栀子别名黄栀子，属茜草科栀子属植物，是卫生部颁布的首批食药两用资源之一[1]。栀子中含有环烯醚萜类化合物、有机酸酯类和多糖等多种生物活性成分，具有清热解毒[2]、抗氧化[3]、抗菌消炎[4-5]、预防心血管系统疾病[6]、保护胃肠道[7]、提高认知功能[8]等功效。目前栀子产业仍以利用栀子果作为中药材予以制售为主，活性成分提取的工业化程度低，将其作为功能性食品在食品工业中的应用较少。因此，大力发展栀子精深加工技术是提高栀子资源利用率和附加值的重要途径。
栀子中含量较高的是环烯醚萜类化合物，栀子苷属环烯醚萜物质，又名京尼平苷，据记载，栀子苷的临床应用历史悠久[9]。作为栀子中活性最高的物质之一，栀子苷具抗炎镇痛[10-12]、保护心脑血管[13-14]、护肝[15-16]、抗癌[17-18]等药理作用。目前提取栀子苷的方法主要有浸渍法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、生物酶法等[19]。
变温压差膨化是一种干燥技术，结合真空冷冻干燥、热风干燥和微波真空干燥的优点，现多用于果蔬脆片和粉剂生产以及干燥技术中[20]。其原理是在一定温度下，瞬间降低膨化罐压力，物料内部的水分瞬间蒸发，从而使得物料膨胀，内部形成多孔、疏松的结构[21-22]。包秀婧等[23]发现变温压差膨化干燥能够提升秀珍菇的鲜味，试验后鲜味物质、香味物质中醛类、烯烃类和呋喃类化合物相对含量均有增加。目前，该技术的研究主要集中在果蔬，以栀子为原料进行变温压差膨化干燥的研究还未见报道。
本试验以栀子果为原料，利用变温压差膨化技术对栀子果进行处理，运用单因素方法探讨膨化温度、膨化压力、膨化时间、真空干燥温度和真空干燥时间5 个因素对栀子果中栀子苷提取率的影响，采用响应面试验确定变温压差膨化处理栀子苷提取的最佳工艺参数，以期为栀子活性成分的工业化生产提供一定的参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
栀子鲜果：浙江星光农业开发有限公司；栀子苷标准品（纯度＞98%）：合肥博美生物科技有限责任公司。
1.2 主要仪器与设备
ZGRVP 变温压差膨化设备：诸城市众工机械有限公司；WK-150A 超微粉碎机：潍坊市北方制药设备制造有限公司；FS-2000T 超声波处理器：上海生析超声仪器有限公司；DHG9240A 电热干燥箱：上海高致精密仪器有限公司；UV-1899PC-DS2 紫外分光光度计：北京美谱达仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品预处理及栀子苷提取流程
工艺流程：栀子果→低温热泵干燥→变温压差膨化→粉碎→超声辅助提取。
操作要点：将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，温度为45 ℃，处理24 h。将预干燥后的样品投入膨化罐中，于膨化温度70～110 ℃下处理1～5 min，使膨化压力达到0.1～0.5 MPa，然后泄压使真空干燥温度为55～95 ℃，维持50～90 min，取出膨化后的栀子果，粉碎后过40 目筛，超声辅助提取后测定栀子苷含量。
1.3.2 标准曲线的绘制
精确称取栀子苷标准品，用50%乙醇溶液溶解，配制成栀子苷系列标准品溶液5、10、20、25、40、50 μg/mL，在波长238 nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，栀子苷质量浓度 （μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程Y=19.238X+0.032，R2=0.999 5，在所测定的浓度范围内线性关系良好。
1.3.3 栀子苷提取率测定
栀子粉末（40 目）以1∶20 （g/mL）的料液比分散于50% 乙醇溶液中，20 ℃恒温超声（功率100 W、频率40 kHz）处理30 min，取滤液0.5 mL 用50% 乙醇溶液稀释定容至50 mL，于238 nm 处测定吸光度，根据栀子苷标准品的标准曲线计算栀子苷的含量，结果以3 次独立平行试验结果的平均值计算。栀子苷提取率的计算公式如下。
式中：X 为栀子苷提取率，%；C 为238 nm 下根据标准曲线计算出的栀子苷浓度，mg/L；V1 为提取液的体积，mL；V2 为稀释定容的体积，mL；V3 为吸取的提取液体积，mL；m 为栀子粉末质量，g。
1.3.4 单因素试验设计
精确称取250 g 低温热泵干燥处理后的栀子果，分别研究膨化温度（70、80、90、100、110 ℃）、膨化压力（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 MPa）、膨 化 时 间（1、2、3、4、5 min）、真空干燥温度（55、65、75、85、95 ℃）、真空干燥时间（50、60、70、80、90 min）对栀子苷提取率的影响，冷却温度42 ℃，每个水平进行3 次平行试验，结果取平均值。
