肠道菌群通过营养代谢、信号分子和肠道屏障等途径在维护肺部健康方面起到重要作用[1]。饮食中缺乏膳食纤维会诱发肠道菌群失调[2]，肠道菌群失调与肺部疾病（哮喘、肺炎、肺纤维化和急性肺损伤等）密切相关[3]。膳食纤维是一类无法被机体消化酶分解的碳水化合物，随胃肠道蠕动到达结肠后，被肠道微生物发酵利用，起到调节肠道菌群和宿主代谢、增强肠道屏障等作用[4]。菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖和果胶等是典型的膳食纤维[5]。菊粉是由β（2→1）糖苷键连接而成的低聚果糖，广泛存在于菊芋、洋葱和大蒜等食物中，是饮食中膳食纤维的重要来源之一[6]。
肺纤维化是一种慢性、进行性和不可逆性的肺间质疾病，以肺泡上皮细胞损伤、肌成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积为病理学特征，也是多种肺部疾病的终端末期[7]。高膳食纤维摄入量与哮喘[8]、慢性阻塞性肺疾病[9] 和癌症[10] 的发病呈负相关。随着现代生活方式和饮食结构的改变，机体无法从日常饮食中获取足量的膳食纤维。近年来，肠道菌群与肺纤维化之间的关系也引起人们的普遍关注。研究表明，肠道菌群紊乱与肺纤维化显著相关，表现为肠道益生菌丰度降低、致病菌丰度增加[11-12]，恢复肠道菌群可改善肺纤维化小鼠肺部炎症损伤和氧化应激[13]。
单一膳食纤维对肺部和肠道菌群稳态的有益作用已被广泛研究并证实[4]，但关于复合膳食纤维的研究较少。复合膳食纤维比单一膳食纤维的组成、比例更复杂，因此有可能促进多种肠道益生菌增殖，更有利于肠道微生物群稳定[5]。本研究以肺纤维化小鼠为研究对象，探究菊粉或复合菊粉对小鼠炎症损伤和氧化应激的影响，并比较二者对肠道菌群的影响，以期为肺纤维化患者提供有效的膳食疗养方案。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（6 周龄、体质量16～18 g）：济南鹏悦实验动物繁殖中心；菊粉（聚合度2～60）、复合菊粉（菊粉70%、低聚木糖、聚葡萄糖、L-阿拉伯糖、低聚半乳糖及壳寡糖共30%）：中科益维莱健康科技（山东）有限公司；博来霉素：日本化药株式会社；戊巴比妥钠：北京岚泰化工科技有限公司；吡非尼酮：美国Med Chemexpress 生物科技公司；苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；天狼星红染色试剂盒、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验试剂盒、白介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附试验试剂盒、白介素-1 β（interleukin-1 β，IL-1 β） 酶联免疫吸附试验试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；饲料、垫料：江苏省协同医药生物工程有限责任公司。
1.2 主要仪器
YAN30012 雾化针：上海玉妍科学仪器有限公司；JA1003 电子天平：上海菁海仪器有限公司；Infinite M2000 酶标仪：瑞士Tecan 公司；Allegra 64R 高速冷冻离心机：德国Beckman coulter 公司；EG1160 包埋机、RM2235 切片机、ASP300 脱水机：德国Leica 公司；Olympus X50 显微镜：日本Olympus 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及肺纤维化小鼠造模
40 只小鼠适应1 周后，随机分为正常（NC）组、模型（MC）组、菊粉（IN）组、复合菊粉（CIN）组和吡非尼酮（PFD）组。除NC 组外，其余4 组小鼠气管内注射博来霉素溶液，具体操作：首先腹腔注射戊巴比妥钠（质量分数0.30%）0.30 mL 麻醉小鼠，后悬挂小鼠并拉出舌头暴露气管，雾化针吸取博来霉素溶液（5.00 mg/kg），针头进入气管并缓慢推出溶液，最后轻轻按压肺部，旋转小鼠以使溶液在肺部分布均匀[14]。雾化当天记为第1 天，各组小鼠分别灌胃不同试剂，如表1 所示。
表1 实验设计方案（n=8）
Table 1 Experimental design scheme （n=8）
组别正常（NC）组模型（MC）组菊粉（IN）组复合菊粉（CIN）组吡非尼酮（PFD）组灌胃试剂生理盐水生理盐水5.00 g/（kg·d） 菊粉5.00 g/（kg·d） 复合菊粉300.00 mg/（kg·d） 吡非尼酮
小鼠饲养于滨州医学院基础医学院，饲养环境为（25±2） ℃、相对湿度（55±10）%，光照/黑暗（12 h/12 h），自由饮水进食。实验经滨州医学院伦理审查：2022-206，实验共28 d。
1.3.2 肺纤维化小鼠粪便16S rRNA 测序
第28 天早晨，采集各组小鼠粪便，置于无菌冻存管中，于-80 ℃冰箱冻存，用于后续肠道菌群检测，引物合成及DNA 测序委托上海美吉生物有限公司进行。
1.3.3 肺纤维化小鼠肺系数计算、肺组织病理组织学观察及羟脯氨酸含量检测
实验结束后，称重小鼠，随后眼球取血、处死、解剖、摘取小鼠肺组织用生理盐水洗净、擦干并称重，肺系数（F，%）按照下式计算。
式中：m1 表示小鼠肺组织质量，g；m2 表示小鼠体质量，g。
肺组织称重完毕后，取左肺上叶用4% 的多聚甲醛固定，随后经脱水、透明、包埋等步骤后制成切片，用于HE 染色和天狼星红染色。取左肺下半部，按照试剂盒说明书测试肺组织HYP 含量（μg/mg 组织）。剩余肺组织于-80 ℃冰箱冻存，待测。
1.3.4 肺纤维化小鼠血浆和肺组织中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 含量测定
