酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种广泛应用于发酵工业的真菌，其以生长快速和优异的发酵能力而闻名[1-3]。然而，在工业生产中，酵母细胞常面临多种环境变化的挑战，如高渗、高温、氧化、低水活以及高浓度的乙醇、有机酸等，称为“环境胁迫”[4-5]。这些条件会抑制酵母正常生长和代谢。例如，酿酒过程中产生的乙醇会抑制酵母细胞的活力和分裂，而烘焙工艺中的冷冻和热损伤也会显著降低其发酵能力。因此，提高酿酒酵母的抗逆性对于提升其生产性能至关重要。
海藻糖（又称α-D-葡萄糖苷-α-D-葡萄糖苷）是一种非还原性二糖，由两个葡萄糖分子通过α-1，1-糖苷键连接而成。它具有高度亲水性和极强的化学稳定性，广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中，在恶劣环境下具有保护细胞结构和维持细胞活性的重要功能[6]。海藻糖在酵母细胞中的代谢和调控对其功能发挥起着关键作用。例如，葡萄糖苷转运体（alpha-glucoside transporter，Agt1）是一种依赖H+的海藻糖转运体，其过表达有助于高效转运海藻糖至细胞内，提供细胞保护并增强其耐受性[7-9]。因此，寻找能高效转运海藻糖的酿酒酵母株可获得更具抗逆性的酵母，拓展其在工业生产中的应用潜力。
本文详细阐述海藻糖分子结构特征及其在维持生物大分子稳定性方面的重要作用，分析海藻糖在不同胁迫条件下的调控机制，并讨论其在酿酒酵母中的代谢通路、关键的转运途径和相关转运蛋白。本文旨在深入探讨海藻糖在胁迫环境下提高酿酒酵母抗逆性的潜在机制，全面回顾海藻糖在酿酒酵母抗逆性中的作用及细胞适应胁迫环境的机制，以期为未来的研究提供指导，为提升酿酒酵母的抗逆性和生产性能提供新的思路和策略。
1 海藻糖基本性质
1.1 海藻糖的结构及性质
海藻糖分子结构见图1[6]。1832 年，Wiggers 首次在麦角黑麦中发现海藻糖，之后越来越多的研究者在其他生命体（如细菌、真菌和动植物）中发现海藻糖[10]。海藻糖为白色的晶体形态，无毒，甜度为蔗糖的45%，能够溶于水和部分有机试剂中。海藻糖通常以二水合物的形式存在，表现出极高的物理和化学稳定性，即使在加热的条件下也不与氨基酸发生美拉德反应[11]。组成海藻糖的两个葡萄糖分子结构对称，没有半缩醛基团，因此不具备还原性和变旋光性。作为自然界中极为稳定的二糖之一，除非暴露在极端的水解条件下，海藻糖不会被分解成单糖，主要原因是其内部糖苷键的能力极低，仅为1 kcal/mol（1 kcal/mol=4.19 kJ/mol），远低于蔗糖的27 kcal/mol[12]。此外，常见的淀粉水解酶（如α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶）均不会对它产生催化作用，仅海藻糖酶对其有专一的水解作用。这种突出的稳定性使得海藻糖在食品、化学品和医药行业有着广泛应用。
图1 海藻糖分子结构
Fig.1 Molecular structure of trehalose
1.2 海藻糖对生物体的保护作用及机理
海藻糖具有保护细胞和复杂生物制品（例如病毒、细菌和组织）的作用，维护脂质、蛋白质等生物分子的稳定性，但其保护机制尚未完全阐明。关于海藻糖对细胞胁迫保护的解释存在几种假说。首先提出的“水替代”假说指出，海藻糖能够在胁迫条件下通过氢键替代细胞内的水分子，形成水化膜，保护细胞内部生物大分子的结构完整性和功能活性[13]；其次，“玻璃态”假说指出，海藻糖在生物分子脱水时形成一种“玻璃态”结构来阻碍分子间的构象变化，从而维持分子结构的稳定[14]；最后，“优先排阻”学说指出，海藻糖通过优先吸收并结合于蛋白质分子周围的水分，降低蛋白质活性，使其排列更加紧密、构象更加稳定。然而，这些机制存在局限性，例如，蔗糖也是非还原性多羟基二糖，但其对活性分子的保护有限，与“水替代”假说相矛盾；同时，形成玻璃态非晶体聚合物（如葡聚糖）无法有效保护活性物质，与“玻璃态”假说相矛盾[15]。因此，对于海藻糖保护活性物质的机制仍需要进一步探讨。