1.3.5 响应面试验
以栀子苷提取率作为评价指标，通过单因素显著性分析进行影响因素降维优化，得到膨化温度（A）、真空干燥温度（B）、真空干燥时间（C）3 个主要影响因子，采用SAS 9.2 软件进行试验设计，响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平-1 0 1因素A 膨化温度/℃70 80 90 B 真空干燥温度/℃65 75 85 C 真空干燥时间/min 60 70 80
1.4 数据处理
采用SAS 9.2 和Origin 2021 软件进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 膨化温度对栀子苷提取率的影响
将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，45 ℃处理24 h，然后进行变温压差膨化干燥，调整膨化温度为变量，固定其他条件（膨化时间2 min、膨化压力0.3 MPa、真空干燥温度75 ℃、真空干燥时间70 min、冷却温度42 ℃），完成变温压差膨化工序，试验后栀子苷提取率测定结果见图1。
图1 膨化温度对栀子苷提取率的影响
Fig.1 Effect of puffing temperature on extraction yield of geniposide
由图1 可知，样品中栀子苷提取率随膨化温度的升高呈先增后降的变化趋势，当膨化温度为70～80 ℃时，栀子苷提取率随膨化温度的升高而增加，在80 ℃时栀子苷提取率达到最高，为10.458%。但当膨化温度上升到80～110 ℃时，栀子苷提取率转而下降，可能是因为膨化温度过高，使栀子苷失去活性从而导致提取率降低[24]。由单因素试验数据可知，膨化温度对栀子果中栀子苷提取率影响明显，最终选定膨化温度为70、80、90 ℃进行后续响应面试验。
2.1.2 膨化压力对栀子苷提取率的影响
将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，45 ℃处理24 h，然后进行变温压差膨化干燥，调整膨化压力为变量，固定其他条件（膨化温度80 ℃、膨化时间2 min、真空干燥温度75 ℃、真空干燥时间70 min、冷却温度42 ℃），完成变温压差膨化工序，试验后栀子苷提取率测定结果见图2。
图2 膨化压力对栀子苷提取率的影响
Fig.2 Effect of puffing pressure on extraction yield of geniposide
由图2 可知，随着膨化压力的增大，样品中栀子苷提取率呈现先上升后下降的趋势，膨化压力在0.1～0.2 MPa 内，栀子苷提取率变化不明显，在0.2～0.3 MPa内，随膨化压力的增大，栀子苷提取率上升，当膨化压力为0.3 MPa 时，栀子苷提取率达到最高，为9.949%，在0.3～0.5 MPa 内，栀子苷提取率呈现下降的趋势，这可能是因为膨化压力过高压迫栀子果细胞结构，另外杂质的溶出阻碍了栀子苷的释放。综上，膨化压力对栀子果中栀子苷提取率的影响不明显，最终选定最佳膨化压力为0.3 MPa。
2.1.3 膨化时间对栀子苷提取率的影响
将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，45 ℃处理24 h，然后进行变温压差膨化干燥，调整膨化时间为变量，固定其他条件（膨化温度80 ℃、膨化压力0.3 MPa、真空干燥温度75 ℃、真空干燥时间70 min、冷却温度42 ℃），完成变温压差膨化工序，试验后栀子苷提取率测定结果见图3。
图3 膨化时间对栀子苷提取率的影响
Fig.3 Effect of puffing time on extraction yield of geniposide
由图3 可知，膨化时间在1～2 min 时，栀子苷提取率呈现上升趋势，当膨化时间继续延长，在2～5 min时，栀子苷提取率出现下降的趋势，当膨化时间为2 min 时，栀子苷提取率达到最高，为9.481%。由此可知，膨化时间对栀子苷提取率的影响不明显，最终选定最佳膨化时间为2 min。
2.1.4 真空干燥温度对栀子苷提取率的影响
将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，45 ℃处理24 h，然后进行变温压差膨化干燥，调整真空干燥温度为变量，固定其他条件（膨化温度80 ℃、膨化时间2 min、膨化压力0.3 MPa、真空干燥时间70 min、冷却温度42 ℃），完成变温压差膨化工序，试验后栀子苷提取率测定结果见图4。
图4 真空干燥温度对栀子苷提取率的影响
Fig.4 Effect of vacuum drying temperature on extraction yield of geniposide