取1.3.4 步骤所得全血置于抗凝管中，静置30 min，在4 ℃、6 000 r/min 条件下离心10 min，取上层清液，按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书测定血浆中IL-1 β、IL-6 和TNF-α 含量。取1.3.4 步骤剩余肺组织和预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）以料液比1∶9 （g/mL）放入玻璃匀浆器中，手动上下研磨，随后在4 ℃、6 000 r/min 条件下离心10 min，取上层清液，按照试剂盒说明书测定血浆中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 含量。
1.3.5 肺纤维化小鼠肺组织氧化应激水平测定
取1.3.5 步骤所得肺组织研磨上清液，按照相关试剂盒说明书测定T-AOC、SOD 活性和MDA 水平。
1.4 统计学处理
数据分析与绘图采用Graphpad 8.0 软件进行，实验数据以平均值±标准差表示，组间差异采用Tukey 分析，p＜0.05 表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠肺部病理学、肺系数及羟脯氨酸的影响
各组小鼠炎性细胞浸润和纤维增生情况见图1。
图1 小鼠肺组织病理结果（100×）
Fig.1 Pathological findings of lung tissue of mice （100×）
由图1 可知，NC 组肺组织结构完整，无明显炎性细胞浸润和纤维增生；MC 组肺组织出现大量肌成纤维细胞和胶原纤维，肺泡结构基本不可见，出现片状融合的肺实质；IN 组和CIN 组气管周围出现炎性细胞灶和丝状纤维增生，大部分肺泡结构清晰可见，部分肺泡壁轻度增厚；PFD 组气管周围炎性细胞浸润明显并伴有纤维增生，部分肺泡壁轻度增宽。以上结果说明，博来霉素诱导了肺纤维化小鼠模型，菊粉、复合菊粉抑制了炎性细胞浸润和纤维增生，二者效果基本相当，吡非尼酮对缓解炎性浸润和控制纤维增生效果最明显。
当肺组织出现炎症和纤维增生时，肺系数会相应增大[15]。小鼠肺系数和羟脯氨酸含量如表2 所示。
表2 小鼠肺系数和羟脯氨酸含量
Table 2 Lung coefficient and hydroxyproline content of mice
注：与NC 组相比，*表示差异显著（p＜0.05）；与MC 组相比，#表示差异显著（p＜0.05），##表示差异极显著（p＜0.01）。
组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组肺系数/%0.95±0.30 1.18±0.33*0.89±0.15##1.03±0.11 1.01±0.28#HYP 含量/（μg/mg 组织）1.41±0.42 1.82±1.14 1.37±0.95 1.24±1.03 1.10±0.49
由表2 可知，与NC 组相比，MC 组肺系数显著增加（p＜0.05）；与MC 组相比，IN 组肺系数极显著下降（p＜0.01），PFD 组肺系数显著下降（p＜0.05），CIN 组降低12.71%。以上结果说明，博来霉素诱导使小鼠肺组织出现严重的炎症和纤维增生，菊粉、复合菊粉和吡非尼酮可以缓解小鼠以上情况。
羟脯氨酸是评估纤维增生程度的重要指标之一[15]。由表2 可知，与NC 组相比，MC 组HYP 含量增加29.08%；与MC 组相比，IN 组、CIN 组和PFD 组分别降低24.73%、31.87%和39.56%，各组间无显著性差异（p＞0.05）。以上结果说明，菊粉、复合菊粉和吡非尼酮干预可在一定程度上抑制纤维增生。
2.2 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠炎症损伤的影响
炎症因子水平过高，是肺纤维化的特点之一[7]。小鼠肺组织和血液中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 水平如表3 所示。
表3 小鼠肺组织和血液中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 水平
Table 3 Levels of TNF-α，IL-6，and IL-1 β in lung tissue and plasma of mice
注：与NC 组相比，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极显著（p＜0.01）；与MC 组相比，#表示差异显著（p＜0.05），##表示差异极显著（p＜0.01）。
部位肺组织血液组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组TNF-α 水平/（pg/mL）83.91±17.28 129.20±35.73*89.23±10.48#89.78±21.94#115.50±39.27 56.05±8.97 82.74±6.25**67.41±8.03#66.81±7.32##64.34±5.90##IL-6 水平/（pg/mL）4.59±3.22 8.76±2.86*4.57±1.83#3.03±0.92##4.73±3.01#8.46±2.93 17.00±5.82**10.61±4.11#8.80±3.26##10.65±2.36#IL-1 β 水平/（pg/mL）48.78±4.35 56.26±3.60*49.89±6.46 45.88±2.65##51.97±4.70 4.86±3.46 14.96±6.83**6.19±2.65##9.81±1.13 6.03±4.59##
