14): 260-263, 269.GAO Yahui, XU Liang, DONG Yaxin, et al. Rapid identification of milks treated with different processing methods based on Heracles II ultra-fast gas phase electronic nose[J]. Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(14): 260-263, 269.
[6] ZHUANG H T, DU J H, WANG Y M. Antioxidant capacity changes of 3 cultivar Chinese pomegranate (Punica granatum L.)juices and corresponding wines[J]. Journal of Food Science, 2011,76(4):C606- C611.
[7] ANDREU-SEVILLA A J, MENA P, MARTÍ N, et al. Volatile composition and descriptive sensory analysis of pomegranate juice and wine[J]. Food Research International, 2013, 54(1): 246-254.
[8] 辛敏汉. 石榴酒发酵工艺及品质变化研究[D].新疆:石河子大学, 2023.XIN Minhan. Study on the fermentation process and quality changes of pomegranate wine[D]. Xinjiang: Shihezi University,2023.
[9] 李涛, 李昀哲, 冯翰杰, 等. 不同发酵工艺对石榴酒香气质量的影响[J]. 食品与发酵工业, 2023, 49(8): 137-147.LI Tao, LI Yunzhe, FENG Hanjie, et al. Effect of different fermentation processes on aroma quality of pomegranate wine[J]. Food and Fermentation Industries, 2023, 49(8): 137-147.
[10] 唐柯, 王茜, 周霞, 等. 石榴酒发酵过程中香气动态变化规律[J].食品与发酵工业, 2019, 45(6): 197-202, 214.TANG Ke, WANG Xi, ZHOU Xia, et al. Dynamic changes in aroma during pomegranate wine fermentation[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(6): 197-202, 214.
[11] 吕真真, 焦中高, 刘慧, 等. 不同制汁方式对石榴酒品质的影响[J]. 果树学报, 2020, 37(12): 1941-1952.LÜ Zhenzhen, JIAO Zhonggao, LIU Hui, et al. Effect of different juicing methods on quality of pomegranate wines[J]. Journal of Fruit Science, 2020, 37(12): 1941-1952.
[12] GUO Y Y, ZHANG Y C, YU R, et al. Changes in the aroma characteristics during the different processes of dry cabernet sauvignon wine production[J]. European Food Research and Technology,2022, 248(12): 3025-3036.
[13] 张彦聪, 李昀哲, 张军, 等. 柠檬椰汁复合果酒的工艺研究及香气特征分析[J]. 食品与发酵工业, 2021, 47(4): 173-181.ZHANG Yancong, LI Yunzhe, ZHANG Jun, et al. Fermentation optimization and aroma characteristic of lemon-coconut compound fruit wine[J]. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(4): 173-181.
[14] 马琦, 伯继芳, 冯莉, 等. GC-MS 结合电子鼻分析干燥方式对杏鲍菇挥发性风味成分的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(14): 276-282.MA Qi, BO Jifang, FENG Li, et al. Effect of drying method on volatile components of Pleurotus eryngii analyzed by combined use of GC-MS and electronic nose[J]. Food Science, 2019, 40(14): 276-282.
[15] 石禾云,杨豆豆,张娅,等. 普洱熟茶关键香气物质热释放规律分析[J]. 食品科学, 2023, 44(16): 243-250.SHI Heyun, YANG Doudou, ZHANG Ya, et al. Analysis of heat release of key aroma substances in Pu-erh ripe tea[J]. Food Science,2023, 44(16): 243-250.
[16] AN H M, OU X C, ZHANG Y B, et al. Study on the key volatile compounds and aroma quality of jasmine tea with different scenting technology[J]. Food Chemistry, 2022, 385: 132718.
[17] 巩文杰. 柿子酒酿造工艺及风味特征的研究[D].天津:天津农学院, 2023.GONG Wenjie. Study on the brewing process and flavor characteristics of persimmon wine[D]. Tianjin:Tianjin Agricultural University, 2023.
[18] 张卜升, 高杏, 闫昕, 等. 基于GC-IMS 技术分析石榴果酒酿制过程中挥发性风味成分的变化[J]. 食品与发酵工业, 2022, 48(7): 252-257.ZHANG Busheng, GAO Xing, YAN Xin, et al. Changes of volatile flavor components during brewing of pomegranate wine based on GC-IMS[J]. Food and Fermentation Industries, 2022, 48(7): 252-257.