2 海藻糖在胁迫条件下的保护作用
2.1 乙醇胁迫下海藻糖对酵母的保护作用
海藻糖由于其优越的保水性和极高的稳定性，被视为衡量酵母耐受乙醇能力的重要指标[16]。Sharma等[17]利用高浓度的NaCl 和乙醇溶液作为筛选条件，成果选育出耐乙醇能力增强的酵母变种。结果显示，这些经过筛选培育的酵母菌与野生型相比，其海藻糖的累积量和存活率有显著提高。另外，王宪斌等[18]研究表明，酵母细胞的存活率与其内部海藻糖的含量有着直接联系，海藻糖的增加能够有效提高细胞的存活率。在乙醇的压力下，海藻糖可以取代细胞膜上的水分和乙醇分子，通过与脂质分子的极性基团形成氢键来稳定细胞膜[16]。此外，海藻糖还能够防止细胞内蛋白质的羰基化，保护蛋白质免受损伤，并促进变性蛋白的正确折叠，修复损伤[19]。Mahmud 等[20]通过同时敲除中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2 和酸性海藻糖酶基因ATH1，对酵母的乙醇耐受性进行了研究，发现缺陷菌株的海藻糖含量高于出发菌株，表明海藻糖酶基因的缺失有助于提高细胞内海藻糖的积累，从而增强酵母对乙醇的耐受性。
2.2 氧化胁迫下海藻糖对酵母的保护作用
研究表明，海藻糖能够在氧化胁迫条件下，对酵母细胞中的蛋白质和脂质起到保护作用[21-22]。海藻糖的作用机理主要是通过作为自由基清除剂，与活性氧（reactive oxygen species，ROS）进行反应，避免ROS 对细胞内的蛋白质、DNA、RNA 以及磷脂等重要组成部分造成伤害[16]。在不同的氧化应激条件下，如过氧化氢或甲萘醌引起的压力下，海藻糖均能够展现出对细胞的保护能力，其效果与氧化损伤发生的位点密切相关[23]。过氧化氢导致的氧化损伤主要源于细胞膜表面的氧化自由基，海藻糖通过位于细胞膜外发挥作用，从而提供最大程度的保护。相对地，在甲萘醌引发的胁迫中，氧化作用发生在细胞内部，因此细胞内海藻糖的增加有助于防止细胞内物质（如蛋白质）遭受氧化。这种对两种氧化胁迫的保护机制的研究，支持了海藻糖通过“水替代”机制在磷脂层两侧发挥保护作用，有效减少氧化应激对细胞蛋白质和脂质的损伤。
2.3 热胁迫下海藻糖对酵母的保护作用
热休克现象能促进酵母细胞内海藻糖的积累，从而提升细胞对极端高温环境的抵抗力[24-25]。研究表明，海藻糖在细胞中的积累有助于增强蛋白质的稳定性，进而提高细胞的高温耐受能力[26]。细胞内海藻糖水平的增加，可以通过调控与海藻糖合成及分解相关的基因来实现。经过这些基因改造的酵母细胞，在面临热应激时，展现了更加强效的抵抗能力。尽管海藻糖对于酵母细胞应对高温胁迫的作用被广泛认可，但关于其作用机制的理解并不一致。有研究指出，TPS1基因是海藻糖合成酶的编码基因，对细胞耐热性起着关键作用，这表明海藻糖合成酶可能比海藻糖本身更关键[7]。该研究强调，酵母细胞的耐热性增强不仅仅是由于细胞内海藻糖含量的提升，而是海藻糖代谢途径相关基因的表达调节及其代谢水平调控的综合结果。基于海藻糖代谢途径调控增强酿酒酵母抗环境胁迫能力见表1。
表1 基于海藻糖代谢途径调控增强酿酒酵母抗环境胁迫能力
Table 1 Resistance of S.cerevisiae to environmental stresses enhanced by regulation of trehalose metabolism pathways