由图4 可知，当真空干燥温度在55～75 ℃时，栀子苷提取率随真空干燥温度的升高而提高，在75 ℃时栀子苷提取率达到最高，可达9.907%，在75～95 ℃时，栀子苷提取率逐渐下降，可能是真空干燥温度过高，栀子果内部组织结构被严重破坏，从而导致栀子苷提取率降低[25]。由试验结果可知，真空干燥温度对栀子苷提取率的影响明显，最终选定真空干燥温度65、75、85 ℃进行后续响应面试验。
2.1.5 真空干燥时间对栀子苷提取率的影响
将栀子鲜果首先进行低温热泵干燥处理，45 ℃处理24 h，然后进行变温压差膨化干燥，调整真空干燥时间为变量，固定其他条件（膨化温度80 ℃、膨化时间2 min、膨化压力0.3 MPa、真空干燥温度75 ℃、冷却温度42 ℃），完成变温压差膨化工序，试验后栀子苷提取率测定结果见图5。
图5 真空干燥时间对栀子苷提取率的影响
Fig.5 Effect of vacuum drying time on extraction yield of geniposide
由图5 可知，当真空干燥时间为50～70 min 时，栀子苷提取率随真空干燥时间的延长而升高，在70 min时栀子苷提取率达到最高，为9.949%，而在70～90 min时，栀子苷提取率整体下降，可能是过长的真空干燥时间会引起栀子果表面过热，使栀子苷的活性下降从而提取率降低[26]。由此可知，真空干燥时间对栀子苷提取率的影响明显，最终选定真空干燥时间为60、70、80 min 进行后续响应面试验。
2.2 响应面优化结果分析
在单因素试验结果基础上，选择膨化温度（A）、真空干燥温度（B）、真空干燥时间（C）3 个因素作为变量，以栀子苷提取率作为响应值进行响应面正交试验，采用SAS 9.2 软件进行数据分析处理，结果及试验设计见表2。
表2 试验设计及试验结果
Table 2 Experimental designs and results
处理1234567891 0 11 12 13 14 15 A 膨化温度-1-1 110000-11-11000 B 真空干燥温度-1 1-1 1-1-1 110000000 C 真空干燥时间0000-11-11-1-1 11000 Y 栀子苷提取率/%8.961 6.297 6.331 5.801 6.553 6.064 4.297 4.186 5.978 5.555 5.839 4.976 5.229 5.198 5.640
2.2.1 回归方程及其参数分析
响应面方差分析结果见表3，同时得到膨化温度（A）、真空干燥温度（B）、真空干燥时间（C）与栀子苷提取率（Y）之间的一元二次回归方程为Y=5.355 667-0.551 5A-0.916B-0.164 75C+0.901 917A2+0.533 5AB-0.11AC+0.589 917B2+0.094 5BC-0.670 583C2。剔除不显著项后，得到Y=5.355 667-0.551 5A-0.916B+0.901 917A2+0.533 5AB+0.589 917B2-0.670 583C2。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equations
注：*表示影响显著，p＜0.05；**表示影响极显著，p＜0.01。
变异来源线性二次项交互项误差回归残差总和ABCA2 B2 C2 AB AC BC线性二次项交互项模型失拟项随机误差总残差自由度1111111 1 1 5 3 3 3 9 3 2 5 1 4平方和2.433 218 6.712 448 0.217 14 3.003 521 1.284 929 1.660 364 1.138 489 0.048 4 0.035 721 0.657 139 9.362 807 6.264 696 1.222 61 16.850 11 0.535 391 0.121 749 0.657 139 17.507 25均方2.433 218 6.712 448 0.217 14 3.003 521 1.284 929 1.660 364 1.138 489 0.048 4 0.035 721 0.131 428 3.120 935 2.088 232 0.407 537 1.872 235 0.178 464 0.060 874 0.131 428 F 值18.513 72 51.073 26 1.652 165 22.853 01 9.776 691 12.633 28 8.662 465 0.368 263 0.271 792 23.746 38 15.888 81 3.100 84 14.245 34 2.931 671显著水平p 0.007 7 0.000 8 0.255 0 0.005 0 0.026 1 0.016 3 0.032 1 0.570 5 0.624 4 0.002 2 0.005 5 0.127 4 0.004 6 0.264 6显著性********* ******
