高脂血症是因生物体内脂质代谢或运转异常而发生的一种代谢紊乱疾病，主要特征是总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平下降[1-2]。近年来，随着人们生活方式的改变、生活水平的提高和运动量的减少，高脂血症的发病率逐年增加，已成为世界上最普遍的慢性疾病之一[3]，是多种疾病（如脂肪肝[4]、动脉粥样硬化[5]、冠心病[6]等）的诱发因素。因此，对高脂血症的预防及治疗不可忽视。目前临床广泛应用他汀类药物治疗高脂血症[7]，但由于西药具有一定副作用，长期服用可能会对机体产生一定损伤。
桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又名白桦茸，属担子菌门多孔菌科纤孔菌，是寄生于白桦、赤杨上的一种深褐色多孔药用真菌，广泛分布在俄罗斯、芬兰、日本以及我国小兴安岭、长白山地区[8]，具有降血脂、降血糖[9]、抗癌[10-11]、抗氧化[12]、抗炎[13]等生理活性。桦褐孔菌多糖作为桦褐孔菌主要活性成分之一，具有抗疲劳[14]、抗氧化[15]、降血糖[16]、抗肿瘤[17]等作用。多糖因其良好的生物相容性以及较小的毒副作用受到国内外研究者的广泛关注[18]，桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharides，IOP）因其多种生物活性和生理功能极具有开发与研究价值[19]。
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新兴学科，广泛应用于动物模型确证、药物筛选、药效及毒性评价和作用机制研究等方面[20]。随着各类分析技术发展，超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）因其较高的重现性，分辨率和灵敏度而被证实适合于代谢组学研究[21]。本研究旨在运用代谢组学技术，运用多元统计方法，筛选桦褐孔菌多糖在高脂血症大鼠肝脏中发挥降血脂作用的潜在的差异性标志物成分，确定桦褐孔菌多糖降血脂作用相关代谢通路，为桦褐孔菌的进一步应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验动物和材料
雄性SD 大鼠（体质量180～190 g，60 只）：长春亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物许可证编号为SCXK（吉）-2016-0003。
桦褐孔菌：江苏省苏薇微生物研究有限公司；TC、TG、LDL-C、HDL-C 试剂盒：南京建成生物工程研究所；甲醇、甲酸、乙腈、乙醇（均为色谱纯）：辽宁瑞泉试剂有限公司；洛伐他汀：武汉鼎信通药业有限公司。
1.1.2 仪器
Infinite M200 型酶标仪（TECAN）、M1324-M1324R型低温高速离心机：美国Eppendorf 公司；ACQUITY UPLC T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、U3000 BioRS型超高效液相色谱系统、高分辨率串联质谱仪Triple-TOF5600plus：上海爱博才思分析仪器贸易有限公司；LC-8080 型液相色谱-质谱联用仪：杭州谱育科技发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 桦褐孔菌多糖制备
参考文献[22]的方法，取桦褐孔菌，以料液比1∶30 （g/mL）加入蒸馏水，浸泡过夜。于 100 ℃提取 3 次，每次 3 h，浓缩提取液，加3 倍体积乙醇沉淀，静置过夜，4 000 r/min 离心5 min 后收集沉淀，依次用 95%乙醇溶液、无水乙醇洗涤，利用截留量为3 500 Da 的透析袋透析除去灰分，减压浓缩至小体积后冷冻干燥，得桦褐孔菌多糖。
1.2.2 实验动物分组及给药
雄性SD 大鼠48 只，饲养于标准环境，自由进食和饮水。适应性喂养1 周后，将大鼠随机分为6 组，即空白对照组（control group，NG）、模型组（model group，MG）、阳性药组[positive control drug group，PC，15 mg/（kg·d）]、桦褐孔菌多糖低剂量组[IOP-L，150 mg/（kg·d）]、中剂量组[IOPM，250 mg/（kg·d）]、高剂量组[IOP-H，450 mg/（kg·d）]，每组8 只。NG 组饲喂普通饲料，MG、PC、IOP-L、IOP-M、IOP-H 组饲喂高脂饲料。同时灌胃给药，PC 组给予洛伐他汀，IOP 组给予不同剂量桦褐孔菌多糖，NG 与MG组给予相同体积蒸馏水。持续高脂饮食及给药8 周。给药期间，每只大鼠每周测量体质量（body weight，BW）。