突变株类型tps1Δ胞内海藻糖含量（对比野生型）下降tps2Δ下降抗逆性能（对比野生型）存活率显著降低耐受性显著降低生长受到严重抑制tps1Δ、tps2Δ tsl1Δ nth1Δ下降下降提高ath1Δ nth2Δ胁迫类型高温胁迫（42、50 ℃）干燥胁迫（60%相对湿度）高温胁迫（42 ℃）氧化胁迫（4 mmol/L H2O2）高盐胁迫（1 mol/L NaCl）氧化胁迫（2 mmol/L H2O2）乙醇胁迫（＞10%）有机酸胁迫（0.45%醋酸）冷冻胁迫（-20 ℃一周）乙醇胁迫（7%）冷冻胁迫（-20 ℃一周）有机酸胁迫（0.45%醋酸）提高提高存活率显著降低存活率降低存活率显著提高用于面包制作时产气能力大幅提高存活率提高用于面包制作时产气能力大幅提高存活率显著提高引用文献[27-28][8][27-29][29][29][21][30][31][32][30][32][31]
3 海藻糖的代谢与调控
3.1 酵母胞内海藻糖的合成
在酵母细胞中，海藻糖的合成主要依赖于两个关键酶作用：海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，Tps）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，Tpp）[33-34]，代谢途径见图2。Tps 酶将二磷酸尿苷葡糖与葡萄糖-6-磷酸结合，生成海藻糖-6-磷酸，后者在Tpp 酶的催化下最终转化成海藻糖[35]。Tps 酶系涵盖了Tps1、Tps2、Tps3 和Tsl1 等多个组成部分[36-37]。虽然海藻糖对酵母细胞抵御各种外部胁迫具有关键作用，但海藻糖的过度积累若不能及时分解，则可能带来负面影响。例如，积聚在细胞膜上的海藻糖可能增加细胞膜的刚性，减少其流动性，干扰细胞膜参与正常的细胞生理活动[37]。
图2 酿酒酵母海藻糖代谢途径
Fig.2 Trehalose metabolism pathway in S.cerevisiae
3.2 酿酒酵母对于海藻糖的转运与利用
酵母细胞吸收外部海藻糖主要通过两种特定的海藻糖转运协同载体实现。首先，AGT1 基因编码的H+-海藻糖转运协同载体，这种载体对海藻糖有较高的亲和性，Km 值约为4 mmol/L[38]。缺乏AGT1 基因的菌株（agt1Δ）比出发菌株显示出更弱的抗干燥能力和较低的海藻糖内含量，说明Agt1 负责将海藻糖运输到细胞内部[39]。其次，MAL21 基因编码的麦芽糖渗透酶则是一种对海藻糖有低亲和力的转运协同载体，Km 值超过100 mmol/L[40]。
酵母细胞内海藻糖分为内源性和外源性两种，其利用机制各不相同。内源性海藻糖主要通过NTH1 基因编码的中性海藻糖酶分级成葡萄糖，进而参与糖酵解途径。而对外源性海藻糖的利用包含以下两条路径：一是通过Agt1-Nth1 途径，即外源海藻糖经Agt1 转运至细胞内后，由中性海藻糖酶Nth1 分解为葡萄糖供细胞使用；二是通过酸性海藻糖酶Ath1 途径。虽然早期研究认为Ath1 主要在液泡内分解细胞内海藻糖，但后续研究通过构建带有Ath1 融合荧光蛋白的酵母表达系统发现，Ath1 也存在于细胞表面，能够直接作用于外源型海藻糖，将其分解为葡萄糖供酵母利用。
3.2.1 转运蛋白Agt1 的关键氨基酸残基
在酿酒酵母中，带有α-葡萄糖苷结构的糖一般经由具有糖-H+同向转运活性的渗透酶转运到细胞[40]。这些渗透酶的二级结构相似，包含12 个跨膜（transmembrane，TM）结构域，其α-螺旋富含疏水氨基酸，而N 端和C 端结构域位于膜的细胞质侧[41]。多项研究表明，渗透酶中心腔周围的TM 结构域中的带电氨基酸对转运活性至关重要，它们通常负责H+转运体与糖和质子的结合[41-42]。Agt1 在TM α-螺旋中有4 个带电的氨基酸残基，其中包括TM-I 中的Glu-120 和Asp-123，TM-II 中的Glu-167 和TM-XI 中的Arg-504。这4 个带电残基在来自酵母和真菌的α-葡萄糖苷-H+共转运体中处于相同位置上并具有高度保守性，在糖运输的生物过程中发挥着重要作用[43]。Agt1 的3D 结构见图3[44-45]。
图3 Agt1 3D 结构
Fig.3 3D structure of Agt1
3.2.2 Agt1 在脱水-复水过程中的活性变化
