臭豆豉是我国云南、四川、重庆、贵州、湖南、湖北、河南和山东等地广泛食用的一种特色臭味食品，本质上属于芽孢杆菌发酵黄豆而成的细菌型豆豉。由于这类豆豉具有类似于“脚丫子臭味”、“霉腐味”、“氨臭味”等的独特风味，被人们称为臭豆豉，包括常见的纳豆、水豆豉等。近年来，国内对臭豆豉的研究主要集中在发酵菌株的筛选和鉴定、臭味工艺控制以及风味物质鉴定等方面[1]。豆豉的臭味来源复杂，可能与游离氨、吡嗪类化合物、支链短脂肪酸、硫化物及吲哚有关，通常为一种或多种臭味的混合物。Tanaka 等[2]发现韩国纳豆及清麴酱中的主要风味物质为氨、2，5-二甲基吡嗪、异戊酸等，其中游离氨具有类似于臭鸡蛋和素菜腐败的味道，而异戊酸则具有“脚臭味”和“汗臭味”。Liu等[3]研究发现2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、川芎嗪（2，3，5，6-四甲基吡嗪）和2，3，5-甲基-6-乙基吡嗪是纳豆的主要风味物质，高浓度吡嗪会呈现“霉味”、“泥土味”等不良风味[4]。Hong 等[5]报道纳豆含有异丁酸和异戊酸等难闻的风味物质。杨智博等[6]发现渝黔地区的部分细菌发酵型豆豉中的吲哚含量不同，而高含量的吲哚具有“粪臭味”。
细菌型豆豉的风味与发酵菌密切相关，分析发酵过程中优势菌群结构、探索食品特征风味物质及其关联，对调节食品风味品质具有重要意义。聂黔丽等[7]报道遵义细菌型自然发酵干豆豉核心菌群为芽孢杆菌和乳杆菌，风味物质中吡嗪类化合物来源于枯草芽孢杆菌，酸类物质来源于乳杆菌。唐辉等[8]研究发现长沙臭豆腐卤水发酵过程中梭状芽孢杆菌SYSU GA17129、解硫胺素硫胺素芽孢杆菌和解硫乙酰芽孢杆菌等优势菌与12 种特征风味物质存在显著正相关，为卤水主要的风味关联菌。郭建华等[9]研究发现，玉米黄酒发酵过程中魏斯氏菌（Weissella）、乳杆菌（Lactobacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、红酵母（Rhodotorula）、科氏假单胞菌（Kwoniella）与乙酯类化合物及高级醇存在显著相关性。目前，Illumina 高通量测序技术是微生物菌群结构常用的分析技术。通过提取基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、构建DNA 文库、桥式聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增以及边合成边测序等步骤快速得到有效序列，再结合97%的相似性进行操作分类单元（operational axonomic units，OTU）聚类分析和物种分类学分析，能够快速明确样品微生物菌群的组成和结构，被广泛应用于传统发酵食品的菌群研究[10-11]。
保康传统发酵臭豆豉是湖北省襄阳市保康县的传统特色食品，为当地人们喜食的咸菜之一。在家庭式或手工作坊式生产模式中，臭味的主要成分、来源及主要贡献菌群尚不清晰，阻碍了当地臭豆豉产业特色化、科学化的发展。本研究采用Illumina 高通量测序技术、聚类分析、物种分类学手段以及气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术分析，对保康传统发酵臭豆豉产品中的优势菌群、特征风味物质及其来源进行分析，以期为后续臭豆豉产业特色化、科学化发展提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
传统发酵臭豆豉（以下简称臭豆豉）：湖北省襄阳市保康县；E.Z.N.A™磁珠法DNA 提取试剂盒：美国Omega 公司；双链DNA（dsDNA）荧光定量检测试剂盒：美国Thermo Fisher 公司；2 倍预混PCR 反应体系、Hieff NGS™磁珠法DNA 分选试剂盒：翌圣生物科技（上海）股份有限公司。
1.2 仪器与设备
台式离心机（Pico-21）、荧光计（Q33238）：美国Thermo Fisher 公司；漩涡混合器（GL-88B）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；混匀型干式恒温器（TND03-H-H）：深圳拓能达科技有限公司；凝胶成像系统（FR-1000）：上海复日科技有限公司；PCR 仪（ETC811）：北京东胜创新生物科技有限公司；气相色谱质谱联用仪（8860-5977B）：美国安捷伦公司；手动固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）进样器（57330-U）、聚二甲基硅氧烷萃取头（57310-U，50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco 公司。
1.3 方法
1.3.1 菌群结构测定
取剪碎后的臭豆豉样品0.5 g，使用E.Z.N.A™磁珠法DNA 提取试剂盒提取基因组DNA。以通用双引物Bar-PCR primer F、Primer R 对16S rRNA 序列的V3～V4区域进行第一轮PCR 扩增。得到的PCR 产物再引入Illumina 桥式PCR 兼容引物进行第二轮扩增，扩增产物利用2% 琼脂糖凝胶电泳检测文库大小。合格的DNA 文库随后进行Illumina 高通量测序。经高通量测序后得到的双端序列根据不同碱基的标签，找到对应引物之间的接口，取出接头序列。根据PE（pairedend）reads 之间的overlap 关系进行拼接，再依据条码序列和引物序列进行区分和比较得到有效序列。根据序列质量进行质量控制和筛选，过滤复杂且难于处理的短序列，得到质量值较高的优化序列。在16S rRNA高通量测序过程中，利用97% 的相似性进行OTU 聚类分析和物种分类学分析。根据OTU 聚类的结果，分析臭豆豉中微生物的菌群多样性。利用Shannon、Simpson、Shannoneven 指数以及覆盖率（coverage）评估菌群多样性，利用丰度覆盖率（abundance-based coverage estimator，ACE）指数、Chao1 指数评估菌群丰度。
利用Blast 将序列与核糖体数据库（ribosomal database project，RDP）、Silva、美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）等数据库进行比对，筛选出序列最佳比对结果并进行过滤，默认满足相似度＞90% 且Coverage＞90% 的序列用于后续分类，不满足条件的序列为unclassified，并在各个分类水平上统计菌群结构并讨论臭豆豉样品的微生物菌群特征。