1.2.3 血清生化指标测定
给药8 周后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后经腹主动脉取血，3 000 r/min 离心10 min，取血清，参照试剂盒说明书的方法测定血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。解剖大鼠获取肝组织，将肝组织保存于-80 ℃，备用。
1.2.4 肝组织代谢物提取
采用有机试剂沉淀蛋白法对样本进行代谢物提取。用120 μL 预冷的50% 甲醇提取肝组织样品，涡旋1 min，在室温下孵育10 min，然后将提取混合物在-20 ℃下储存过夜。4 000×g 离心20 min，将上清液转移到新的96 孔板中进行液相色谱-质谱联用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC-MS）分析。
1.2.5 色谱条件
使用超高效液相色谱系统进行所有色谱分离。ACQUITY UPLC T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。柱温35 ℃。进样量4 μL。流动相为溶剂A（水，0.1%甲酸）和溶剂B（乙腈，0.1% 甲酸）。梯度洗脱条件为0～0.5 min，5%B；0.5～7 min，5%～100%B；7～8 min，100%B；8.0～8.1 min，100%～5%B；8.1～10.0 min，5%B。流速0.4 mL/min。
1.2.6 质谱条件
使用高分辨率串联质谱仪检测从柱中洗脱出来的代谢物。操作参数如下：离子喷雾电压5 000 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）；离子源气体I，气体II和帘气分别设置为0.413 7、0.413 7、0.206 8 MPa。TOF分子量范围为60～1 200 Da。
1.2.7 数据分析
利用XCMS 软件对获得的质谱数据进行了拾峰、峰分组、保留时间校正、第二峰分组以及同位素和加合物的注释等预处理。结合保留时间（retention-time，RT）和质荷比数据对每个离子进行鉴定。使用在线京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、代谢组研究必备数据库（human metabolome database，HMDB）数据库对代谢物进行注释，将样品的确切分子质量数据与数据库中的数据进行匹配。利用MetaX 对峰值数据的强度进行进一步的预处理。使用预处理后的数据集进行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及有监督的偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。
1.3 统计方法
结果均以平均值±标准差表示。使用SPSS 软件进行统计分析。以p＜0.05 表示具有显著统计学意义，p＜0.01 表示具有极显著统计学意义。
2 结果与分析
2.1 桦褐孔菌多糖对大鼠体质量的影响
图1 为大鼠体质量变化情况。
图1 IOP 对大鼠体质量的影响
Fig.1 Effect of IOP on body weight of rats
如图1 所示，给药前各组大鼠体质量相似，且各组大鼠体质量均持续增长。与NG 组相比，给药3 周后MG 组大鼠体质量增长趋势加快。PC 组大鼠与IOP组大鼠体质量增长趋势相似。
2.2 血清生化指标测定
图2 为桦褐孔菌多糖对高脂血症大鼠血清生化指标影响。
图2 IOP 对高脂血症大鼠血清生化指标的影响
Fig.2 Effect of IOP on serum biochemical indexes in rats
如图2 所示，与NG 组相比，MG 组大鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量极显著升高（p＜0.01），HDL-C 含量极显著降低（p＜0.01）。与MG 相比，PC 组大鼠及各剂量IOP 各剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量极显著降低（p＜0.01），HDL-C 含量极显著升高（p＜0.01）。
