草莓（Fragaria ananassa Duch.） 为蔷薇科草莓属多年生草本植物，鲜美多汁，含有丰富的维生素、矿物质、胡萝卜素、花青素等营养物质，有“水果皇后”的美名[1]。草莓没有坚硬的外皮，组织柔嫩，且含水量高达90%～95%，采后呼吸强度大，极易失水皱缩。果实在采摘和运输销售环节中很容易受到机械损伤和微生物侵染而造成劣变[2]，在常温下放置1～2 d 就会失去食用价值和加工品质[3]。目前保鲜技术主要包括使用杀菌剂、食用涂膜、气调贮藏、臭氧、辐照、超声以及热处理等[4-8]。上述方法工艺复杂，往往会产生毒害作用，能用于商品化的有效保鲜技术较少[9]。因此开发一种方便、安全、有效的防腐剂是草莓保鲜的研究热点。
抗菌肽是抵抗外源病原微生物的天然免疫小分子多肽，存在于多种生物体内[10]，被称为“天然的抗生素”，对各种细菌和真菌有抑制作用[11]，但其抗菌机理与传统抗生素有差异[12-13]，具有结构多样性、不易产生耐药性[14]、抗菌能力强、安全无毒副作用[15]、不易被蛋白酶水解等特点[16]。目前，抗菌肽已被广泛应用于食品保鲜、医学、保健品等领域。
在前期研究中，经由复合酶酶解的水产蛋白抗菌肽[海蟹源抗菌肽（crab antibacterial peptide，CAP）、牡蛎源抗菌肽（oyster antibacterial peptide，OAP）、带鱼源抗菌肽（hairtail antibacterial peptide，HAP）和鲣鱼源抗菌肽（bonito antibacterial peptide，BAP）]均具有广谱的抑菌活性，能够同时抑制革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌[17-18]。其中CAP、HAP 和BAP 对革兰氏阴性菌抑制效果明显，OAP 对革兰氏阳性菌抑制效果明显。根据抗菌效力对比试验结果可知，4 类水产蛋白抗菌肽均具有较佳的抗菌活性。常见的致腐菌有霉菌、假单胞菌属等，致病菌有大肠杆菌、李斯特菌等[19]，针对此类致病、致腐菌类进行有效地抑制，可以降低产品腐烂变质的风险、提高产品附加值，具有潜在的应用前景。
本试验以草莓为研究对象，通过分析海蟹源抗菌肽（CAP）、牡蛎源抗菌肽（OAP）、带鱼源抗菌肽（HAP）和鲣鱼源抗菌肽（BAP）对大肠杆菌和荧光假单孢菌生长曲线的影响并测定其最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）与最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），同时对草莓中细菌总数、总酸含量、腐烂率、维生素C 含量等指标进行测定，考察4 种水产蛋白抗菌肽的保鲜效果，以期为水果保鲜提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海蟹源抗菌肽（CAP）冻干粉、牡蛎源抗菌肽（OAP）冻干粉、带鱼源抗菌肽（HAP）冻干粉、鲣鱼源抗菌肽（BAP）冻干粉：舟山市常青海洋食品有限公司；新鲜草莓[大小均匀，单果（15±2） g]：市售，购买后立即运往舟山市常青海洋食品有限公司研发实验室，初步挑拣去除具有明显机械损伤的果实后用保鲜袋密封，于4 ℃下保存备用；大肠杆菌（B98002）、荧光假单孢菌（ATCC35858）：宁波明舟生物科技有限公司；氯化钠、氯化钾、氧化镁、三氯化铁、氯化镁、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（试剂纯）：化浪（浙江）科技有限公司。以上试剂除特殊说明外均为分析纯。
1.2 仪器及设备
BT-136 智能生化培养箱：上海比朗仪器制造有限公司；K9840 自动凯氏定氮仪：海能未来技术集团股份有限公司；TG16KR 多功能离心机：上海继谱电子科技有限公司；DK-S24 电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；BBS-V800 单人双面净化工作台：山东博科生物产业有限公司；SHA-C 水浴恒温振荡器：常州梅香仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发仪：杭州庚雨仪器有限公司；AD200L-H 高速分散均质机：苏州江东精密仪器有限公司；TS-80C 恒温摇床：上海天呈仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种的活化培养