由表3 可知，与NC 组相比，MC 组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 水平均显著上升（p＜0.05）；与MC组相比，IN 组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 水平分别降低30.94%、47.83%和11.32%，CIN 组小鼠肺组织中TNF-α 水平显著下降（p＜0.05）、IL-6、IL-1 β 水平极显著降低（p＜0.01），PFD 组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6 和IL-1 β 的水平分别降低10.60%、46.00% 和7.63%。与NC 组相比，MC 组小鼠血液中TNF-α、IL-6、IL-1 β 的水平均极显著上升（p＜0.01）；与MC 组相比，IN 组和PFD 组小鼠血液中TNF-α、IL-6 和IL-1 β的水平均显著下降（p＜0.05），CIN 组小鼠血液中TNFα、IL-6 和IL-1 β 的水平分别降低19.25%、48.23% 和34.43%。以上结果说明，博来霉素诱导使小鼠肺组织和血液出现炎症损伤，菊粉、复合菊粉及吡非尼酮均能改善炎症损伤，复合菊粉和菊粉效果基本相当。
2.3 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠氧化应激的影响
炎症损伤常伴随不同程度的氧化应激[16]。小鼠肺组织T-AOC、SOD 活性和MDA 水平如表4 所示。
表4 小鼠肺组织T-AOC、SOD 活性和MDA 水平
Table 4 T-AOC，SOD activity，and MDA levels in lung tissue of mice
注：与NC 组相比，*表示差异显著（p＜0.05）。
组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组T-AOC/（U/mg 蛋白）5.89±1.00 4.37±1.55 5.11±1.54 5.99±1.83 5.82±1.85 SOD 活性/（U/mg 蛋白）138.50±14.90 104.60±19.59*125.70±22.31 126.90±21.80 129.70±22.62 MDA 水平/（U/mg 蛋白）4.87±0.66 7.05±1.49*6.63±1.57 6.93±1.23 7.01±1.75
由表4 可知，与NC 组相比，MC 组小鼠肺组织中T-AOC 下降，SOD 活性显著下降（p＜0.05），MDA 水平显著增加（p＜0.05）；与MC 组相比，IN 组、CIN 组和PFD 组小鼠肺组织中T-AOC 下降，SOD 活性增加，MDA 水平下降，均无显著性差异。以上结果说明，博来霉素诱导使小鼠肺组织中出现氧化应激，菊粉、复合菊粉及吡非尼酮可在一定程度上改善氧化应激。
2.4 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠肠道菌群多样性的影响
韦恩图可直观展示各组间样本物种的相似性和重叠情况。小鼠肠道菌群韦恩图如图2 所示。
图2 小鼠肠道菌群韦恩图
Fig.2 Venn diagram of intestinal flora in mice
由图2 可知，5 组样本共检测出484 个操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），5 组样本共有的OTU 数目为385 个，NC 组、MC 组、IN 组、CIN 组和PFD 组各组OTU 数目分别为448、464、442、438、461，各组间OTU 数目变化不明显。
α 多样性是评估样本中肠道菌群丰富度和多样性的综合指标，常用的指数标准有Chao 1、ACE、Shannon和Simpson。Chao 1 指数、ACE 指数和Shannon 指数越高，表明群落的丰富度和多样性越高；Simpson 指数越大，说明群落多样性越低。小鼠肠道菌群α 多样性分析如表5 所示。
表5 小鼠肠道菌群α 多样性分析
Table 5 α Diversity analysis of intestinal flora in mice
组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组Chao 1 指数356.00±42.28 383.70±30.82 355.60±30.15 365.40±26.93 378.80±39.78 ACE 指数355.50±36.73 382.30±25.34 350.80±31.61 362.50±20.77 377.60±39.48 Shannon 指数3.57±0.76 3.53±0.45 3.49±0.46 3.50±0.43 3.32±0.51 Simpson 指数0.11±0.11 0.10±0.06 0.08±0.05 0.09±0.04 0.16±0.08
由表5 可知，各组间Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数均无明显差异，与韦恩图结果一致。β 多样性可评估不同样本间菌群组成的相似性或差异性，主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析是常用的两种分析方法。PCoA 如图3 所示，NMDS 分析如图4 所示。
图3 小鼠肠道菌群PCoA
Fig.3 PCoA of intestinal flora in mice
图4 小鼠肠道菌群NMDS 分析
Fig.4 NMDS analysis of intestinal flora in mice
由图3 可知，IN 组和CIN 组空间位置相对接近，且均与NC 组有明显差异；MC 组和PFD 组空间位置相对接近；NC 组空间位置与其余各组相对离散，以上结果说明IN 组和CIN 组的菌群组成更加相似相近，MC 组和PFD 组相似相近，NC 组与其余各组有一定差异。图4 NMDS 分析结果与图3 一致。
2.5 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠肠道菌群结构的影响
图5 为各组小鼠肠道菌群在门（Phylum）水平上的分布图。 表6 为Bacteroidota 和Firmicutes 相对丰度。
图5 门水平相对丰度