2.3 肝脏代谢组学结果
2.3.1 代谢组学分析方法稳定性考察
总离子流图能够宏观反映所有代谢物在液相色谱分离情况，如图3 所示。
图3 LC-MS 总离子流色谱图
Fig.3 LC-MS total ion flow chromatogram
由图3 可知，肝脏代谢谱的保留时间、峰高、峰面积均有差异，表明有差异代谢物。
2.3.2 肝脏代谢物轮廓分析
前期研究表明，IOP-H 组具有较好的调节血脂异常功效，因此，为进一步探索其降血脂机制，选取IOPH 组进行代谢组学研究。PCA 得分图如图4 所示，PLS-DA 得分图如图5 所示。
图4 MG 组与IOP 组的PCA 得分图
Fig.4 PCA score maps of MG group and IOP group
图5 MG 组与IOP 组的PLS-DA 得分图与置换检验图
Fig.5 PLS-DA score maps and replacement test maps of MG group and IOP group
由图4 可知，IOP 组与MG 组未明显分离，组内聚集程度较差。由图5 可知，正、负离子模式下IOP 组与MG 组明显聚集，且明显分离，说明IOP 组与MG 组的代谢信息有明显差异。置换检验结果表明，模型有效可靠，未发生过拟合。
在负离子、正离子模式中，将筛选到的潜在差异代谢物进行含量的可视化热图分析，如图6 所示。
图6 MG 组与IOP 组含量的可视化热图分析
Fig.6 Visual heat map analysis of MG group and IOP groups'content
由图6 可知，MG 组与IOP 组内源物质含量有显著差异，同时观察到负离子模式2 种内源性物质含量下降，50 种内源性物质含量上升；正离子模式3 种内源性物质含量下降，36 种内源性物质含量上升。
2.3.3 肝脏差异代谢物筛选
从MG 组和IOP 组大鼠肝组织中负离子模式筛选出9 种差异代谢物，结果见表1。正离子模式筛选出7 种差异代谢物，结果见表2。
表1 负离子模式差异代谢物
Table 1 Differential metabolites screened by negative ion mode
序号123456789代谢物1，2-二-（9Z，12Z，15Z-辛癸酰）-3-（半乳糖基-a-1-6-半乳糖-β-1）-甘油9，10，13-三羟基硬脂酸石胆酸-甘氨酸偶联物13，14-二氢前列腺素-1a 12，13-二羟基丙酮甘氨鹅脱氧胆酸甘胆酸去氧胆酸17-羟基柠檬酸质荷比952.596 0 331.248 1 432.310 7 357.263 9 313.238 0 448.305 6 464.300 5 391.284 2 293.211 5保留时间/min 2.814 7 3.112 4 3.722 6 3.005 6 3.156 8 3.182 6 2.812 1 3.126 2 4.054 8贡献度3.811 8 3.687 9 3.561 6 3.524 3 3.449 2 3.077 6 2.974 3 2.810 2 2.129 1概率值0.025 7 0.000 2 0.003 4 0.000 6 0.000 1 0.001 3 0.030 8 0.003 2 0.009 1倍数变化12.329 8 4.728 2 4.296 4 5.379 2 4.041 6 3.316 1 4.019 4 2.744 6 2.294 2
表2 正离子模式差异代谢物
Table 2 Differential metabolites screened by positive ion mode
序号1234567代谢物甘油1-丙酸二乙酸酯亚油酸二十二碳五烯酸核黄素胆固醇硫酸酯石胆酰牛磺酸特非那定质荷比250.128 1 281.247 3 331.263 2 377.145 0 467.318 9 506.289 7 510.278 4保留时间/min 0.997 6 4.373 2 6.861 5 2.302 7 2.811 0 3.492 9 2.799 6贡献值2.639 3 2.324 2 2.385 3 3.008 3 3.082 3 2.621 3 2.866 5概率值0.008 3 0.003 6 0.009 4 0.000 2 0.015 8 0.004 8 0.015 3倍数变化2.004 8 2.224 2 3.914 1 0.343 2 3.792 0 2.417 3 3.091 5