酿酒酵母与大多数微生物一样，可能会经历脱水-复水化循环，因为溶质浓度、温度以及挥发性等因素可能会改变微生物生存环境的水活性。当细胞内水分低于某一个临界值时，微生物的孢子和营养细胞会停止其代谢活动，进入无水状态。在酿酒酵母的脱水-复水循环中，细胞膜的通透性增加，脂质双分子层发生相变[46]。观察发现，在具有中等耐脱水复水能力的酿酒酵母中，当胞内含水量降低到每克干重1.5 g 水时，Agt1 转运体的活性降低了10%～15%。而在经历快速脱水-复水化过程后，Agt1 的活性明显高于未经历脱水-复水化过程的对照细胞[47]。这可能是由于Agt1 转运体构象发生变化，从而导致其转运活性增加。表明这些跨膜和相对疏水的蛋白在功能上依赖于水，水对于维持其构象起到了至关重要的作用。
3.3 不同胁迫状态下海藻糖的调控
在无胁迫状态下，TPS 复合体（即海藻糖-6-磷酸合成酶复合物）不完整，导致细胞内海藻糖的合成停止。葡萄糖代谢产物G-6-P（葡萄糖-6-磷酸）和尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）共同抑制TPS 复合体基因的表达[48]。同时，胞内的中性海藻糖水解酶Nth1 处于磷酸化激活状态，可以分解任何存在的胞内海藻糖。酸性海藻糖水解酶Ath1 则存储在液泡中，未被释放到细胞外，保持待命状态[49]。
然而，当TPS 复合体激活并导致细胞内海藻糖积累时，中性海藻糖水解酶Nth1 被去磷酸化，失去活性，无法分解堆积的胞内海藻糖[50]，如图4（a）所示。在压力消失状态下，酵母需要快速恢复正常代谢状态，因此胞内外的海藻糖必须快速被分解。Nth1 被迅速磷酸化，开始分解胞内海藻糖，同时存储在液泡中的Ath1 也被转运至膜外，清除细胞膜外结合的海藻糖[48-49]，如图4（b）所示。
图4 环境胁迫和环境胁迫消失状态下酵母海藻糖代谢
Fig.4 Trehalose metabolism in S.cerevisiae under environmental stress and stress disappearance
（a）环境胁迫；（b）环境胁迫消失状态。
由图4（a）可知，α-葡糖苷转运蛋白Agt1 将积累的海藻糖转运至细胞膜外，在膜外与磷脂上的磷酸基团结合，稳定细胞膜的温度抗性并提供细胞膜的隔离保护。此时，胞内代谢水平下调，整体细胞准备进入休眠状态以应对恶劣环境。
由图4（b）可知，海藻糖降解为大量葡萄糖，葡萄糖代谢产物G-6-P 和UDPG 增加，抑制了TPS 复合体活性，阻碍其利用胞内葡萄糖合成海藻糖[47]。这种调节使得酵母能够快速适应外界环境的变化。总之，酵母在压力环境下，海藻糖保护细胞活性。然而，它也降低了生物反应活性。例如高温下海藻糖取代水结合蛋白质以保护蛋白质，但也可能导致部分蛋白质失去于底物结合的机会，使功能性蛋白进入休眠状态。这也是酵母在压力环境下发酵速度减缓的原因之一。
4 结语与展望
关于海藻糖对酵母保护作用的研究不再单纯关注海藻糖含量与抗胁迫能力的关系，而是转向更广泛的关注，开始研究海藻糖相关代谢和转运途径的调控。优化海藻糖转运系统将提升酿酒酵母在胁迫条件下的竞争力。在工业酿造等领域，高效的海藻糖转运体系代表着更为稳定的发酵过程。通过增强酵母对乙醇、温度和氧化胁迫等的耐受能力，减少生产中的干扰和损失，提高产品的稳定性和品质，从而提升发酵效率和产率。Agt1 作为酿酒酵母中利用海藻糖进行抗逆的关键酶，其抗逆性的提高对于工业生产具有重要意义。通过筛选具备高效海藻糖转运能力的酵母菌株，并深入研究其基因层面的差异性，以明确影响海藻糖转运功能的关键位点，将为改良那些在工业生产中表现优异但海藻糖转运方面存在问题的菌株提供重要的理论基础。优化的海藻糖转运系统将促进酵母对海藻糖的转运和代谢，有望提高海藻糖在生物材料合成和食品工业中的应用潜力，包括酿酒、烘焙、生物燃料的生产、保鲜技术的改良以及在医药领域中的新应用。
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