Fig.5 Relative abundance of phylum level
表6 Bacteroidota 和Firmicutes 相对丰度
Table 6 Relative abundance of Bacteroidota and Firmicutes
%
组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组Bacteroidota 相对丰度25.60±10.12 27.17±12.86 36.83±10.32 30.99±10.69 25.92±9.92 Firmicutes 相对丰度63.32±11.68 63.46±11.41 48.84±13.69 58.64±9.38 64.96±9.59
由图5 和表6 可知，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）是检测到的主要菌门。与NC 组相比，MC 组放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度增加；与MC 组相比，IN 组和CIN 组拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度增加，厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度降低，菊粉比复合菊粉效果明显，二者也增加了疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度。
图6 是各组小鼠肠道菌群在纲（Class）水平上的分布图。
图6 纲水平相对丰度
Fig.6 Relative abundance of class level
由图6 可知，与NC 组相比，博来霉素降低了芽孢杆菌纲（Bacilli）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）和弯曲杆菌纲（Campylobacteria）的相对丰度；与MC 组相比，菊粉和复合菊粉增加了以上菌纲和疣微菌纲（Verrucomicrobiae）的相对丰度。
图7 是各组小鼠肠道菌群在属（Genus）水平上的分布图。
图7 属水平相对丰度
Fig.7 Relative abundance of genus level
由图7 可知，与NC 组相比，MC 组norank_f__Muribaculaceae、瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibacterium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度增加、杜氏杆菌属（Dubosiella）和乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度减少；与MC 组相比，IN 组和CIN 组杜氏杆菌属（Dubosiella）、norank_f__Muribaculaceae 和阿克曼氏菌属（Akkermansia）的相对丰度增加，瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度减少，其中，菊粉干预增加双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度，复合菊粉则降低了双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度。
表7 为相对丰度占比前5 名的优势属：norank_f__Muribaculaceae、瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibacterium）、杜氏杆菌属（Dubosiella）、乳杆菌属（Lactobacillus）和unclassified_f__Lachnospiraceae。
表7 属水平相对丰度
Table 7 Relative abundance of genus level%
注：与NC 组相比，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极显著（p＜0.01）；与MC 组相比，#表示差异显著（p＜0.05）。
组别NC 组MC 组IN 组CIN 组PFD 组norank_f__Muribaculaceae 21.70±19.92 25.05±12.27 31.16±7.00 27.40±9.29 23.29±8.57 Ileibacterium 8.42±8.88 23.97±14.60**14.44±7.16 20.38±8.52 36.30±11.96#Dubosiella 7.63±6.42 4.85±2.34*18.74±8.25#13.09±5.50 5.36±2.01 Lactobacillus 23.15±23.67 4.61±4.48**2.55±1.20 2.30±1.72 4.49±5.31 unclassified_f__Lachnospiraceae 3.24±5.30 6.92±4.58 4.30±3.42 4.76±3.96 1.96±1.53
由表7 可知，菊粉、复合菊粉对优势属的影响有所差异，菊粉促进norank_f__Muribaculaceae 和杜氏杆菌属（Dubosiella）增殖能力优于复合菊粉，复合菊粉抑制瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibacterium）的生长能力强于菊粉，二者对乳杆菌属（Lactobacillus）的影响未见显著性差异。
3 讨论与结论
3.1 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠肺部病理学、肺系数及羟脯氨酸的影响