将大肠杆菌与荧光假单胞菌从密封的存样管中转移出来，分别接种至100 mL LB 液体培养基中，接种后的培养基置于摇床振荡培养24 h 后，用移液枪准确吸取2 mL 至LB 培养基中预培养菌种，让菌种成倍扩增，达到使用要求。预培养的菌种置于4 ℃冰箱内低温保存备用。
1.3.2 水产抗菌肽抑菌标准曲线制作
分别培养大肠杆菌、荧光假单胞菌至其对数期，用添加含0.5 mg/mL 抗菌肽的营养培养基稀释至每毫升105 个菌体进行接种培养，并设置不含抗菌肽的对照组，两组均置于130 r/min 摇床于37 ℃下振荡培养46 h，期间每2 h 将培养的菌液取样5 mL，3 000 r/min离心10 min 后，用无菌水定容至10 mL，以悬菌液OD560 nm 制作该菌样的标准曲线。
1.3.3 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定
按照二倍稀释法，用无菌水将抗菌肽冻干粉进行溶解并稀释为6 个倍比浓度，以20 μL 大肠杆菌和50 μL 荧光假单孢菌接入营养培养基，采用牛津杯法制作琼脂平板，再将接种好不同菌落的营养培养基倒入琼脂平板，各牛津杯孔内分别注射200 μL 稀释好的对应抗菌肽溶液，做好标记，培养12 h 观察抑菌圈的直径（mm），并根据记录的结果调整抗菌肽溶液浓度，直至观察到产生抑菌效果的最低抗菌肽浓度即为抗菌肽的最小抑菌浓度（MIC），将高于MIC 的培养基继续培养观察36 h，以抑菌圈内能够继续保持无细菌生长的最低浓度为抗菌肽最小杀菌浓度（MBC）。
1.3.4 抗菌肽对草莓保鲜效果的评价
将挑拣分装好的草莓鲜果在2 g/mL 的抗菌肽水溶液中浸渍1 min，使溶液均匀覆盖在果实表面后马上捞出，在铺有软质纱布的沥水网兜中自然沥干表面水分，沥干后和未经处理的对照组一起置于不同的塑料托盘内（每盘50 果），用保鲜膜进行密封形成内环境，之后置于10 ℃冷藏库中冷藏5 d，期间每天对草莓的相关指标进行检测，评价草莓的保鲜效果。
1.3.4.1 细菌总数
细菌总数参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[20]中的方法进行测定。
1.3.4.2 总酸含量
总酸含量参考GB 12456—2021 《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[21]中的方法进行测定。
1.3.4.3 腐烂率
草莓腐烂率按照腐烂面积，将草莓的腐烂等级划分为4 级，1 级：受试样本新鲜、完整，无可见腐烂组织；2 级：受试样本存在轻度腐烂，且腐烂面积小于10%；3 级：受试样本存在中度腐烂，且腐烂面积占10%～30%；4 级：受试样本存在严重腐烂，且腐烂面积大于30%。
腐烂率（F，%）计算公式如下。
式中：A1 为腐烂级别；B1 为此级别样品数；A2 为最高腐烂级别；B2 为受检样品数。
1.3.4.4 维生素C 含量
维生素C 含量参考GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》[22]中的方法进行测定。
1.4 数据处理
所有样品测定进行3 次平行试验，用Excel 进行试验数据处理，SPSS 18.0 进行统计分析，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 抗菌肽对常见微生物的抑制效果
2.1.1 抑菌标准曲线
抗菌肽的抑菌标准曲线是以微生物的生长曲线为对照，分析微生物在相应抑菌剂作用下的迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期变化，从而对比分析抑菌剂对微生物的作用机制。本研究采用比浊法对不同培养期内试验组和对照组样品在560 nm 处的吸光度进行测定，绘制4 类抗菌肽作用下两种微生物的标准曲线，结果见图1 和图2。