2.3.4 代谢通路分析
为探索桦褐孔菌多糖干预高脂血症大鼠后可能涉及到的代谢通路，将上述表格中的潜在生物标志物带入MetaboAnalyst 5.0 进行分析，结果见图7。
图7 潜在的生物标志物的相关代谢通路
Fig.7 Metabolic pathways associated with potential biomarkers
由图7 可知，存在4 条由高脂饮食诱导的大鼠代谢紊乱可能涉及到的代谢通路，分别为核黄素代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成以及初级胆汁酸生物合成。
3 讨论与结论
本研究利用高脂饮食建立高脂血症大鼠模型，桦褐孔菌多糖干预治疗8 周后，与MG 组相比，IOP 组大鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量极显著下降，HDL-C 含量极显著升高，表明桦褐孔菌多糖对高脂血症大鼠血脂异常具有显著的调节作用。通过对高血脂大鼠进行肝脏代谢组学分析，鉴定出16 个潜在生物标志物，主要涉及核黄素、亚油酸、脂肪酸、胆汁酸等及其代谢产物。代谢途径分析表明，桦褐孔菌多糖通过影响核黄素代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成以及初级胆汁酸生物合成起到调节血脂异常的作用。
核黄素（riboflavin）是维持身体健康的重要的代谢物，是黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的重要前体物质[23]。血清载脂蛋白B 是一种密度较低脂蛋白，能够在动脉粥样硬化形成过程中促进TC 在动脉内膜内部出现沉积[24]。Bian 等[25]研究结果显示，核黄素缺乏大鼠载脂蛋白B100 的mRNA 和蛋白表达均显著降低，表明核黄素可能通过减少载脂蛋白B100的合成影响脂质代谢。在本实验中，给予桦褐孔菌多糖下调核黄素水平，提示其可能通过核黄素代谢途径调节高脂血症大鼠血脂异常。
亚油酸（linoleic acid，LA）为多不饱和脂肪酸，其同分异构体共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）具有免疫调节、抑癌、调节血脂异常等作用[26]。脂肪酸根据其饱和性可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），PUFA根据双键位置分为ω-3 脂肪酸、ω-6 脂肪酸[27]。ω-3 脂肪酸、ω-6 脂肪酸能诱导过氧化物酶增殖体激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARα）RNA 转录，从而促进脂肪酸氧化，通过抑制肝组织固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol reg-ulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）转录因子的表达，减少机体脂肪合成[28]。本研究中的亚油酸、17-羟基亚麻酸、13，14-二氢前列腺素-1a、二十二碳五烯酸、9，10，13-三羟基硬脂酸在桦褐孔菌多糖干预后含量均上调，表明其降血脂作用机制可能与生物体内亚油酸代谢、脂肪酸生物合成有关。
胆汁酸是胆固醇在体内清除的重要形式[29]，在维持胆固醇稳态、防止TG 堆积起重要作用，还可促进肠道对脂质和脂溶性营养物质的吸收[30]。胆汁酸在改善血脂代谢方面起重要作用，Chen 等[31]研究表明，高脂饮食诱导的高脂血症动物模型体内存在胆汁酸生物合成异常，胆汁酸合成的关键限速酶CYP7A1 显著下调。本实验结果表明，桦褐孔菌多糖可通过调节胆汁酸生物合成过程中脱氧胆酸、甘氨胆酸、鹅去氧胆酸水平来影响，对高脂血症大鼠血脂水平起到调节作用。
综上所述，高脂饮食造成的高脂血症大鼠存在脂质代谢紊乱，桦褐孔菌多糖可以改善高脂血症大鼠的脂代谢异常。代谢组学结果提示：桦褐孔菌多糖可调节高脂血症大鼠肝脏内亚油酸、17-羟基亚麻酸、脱氧胆酸等含量，通过核黄素代谢、亚油酸代谢、脂肪酸生物合成以及胆汁酸生物合成途径起到降血脂作用。
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