[19] 李美萍, 苗潇潇, 张生万. HS-SPME-GC-MS 分析石榴酒中易挥发性成分[J].食品科学, 2014, 35(8): 263-268.LI Meiping, MIAO Xiaoxiao, ZHANG Shengwan. Analysis of volatile compounds in pomegranate wine by headspace solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Science, 2014, 35(8): 263-268.
[20] ROBINSON A L, BOSS P K, SOLOMON P S, et al. Origins of grape and wine aroma. part 1. Chemical components and viticultural impacts[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2014, 65(1):1-24.
[21] 张秀玲, 汲润, 李凤凤, 等. 发酵工艺对蓝靛果酒功能性及香气成分的影响[J]. 食品科学, 2022, 43(10): 189-198.ZHANG Xiuling, JI Run, LI Fengfeng, et al. Effects of fermentation processes on the functional and aroma components of Lonicera edulis wine[J]. Food Science, 2022, 43(10): 189-198.
[22] 郝瑞颖, 王肇悦, 张博润, 等. 葡萄酒中酿酒酵母产生的重要香气化合物及其代谢调控[J]. 中国食品学报, 2012, 12(11): 121-127.HAO Ruiying, WANG Zhaoyue, ZHANG Borun, et al. The metabolism regulation of important aromatic compounds produced by Saccharomyces cerevisiae in wine[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2012, 12(11): 121-127.
[23] 孙中贯, 刘琳, 王亚平, 等. 酿酒酵母高级醇代谢研究进展[J]. 生物工程学报, 2021, 37(2): 429-447.SUN Zhongguan, LIU Lin, WANG Yaping, et al. Higher alcohols metabolism by Saccharomyces cerevisiae: A mini review[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(2): 429-447.
[24] 马腾臻, 李颍, 张莉, 等. 油橄榄酒的酿造及香气成分分析[J]. 食品科学, 2014, 35(18): 161-166.MA Tengzhen, LI Ying, ZHANG Li, et al. Volatile compound analysis of Olea europaea L.wine[J]. Food Science, 2014, 35(18): 161-166.
[25] TUFARIELLO M, CAPONE S, SICILIANO P. Volatile components of negroamaro red wines produced in Apulian Salento Area[J]. Food Chemistry, 2012, 132(4): 2155-2164.
[26] SWIEGERS J H, PRETORIUS I S. Yeast modulation of wine flavor[M]//Advances in Applied Microbiology. Amsterdam: Elsevier,2005: 131-175.
[27] HU L L, LIU R, WANG X H, et al. The sensory quality improvement of citrus wine through co-fermentations with selected nonsaccharomyces yeast strains and Saccharomyces cerevisiae[J]. Microorganisms, 2020, 8(3): 323.
[28] 刘小雨, 李科, 韦广鑫, 等. 野木瓜果酒香气成分提取方法的比较[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(3): 189-195.LIU Xiaoyu, LI Ke, WEI Guangxin, et al. Comparison of methods extracting aroma compounds from Stauntonia chinensis wine[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(3): 189-195.
[29] 赵宁, 魏新元, 樊明涛, 等. SPME-GC-MS 结合电子鼻技术分析不同品种猕猴桃酒香气物质[J]. 食品科学, 2019, 40(22): 249-255.ZHAO Ning, WEI Xinyuan, FAN Mingtao, et al. Analysis of volatile components of kiwifruit wines made from different cultivars using solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry combined with electronic nose[J]. Food Science, 2019, 40(22): 249-255.
[30] 李娜娜, 束廷廷, 梁艳英, 等. 不同采收期对爱格丽葡萄酒及蒸馏酒香气成分的影响[J]. 食品科学, 2018, 39(2): 215-221.LI Nana, SHU Tingting, LIANG Yanying, et al. Effect of different harvest times on aroma components of ecolly wines and distillations[J]. Food Science, 2018, 39(2): 215-221.
Study on Volatile Components of Pomegranate Wines from Different Regions Based on HS-SPME-GC-MS and Rapid Gas-Phase Electronic Nose
李昀哲,陈瑞,蒋成,等. 基于HS-SPME-GC-MS 和快速气相电子鼻技术对不同产地石榴酒挥发性成分的研究[J]. 食品研究与开发,2024,45(16):159-169.
LI Yunzhe,CHEN Rui,JIANG Cheng,et al. Study on Volatile Components of Pomegranate Wines from Different Regions Based on HS-SPME-GC-MS and Rapid Gas-Phase Electronic Nose[J]. Food Research and Development,2024,45(16):159-169.