图1 抗菌肽抑菌作用下大肠杆菌的生长曲线
Fig.1 Growth curves of Escherichia coli under the inhibitory effects of antibacterial peptides
图2 抗菌肽抑菌作用下荧光假单孢菌的生长曲线
Fig.2 Growth curves of Pseudomonas fluorescens under the inhibitory effects of antibacterial peptides
由图1 可知，大肠杆菌在培养8 h 后试验组和对照组均进入了对数期，但添加了抗菌肽抑菌剂的样本有效减少细胞进入对数期所需的时间，其微生物的增殖受到了极大程度地抑制，导致其数量远小于对照组，同时大肠杆菌由于抗菌肽作用，其微生物死亡量大于增殖量，快速进入了凋亡期，这表明抗菌肽能在对数期作用于微生物，表现出较为高效的抑菌作用。由图2可知，荧光假单孢菌整体的繁殖周期较长，但抗菌肽的抑菌表现与对大肠杆菌的抑制效果具有一定的相似性，均在微生物繁殖的对数期对细菌的增殖进行了有效地抑制，并加快微生物的死亡，提前结束微生物繁殖周期，实现对微生物生理活动的抑制。
2.1.2 MIC 和MBC 的测定结果
4 类抗菌肽的MIC 及MBC 如表1 所示。
表1 抗菌肽抑菌剂MIC 和MBC 测定结果
Table 1 Determination of MIC and MBC of antimicrobial peptide bacteriostatic agents mg/mL
抗菌肽CAP OAP HAP BAP大肠杆菌MIC 0.31 0.43 0.48 0.66 MBC 0.92 1.25 1.39 2.17荧光假单胞菌MIC 1.36 0.40 1.22 1.54 MBC 2.78 1.18 2.47 2.83
由表1 可知，CAP、HAP 和BAP 3 种抗菌肽对两种微生物表现出了略有不同的抑制作用，其对大肠杆菌的抑制效果要优于荧光假单胞菌，主要表现为较低浓度的抗菌肽即可对大肠杆菌表现出抑制及灭杀作用，说明抗菌肽抑菌剂对大肠杆菌的作用灵敏性较高；OAP 对两类微生物的抑制作用差别不大，其对荧光假单胞菌的抑制作用略强于大肠杆菌，这表明OAP 对此两种微生物均具有较强的抑制灵敏度。
在针对大肠杆菌的抑制试验中，4 类抗菌肽的抑制能力最高的是CAP，其灵敏度也最高，而OAP 和HAP 的抑菌能力和灵敏度表现基本一致，BAP 对大肠杆菌的抑制作用相对较差，灵敏度不高；在针对荧光假单胞菌的抑制试验中，4 类抗菌肽的抑制能力最高的是OAP，其灵敏度也最高，其次是HAP，再次是CAP，BAP 对荧光假单胞菌的抑制作用同样较差，灵敏度不高。
2.2 抗菌肽对草莓的保鲜效果
2.2.1 细菌总数
4 类抗菌肽抑菌剂对草莓中细菌总数的影响如图3 所示。
图3 抗菌肽对草莓贮藏过程中细菌总数的影响
Fig.3 Effects of antibacterial peptides on the total bacterial count during strawberry storage
由图3 可知，新鲜草莓在10 ℃下贮藏过程中，细菌总数处于不断上升的状态，贮藏期达到5 d 时，对照组样本的细菌总数由初始的6.6×102 CFU/g 上升到1.1×104 CFU/g，此时的样本已经丧失了商业价值。通过添加4 类水产抗菌肽，草莓样本的细菌总数增长速率得到了有效地抑制，各类水产蛋白抗菌肽对草莓细菌总数增长抑制作用由强到弱依次为CAP＞OAP＞HAP＞BAP，CAP 抑制细菌生长效果最佳。
新鲜草莓中细菌总数的增长同样表现出周期性，而通过添加抗菌肽抑菌剂，可以实现在微生物增殖速度最快的对数期对其进行抑制，实现产品的保鲜。
2.2.2 总酸含量
添加抗菌肽抑菌剂对草莓中总酸含量的影响如图4 所示。
图4 抗菌肽对草莓贮藏过程中总酸含量的影响