组织病理学可以直观表示肺部炎性细胞浸润和纤维增生情况。博来霉素能较好地复制肺纤维化病理学特征，如早期弥漫性肺泡炎和后期肺间质纤维增生、细胞外基质沉积，气管注射博来霉素溶液是建立肺纤维化模型的常用方法[14]。本研究中，NC 组肺组织清晰完整，无肺纤维化病理学表现。而MC 组肺泡结构基本消失不可见，同时出现片状融合的肺实质，符合肺纤维化病理学改变。IN 组和CIN 组大部分肺泡结构清晰可见、无大片纤维增生情况，气管周围出现部分炎性细胞灶和丝状纤维增生，这表明菊粉、复合菊粉和吡非尼酮可在一定程度上减轻肺泡上皮细胞损伤并控制纤维化。与IN 组和CIN 组类似，PFD 组气管周围也出现部分炎性细胞灶和丝状纤维增生。因为，炎症损伤导致血管通透性增加、炎性渗出增多和肺部胶原纤维沉积，所以肺纤维化小鼠肺湿重增加、肺系数变大[15]。羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，是判断肺纤维化程度的重要指标[15]。本研究中，菊粉、复合菊粉和吡非尼酮降低了肺系数和羟脯氨酸含量，表明IN 组和CIN组小鼠肺部炎性细胞浸润和纤维增生减轻，这与组织病理学的结果一致。吡非尼酮是治疗肺纤维化的一种吡啶酮类药物，具有缓解肺部炎症和控制胶原沉积的积极效果[17]，与PFD 组的结果一致。
3.2 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠炎症损伤和氧化应激的影响
肺纤维化患者通常表现出炎症因子水平过高和炎症通路异常活跃[18]。TNF-α、IL-6 和IL-1 β 是典型的炎症因子，可以趋化激活炎性细胞并放大肺部炎症，还可以促进成纤维细胞活化、加速细胞外基质沉积[7]。
研究表明，抑制炎症因子产生可以有效控制或延缓肺纤维化[13]。本研究中，MC 组小鼠肺组织TNF-α、IL-6 和IL-1 β 水平较NC 组显著增加，这与博来霉素损伤肺组织或肺泡上皮细胞凋亡有关[19]。血管随着气管逐级分支，最终形成毛细血管网分布在肺泡壁。MC组血液中炎症因子变化与肺部一致，均显著高于NC组，这与肺血管-肺泡屏障通透性增加有关[15]。菊粉、复合菊粉可以降低血液和肺部炎症因子水平，改善炎症损伤。研究表明，菊粉可以下调酒精性肝病小鼠肝脏中NF-κB 蛋白表达并降低血液中TNF-α 和IL-6 水平[20]；可以交替激活巨噬细胞，进而降低趋化因子CXCL1 水平、抑制气道中的中性粒细胞聚集，从而减轻流感病毒对小鼠肺组织的损伤[21]；还可以促进双歧杆菌和乳酸杆菌增殖抑制肠道内毒素脂多糖分泌，起到抗炎的作用[22]。因此，菊粉、复合菊粉可以通过抑制炎症因子产生和炎性细胞浸润来改善肺纤维化小鼠肺部炎症损伤，可能与促进肠道益生菌增殖有关。
自由基过度积累和内源性抗氧化酶过度消耗也是肺纤维化可能的发病机制之一[7]。在机体正常生理情况下，氧化和抗氧化系统既相互制约又相互依存，保持着微妙的平衡，当二者失衡并倾向于氧化时，则出现氧化应激。T-AOC 是评价机体抗氧化能力的重要指标；SOD 是最重要的抗氧化酶之一，可以有效清除自由基来减轻细胞脂质过氧化；MDA 是自由基攻击细胞膜脂的主要产物[16]。本研究中，与NC 组相比，MC 组TAOC 和SOD 活性降低，MDA 水平增加，表明肺纤维化小鼠肺部内源抗氧化能力过低，自由基大量产生，攻击并损伤细胞。这与博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型结果相一致[19]。菊粉、复合菊粉可在一定程度上缓解肺纤维化小鼠肺部氧化应激这与鲁政等[23]的研究结果一致。有关代谢综合征的研究也表明，补充菊粉可以降低患者血液中IL-6、超敏C 反应蛋白和MDA 水平，并提升内源性抗氧化能力[24]。以上结果表明，菊粉、复合菊粉可能是一种潜在的预防或控制肺纤维化的膳食纤维补充剂。
3.3 菊粉、复合菊粉对肺纤维化小鼠肠道菌群多样性和菌群结构的影响
稳定健康的肠道微环境是维持 “肠-肺”轴的关键因素[3]。Gong 等[11]研究表明，博来霉素诱导对肺纤维化小鼠肠道菌群丰富度和多样性没有显著影响，本研究MC 组α 多样性结果与之一致。也有研究表明，以胸腔放疗的方式构建肺纤维化模型，小鼠肠道菌群中Shannon 指数和ACE 指数会显著增加[13]。因此，不同的肺纤维化造模方式可能对α 多样性影响不一。菊粉、复合菊粉没有改变小鼠肠道微生物区系结构。β多样性结果分析显示，IN 组和CIN 组的空间位置相接近、肠道菌群的组成和分布更为相似，这可能与复合菊粉中含70%的菊粉有关。
肺纤维化小鼠与正常小鼠相比，肠道菌群表现为多样性和稳定性改变、益生菌丰度下降[11]，硅肺患者的调查也有类似发现[12]。在门水平上，菊粉、复合菊粉促进了厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和疣微菌门（Verrucomicrobia）增殖，这与王丽娟等[25]的研究结果相近。厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）中的某些益生菌有消化复杂碳水化合物的能力，疣微菌门（Verrucomicrobia）对肠道黏液层和肠屏障完整性有积极作用[3]。在膳食纤维缺乏的情况下，肠道菌群会将结肠分泌的黏液糖蛋白作为营养和能量来源，这会引起结肠黏液屏障损伤和黏膜病原体增加[26]。在纲水平上，菊粉、复合菊粉增加拟杆菌纲（Bacteroida）和芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度，二者是重要的肠道益生菌[3]。在属水平上，菊粉、复合菊粉可以促进杜氏杆菌属（Dubosiella）、norank_f__Muribaculaceae 和阿克曼氏菌属（Akkermansia）增殖，抑制瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibaterium）生长。杜氏杆菌属（Dubosiella）是丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）的新成员，在降解复杂碳水化合物方面有较大潜力[27] 。Muribaculaceae 是新确立的细菌属名，在降解复杂碳水化合物和维护宿主肠道稳态方面有重要作用，菊粉可以促进其增殖[22]；阿克曼氏菌属（Akkermansia）增殖在抑制炎症和调节代谢方面有较好表现[3]；瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibaterium）与促进肥胖和炎症因子（TNF-α 和IL-6）分泌有关[28]。以上结果表明，菊粉、复合菊粉可以抑制病原菌生长、促进益生菌增殖，对机体代谢和肠道健康有潜在的积极效果。