由表3 可以看出，该工艺建立的回归模型p＜0.01，极显著。失拟项p=0.264 6（p＞0.05），不显著；模型决定系数R2= 96.25%，调整后R2=89.49%，说明该模型与实际试验拟合情况较好，故可以使用该回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析。一次项A、B 影响极显著，C 影响不显著，二次项A2 影响极显著，B2、C2 影响显著，交互项AB 的影响显著。由上述结果可以得出，各因素对栀子苷提取率的影响并不是简单的线性关系。
2.2.2 交互作用分析
由表3 可知，膨化温度与真空干燥温度的交互作用对栀子苷提取率有显著影响，其他变量之间的交互作用对栀子苷提取率影响不显著，此处只讨论膨化温度与真空干燥温度的交互作用对栀子苷提取率的影响。固定真空干燥时间于零水平，绘制膨化温度与真空干燥温度交互作用对栀子苷提取率影响的响应面和等高线图，如图6 所示。
图6 膨化温度和真空干燥温度交互作用对栀子苷提取率的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface diagrams and contour line plots for effects of puffing temperature and vacuum drying temperature on extraction yield of geniposide
由图6 可以看出，固定膨化温度不变时，随着真空干燥温度的降低，栀子苷提取率呈现先略有下降然后迅速升高的态势，其中升高的趋势远大于下降的趋势，呈广口开口向上的抛物线形式。而固定真空干燥温度不变时，随着真空干燥温度的降低，栀子苷提取率亦呈现先略有下降然后迅速上升的态势，其中上升的趋势也远大于下降的趋势，呈较前者广口略回缩的开口向上的抛物线形式。栀子苷提取率受膨化温度比真空干燥温度的影响更大。
2.2.3 岭脊分析
从膨化温度和真空干燥温度的响应面图呈现开口向上的鞍形无极值点结果可以看出，各响应因子之间对栀子苷提取率的影响并不是简单的线性关系，需进一步做岭脊分析来确定响应面试验的最佳处理。利用SAS 9.2 软件程序输出响应面岭脊分析结果见表4。
表4 响应面岭脊分析
Table 4 The ridge analysis of response surface
编码半径0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0响应值/%5.355 67 5.472 79 5.608 39 5.763 14 5.937 50 6.131 81 6.346 31 6.581 18 6.836 56 7.112 56 7.409 27标准误差0.209 31 0.208 66 0.206 78 0.203 89 0.200 34 0.196 68 0.193 66 0.192 26 0.193 62 0.198 95 0.209 30 A 0.000 00-0.054 93-0.116 58-0.183 41-0.254 18-0.327 95-0.404 04-0.481 92-0.561 21-0.641 62-0.722 93 B 0.000 00-0.082 71-0.161 34-0.236 14-0.307 60-0.376 21-0.442 42-0.506 62-0.569 13-0.630 21-0.690 08 C 0.000 00-0.011 92-0.019 45-0.024 46-0.027 88-0.030 25-0.031 88-0.032 96-0.033 63-0.033 99-0.034 10
由表4 可以看出，当编码半径为1.0 时响应值最大，此时栀子苷提取率为7.4092 7%，对应的膨化温度为72.770 7 ℃、真空干燥温度为68.099 2 ℃、真空干燥时间为69.659 0 min。考虑实际操作的方便，将低温压差膨化提取栀子苷的最佳工艺条件调整为膨化温度73 ℃、真空干燥温度68 ℃、真空干燥时间70 min。做验证试验，测得栀子苷提取率为（7.38±0.59）%。表明该模型合理可行，且实际可操作性高。
3 结论
研究膨化温度、膨化压力、膨化时间、真空干燥温度和真空干燥时间5 个因素对栀子果中栀子苷提取率的影响，采用响应面试验优化变温压差膨化预处理提取栀子苷的工艺条件。结果表明，回归方程的决定系数R2 为89.49%，方程拟合性好，试验误差小。得到的最佳提取工艺为膨化温度73 ℃、膨化压力0.3 MPa、膨化时间2 min、真空干燥温度68 ℃、真空干燥时间70 min，此条件下栀子苷提取率达（7.38±0.59）%。
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