Fig.4 Effects of antibacterial peptides on the total acid content during strawberry storage
由图4 可知，新鲜草莓在10 ℃下贮藏期间总酸含量随时间延长而下降，当贮藏期达到5 d 时，对照组样本的总酸含量由初始的5.41 g/100 g 下降到1.22 g/100 g。研究表明，草莓在贮藏过程中，其采后果实内的各类有机酸因其自身的呼吸及微生物作用受到了分解，而通过添加水产抗菌肽，草莓品质劣化过程得到了有效地抑制。不同水产蛋白抗菌肽对草莓总酸含量下降抑制作用由强到弱依次为CAP＞OAP＞HAP＞BAP。综上所述，添加不同水产蛋白抗菌肽均可以在不同程度上抑制其总酸含量的降低，实现产品的保鲜。
2.2.3 腐烂率
添加抗菌肽抑菌剂对草莓腐烂率的影响如图5所示。
图5 抗菌肽对草莓贮藏过程中腐烂率的影响
Fig.5 Effects of antibacterial peptides on the decay rate of strawberry during storage
由图5 可知，新鲜草莓在10 ℃下贮藏1 d 后即产生了腐烂，贮藏5 d 后其腐烂率达到81.45%，而通过添加水产抗菌肽，草莓样本腐烂的情况得到了有效改善。各类水产蛋白抗菌肽对草莓腐烂抑制作用由强到弱依次为CAP＞OAP＞HAP＞BAP，表现出较好的保鲜效果，可以推断其在草莓贮藏过程中，通过抑制致腐菌的繁殖，从而实现了降低腐烂率的作用。
2.2.4 维生素C 含量
添加抗菌肽抑菌剂对草莓中VC 含量的影响如图6 所示。
图6 抗菌肽对草莓贮藏过程中VC 含量的影响
Fig.6 Effects of antibacterial peptides on VC content of strawberry during storage
新鲜草莓在贮藏过程中，其VC 受氧化分解导致含量下降，这一部分的作用既有内源性的呼吸作用，又有外源性的微生物代谢作用。由图6 可知，新鲜草莓在10 ℃下贮藏期间VC 含量随时间延长，整体呈现下降趋势，当贮藏期达到5 d 时，对照组的VC 含量由初始的0.24 g/100 g 下降到0.08 g/100 g。通过添加水产抗菌肽抑菌剂可以在一定程度上减缓草莓VC 含量的降低速率，说明各类抗菌肽的添加对样品均起到了一定的抗氧化作用。另一方面，采用浸渍的工艺处理草莓之后，在草莓表面形成了一层均匀的抗菌肽保护层，使得草莓贮藏期间的呼吸强度下降，这也降低了其内源性的氧化反应速率。
3 结论
本试验以草莓为研究对象，分析海蟹源抗菌肽（CAP）、牡蛎源抗菌肽（OAP）、带鱼源抗菌肽（HAP）和鲣鱼源抗菌肽（BAP）对草莓的保鲜效果。结果表明，抗菌肽能在微生物繁殖的对数期对细菌的增殖进行有效地抑制，并在一定程度上加快微生物的死亡，提前结束微生物繁殖周期，从而实现对微生物生理活动的抑制。4 类抗菌肽针对大肠杆菌的抑制能力最高的是CAP，针对荧光假单胞菌的抑制能力最高的是OAP。新鲜的草莓属于较难保存的果蔬产品，其在10 ℃下贮藏5 d 的过程中出现了较为明显的品质劣化。通过添加4 种抗菌肽抑菌剂，可以明显抑制草莓中细菌的增殖，延缓其总酸含量的降低，抑制草莓的呼吸氧化及VC 含量的降低，减少果实腐烂的发生。4 种水产蛋白抗菌肽对草莓抑制作用由强到弱依次为CAP＞OAP＞HAP＞BAP，抑制能力最高的CAP 与对照组在第5 天细菌总数分别从初始的6.6×102 CFU/g 上升到2.1×103 CFU/g和1.1×104 CFU/g；总酸含量从初始的5.41 g/100 g 下降到4.16 g/100 g 和1.22 g/100 g；腐烂率分别上升至16.42% 和81.45%；VC 含量分别从初始的0.24 g/100 g下降到0.21 g/100 g 和0.08 g/100 g。4 种水产蛋白抗菌肽对草莓起到了较为突出的防腐保鲜作用并能延长其货架期，为水果保鲜方面的应用提供了基础。
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