细菌基因组中的特定基因簇决定了细菌产生的碳水化合物酶种类，因此膳食纤维组成对肠道微生物群组成和代谢有很强的影响[4]。本研究中，菊粉、复合菊粉均可以增加拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度，其中，菊粉增殖拟杆菌门（Bacteroidota）的能力优于复合菊粉，而复合菊粉增殖厚壁菌门（Firmicutes）的能力优于菊粉，这提示菊粉、复合菊粉对菌群的影响可能不完全一致。本研究中，相对丰度排名前五的属水平分析也支持了以上猜测。其中，菊粉增殖norank_f__Muribaculaceae 和杜氏杆菌属（Dubosiella）的能力优于复合菊粉，复合菊粉降低瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibaterium）的能力强于菊粉。菊粉（聚合度为2～60）是一种低聚果糖混合物，长链菊粉（聚合度为23～25）优先刺激双歧杆菌（Bifidobacterium）生长，短链菊粉（聚合度为4～5）优先刺激拟杆菌（Bacteroides）增殖[22]。Ni 等[29]研究表明，小鼠饲喂复方膳食纤维（Fibersol-2、菊粉、低聚果糖、聚葡萄糖、β-葡聚糖、棉子糖和燕麦纤维）后，肠道中多种益生菌丰度明显增加，如杜氏杆菌属（Dubosiella）、Parasutterella、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、Muribaculum、Allobaculum 和双歧杆菌（Bifidobacterium）。Tomioka 等[30]研究表明，L-阿拉伯糖和蔗糖可以协同促进拟杆菌属（Bacteroides）增殖和肠道内乙酸、丙酸产生。以上研究说明，肠道菌群对不同聚合度菊粉的发酵利用有优先级，多种膳食纤维复配对肠道微生物群存在多样化的增殖作用或潜在的组合效果。因此，本研究中IN 组和CIN 组肠道菌群的结果不完全一致，可能与肠道微生物群对菊粉的利用顺序、复合菊粉刺激肠道菌群的种类及复合菊粉中膳食纤维的比例有关，需要进一步的实验来确定肠道菌群中被复合菊粉刺激的特定细菌菌株。
膳食纤维被肠道微生物群发酵利用的主要代谢产物是短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸等）。本研究中，菊粉和复合菊粉促进了与短链脂肪酸生产相关的肠道微生物，如杜氏杆菌属（Dubosiella）、norank_f__Muribaculaceae 和阿克曼氏菌属（Akkermansia）。短链脂肪酸可以通过抑制NF-κB 激活、活性氧产生、细胞凋亡和调节免疫等途径改善肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病、气道炎症和哮喘等[3]。本研究中，菊粉、复合菊粉对肺纤维化的改善途径可能与肠道菌群代谢产生短链脂肪酸有关，短链脂肪酸的种类和浓度需要进一步实验确定。菊粉和复合菊粉改善肺纤维化的作用途径见图8。
图8 菊粉和复合菊粉改善肺纤维化的作用途径
Fig.8 Approach of inulin and compound inulin to improving pulmonary fibrosis
综上所述，菊粉、复合菊粉可以改善肺纤维化小鼠炎症和氧化应激，同时促进益生菌杜氏杆菌属（Dubosiella）、norank_f__Muribaculaceae 和阿克曼氏菌属（Akkermansia）增殖，抑制病原菌瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibaterium）生长，作用机制可能与内源性短链脂肪酸含量增加有关。在门水平上，菊粉增殖拟杆菌门（Bacteroidota）的能力优于复合菊粉，而复合菊粉增殖厚壁菌门（Firmicutes）的能力优于菊粉；在属水平上，菊粉增殖norank_f__Muribaculaceae 和杜氏杆菌属（Dubosiella）的能力优于复合菊粉，复合菊粉降低瓦伦斯回肠杆菌属（Lleibaterium）的能力强于菊粉，这可能与肠道微生物群对膳食纤维的选择性利用有关。因此，高质量和多种来源的膳食纤维可能是基于微生物群饮食干预控制或预防肺纤维化的一种有效方案。
[1] JANDHYALA S M, TALUKDAR R, SUBRAMANYAM C, et al.Role of the normal gut microbiota[J]. World Journal of Gastroenterology, 2015, 21(29): 8787-8803.
[2] MAKKI K, DEEHAN E C, WALTER J, et al. The impact of dietary fiber on gut microbiota in host health and disease[J]. Cell Host &Microbe, 2018, 23(6): 705-715.
[3] DANG A T, MARSLAND B J. Microbes, metabolites, and the gutlung axis[J]. Mucosal Immunology, 2019, 12(4): 843-850.
[4] KOH A, DE VADDER F, KOVATCHEVA-DATCHARY P, et al.From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites[J]. Cell, 2016, 165(6): 1332-1345.
[5] YE S, SHAH B R, LI J, et al. A critical review on interplay between dietary fibers and gut microbiota[J]. Trends in Food Science& Technology, 2022, 124: 237-429.
[6] 李烜, 罗登林, 向进乐, 等. 菊粉的性质、功能及在食品中的应用进展[J]. 中国粮油学报, 2021, 36(4): 185-192.LI Xuan, LUO Denglin, XIANG Jinle, et al. Physicochemical properties, functions and applications of inulin in food: A review[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2021, 36(4):185-192.
[7] TODD N W, LUZINA I G, ATAMAS S P. Molecular and cellular mechanisms of pulmonary fibrosis[J]. Fibrogenesis & Tissue Repair, 2012, 5(1): 11.
[8] ANDRIANASOLO R M, HERCBERG S, KESSE-GUYOT E, et al.Association between dietary fibre intake and asthma (symptoms and control): Results from the French national e-cohort NutriNet-Santé[J]. The British Journal of Nutrition, 2019, 122(9): 1040-1051.
[9] SDONA E, GEORGAKOU A V, EKSTRÖM S, et al. Dietary fibre intake in relation to asthma, rhinitis and lung function impairmenta systematic review of observational studies[J]. Nutrients, 2021, 13(10): 3594.
[10] BRADBURY K E, APPLEBY P N, KEY T J. Fruit, vegetable, and fiber intake in relation to cancer risk: Findings from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2014, 100(Suppl 1): 394S-398S.
[11] GONG G C, SONG S R, SU J. Pulmonary fibrosis alters gut microbiota and associated metabolites in mice: An integrated 16S and metabolomics analysis[J]. Life Sciences, 2021, 264: 118616.
[12] ZHOU Y, CHEN L, SUN G F, et al. Alterations in the gut microbiota of patients with silica-induced pulmonary fibrosis[J]. Journal of Occupational Medicine and Toxicology, 2019, 14: 5.
[13] LI W J, LU L N, LIU B, et al. Effects of phycocyanin on pulmonary and gut microbiota in a radiation-induced pulmonary fibrosis model[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2020, 132: 110826.
[14] 燕苗苗, 赵亚昆, 王搏, 等. 博来霉素诱导大鼠与小鼠肺纤维化模型的评价[J]. 中国实验动物学报, 2023, 31(2): 179-186.YAN Miaomiao, ZHAO Yakun, WANG Bo, et al. Comparison and evaluation of different doses of bleomycin-induced pulmonary fibrosis models in mice and rats[J]. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica, 2023, 31(2): 179-186.
[15] 张兴, 刘鲁炯, 张艺宝, 等. 生地提取物对肺纤维化大鼠肺系数及肺组织HYP 的影响[J]. 世界中西医结合杂志, 2019, 14(9):1256-1259.ZHANG Xing, LIU Lujiong, ZHANG Yibao, et al. Effect of radix rehmanniae extract on pulmonary indexes and HYP of lung tissue in the rats with pulmonary fibrosis[J]. World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2019, 14(9): 1256-1259.
[16] LUSHCHAK V I. Free radicals, reactive oxygen species, oxidative stress and its classification[J]. Chemico-Biological Interactions,2014, 224: 164-175.
[17] INOMATA M, KAMIO K, AZUMA A, et al. Pirfenidone inhibits fibrocyte accumulation in the lungs in bleomycin-induced murine pulmonary fibrosis[J]. Respiratory Research, 2014, 15(1): 16.
[18] 姜福富, 覃纲, 李嘉燕, 等. 特发性肺纤维化急性加重期患者NLRP3 炎症小体、炎症因子、蛋白酶表达水平及其临床价值[J].中国老年学杂志, 2022, 42(20): 4974-4977.JIANG Fufu, QIN Gang, LI Jiayan, et al. Expression levels of inflammatory corpuscles, inflammatory factors and proteases of NLRP3 in patients with acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis and their clinical value[J]. Chinese Journal of Gerontology,2022, 42(20): 4974-4977.
[19] MOURATIS M A, AIDINIS V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin[J]. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 2011, 17(5): 355-361.
[20] 王振, 张晓霞, 杨小利, 等. 菊粉对酒精性肝病小鼠肝组织NFκB 及血浆炎症因子IL-6、TNF-α 的影响[J]. 宁夏医科大学学报,2019, 41(9): 877-881.WANG Zhen, ZHANG Xiaoxia, YANG Xiaoli, et al. Effect of inulin on NF-κB and plasma inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice with alcoholic liver disease[J]. Journal of Ningxia Medical University, 2019, 41(9): 877-881.
[21] TROMPETTE A, GOLLWITZER E S, PATTARONI C, et al. Dietary fiber confers protection against flu by shaping Ly6c- patrolling monocyte hematopoiesis and CD8+T cell metabolism[J]. Immunity, 2018, 48(5): 992-1005.e8.
[22] LI L L, WANG Y T, ZHU L M, et al. Inulin with different degrees of polymerization protects against diet-induced endotoxemia and inflammation in association with gut microbiota regulation in mice[J].Scientific Reports, 2020, 10(1): 978.
[23] 鲁政, 张静, 高兆兰, 等. 牛蒡菊糖和菊芋菊糖对酒精诱导大鼠慢性氧化损伤的防治作用[J]. 食品科学, 2010, 31(5): 270-273.LU Zheng, ZHANG Jing, GAO Zhaolan, et al. Protective effect of burdock inulin and Jerusalem artichoke inulin against chronic alcohol-induced oxidative injury in mice[J]. Food Science, 2010, 31(5):270-273.
[24] 李耀华, 谢萍, 何勤利, 等. 菊粉对代谢综合征患者炎症及氧化应激水平的影响[J]. 中国老年学杂志, 2018, 38(12): 2835-2837.LI Yaohua, XIE Ping, HE Qinli, et al. Effect of inulin on inflammation and oxidative stress in patients with metabolic syndrome[J].Chinese Journal of Gerontology, 2018, 38(12): 2835-2837.
[25] 王丽娟, 李一唯, 杨立波, 等. 菊粉对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化症的保护作用[J]. 现代食品科技, 2021, 37(10): 7-18.WANG Lijuan, LI Yiwei, YANG Libo, et al. Protective effects of inulin on atherosclerosis in ApoE-/-mice[J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(10): 7-18.
[26] DESAI M S, SEEKATZ A M, KOROPATKIN N M, et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility[J]. Cell, 2016, 167(5): 1339-1353.e21.
[27] COX L M, SOHN J, TYRRELL K L, et al. Description of two novel members of the family Erysipelotrichaceae: Ileibacterium valens gen. nov., sp. nov. and Dubosiella newyorkensis, gen. nov., sp. nov.,from the murine intestine, and emendation to the description of Faecalibaculum rodentium[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2017, 67(5): 1247-1254.
[28] LI X, YANG Li C, XU M, et al. Smilax china L. polyphenols alleviates obesity and inflammation by modulating gut microbiota in high fat/high sucrose diet-fed C57BL/6J mice[J]. Journal of Functional Foods, 2021, 77: 104332.
[29] NI Y H, ZHENG A Q, HU Y T, et al. Compound dietary fiber and high-grade protein diet improves glycemic control and ameliorates diabetes and its comorbidities through remodeling the gut microbiota in mice[J]. Frontiers in Nutrition, 2022, 9: 959703.
[30] TOMIOKA S, SEKI N, SUGIURA Y, et al. Cooperative action of gutmicrobiota-accessible carbohydrates improves host metabolic function[J]. Cell Reports, 2022, 40: 111087.