1.3.2 基础风味品质测定
水分含量参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的方法测定；pH 值参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH 值的测定》进行测定；总酸含量参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》测定，以乳酸计；氨基酸态氮含量参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》测定。
1.3.3 挥发性风味品质测定
前处理：准确称取2.0 g 样品与20 mL 饱和氯化钠溶液于50 mL 顶空瓶中，在恒温水浴磁力搅拌器中，70 ℃预热10 min。将事先老化好的萃取头插入顶空瓶内，推出纤维头，顶空吸附40 min 后插入气相色谱进样口解吸附5 min。
采用GC-MS 技术分析提取的挥发性风味成分。气质条件：HP-5 MS 石英毛细管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样。采用程序升温，起始柱温为40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 的速率升温至140 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升温至210 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min 的速率升温至240 ℃，保持3 min。MS条件：电子电离源，接口温度220 ℃，离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 45～500。
利用质谱数据库美国国家标准与技术协会（National Institute of Standards and Technology，NIST）20 对挥发性成分进行鉴定，采用面积百分比法计算挥发性化合物的相对含量。
1.4 数据处理
将PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行高通量测序。采用Usearch 软件对有效数据进行多个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类处理，选择的相似性水平为97%，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。然后利用相应的核糖体和Unite 真菌核糖体内部转录间隔区数据库注释物种。利用Mouthur 软件分析Alpha 多样性指数。利用R 软件制作Shannon 指数稀释曲线图。利用Origin 软件分别制作门、属、种水平的菌群相对丰度图。
2 结果与分析
2.1 菌群结构分析
2.1.1 臭豆豉高通量测序结果统计
对臭豆豉样品16S rRNA 的V3～V4 区域进行Illumina 高通量测序，结果见表1。
表1 保康传统发酵臭豆豉高通量序列结果
Table 1 High-throughput sequence results of Baokang traditional fermented smelly douchi
样品Barcode信息原始序列数有效序列数臭豆豉CTGACG 70 255原始序列碱基平均长度/bp 466.76 62 725有效序列碱基平均长度/bp 428.82
由表1 可知，测序共得到70 255 条原始序列，原始序列碱基平均长度为466.76 bp，质控过滤后得到有效序列62 725 条，有效序列碱基平均长度为428.82 bp。基于97% 相似性的分类水平，共注释到423 个OTU隶属于1 个细菌界、22 个门、48 个纲、83 个目、103 个科、124 个属、137 个种。
2.1.2 臭豆豉菌群多样性分析
Alpha 多样性指数可以反映微生物群落的多样性、丰富度和均匀度，包括Chao1、ACE、Shannon、Shannoneven 和Simpson 指数，其中Chao1 和ACE 指数越大，说明群落中菌群越丰富；Shannon 指数越大，Simpson 指数越小，说明菌群多样性越高；Shannoneven 指数越大，反映群落中个体分配越均匀。样本Coverage 值越高说明样本中测出的序列越能够反映真实的菌群情况[12]。臭豆豉样本中微生物菌群的Alpha 多样性分析结果见表2。
表2 臭豆豉样本中微生物菌群的Alpha 多样性分析结果
Table 2 Alpha diversity analysis results of microbial flora in smelly douchi sample
样品臭豆豉优质序列数48 387 OTU 数423 Chao1 指数423 ACE 指数423 Shannon 指数1.28 Simpson 指数0.51 Shannoneven 指数0.21覆盖率/%100
由表2 可知，除冗余后的48 387 条非重复优质序列形成423 个OTU 分类单元。臭豆豉样品的覆盖率为100%，说明测序结果可以真实反映出臭豆豉样品中的微生物菌群情况。Chao1 指数和ACE 指数均为423，说明臭豆豉中微生物菌群种类丰富。Shannon 指数为1.28，Simpson 指数为0.51，说明臭豆豉菌群的多样性较高。Shannoneven 指数为0.21，表明传统发酵臭豆豉样品中微生物群落存在复杂多样性，每个物种丰度分布不均匀。
为进一步证明样品数量的合理性，基于OTU 水平绘制Shannon 指数稀释曲线，结果见图1。
图1 基于OTU 水平的臭豆豉Shannon 指数稀释曲线
Fig.1 Dilution curve of Shannon index of microbial flora in smelly douchi sample based on OTU level
由图1 可知，从样本中随机抽取234 个序列，以抽取的序列数为横坐标，以对应样本的Shannon 指数为纵坐标绘制稀释曲线。随着抽取序列数的增加，稀释曲线逐渐平缓，表明样本测序数量足够且合理，能够真实反映臭豆豉中菌群结构。
2.1.3 臭豆豉中菌群结构分析
基于门水平对臭豆豉样品中的微生物菌群结构进行分析，结果见图2。
图2 门水平上的菌群相对丰度
Fig.2 Relative abundance of flora at phylum level
由图2 可知，在门水平上，臭豆豉共注释到21 个门，全部属于细菌。有3 个优势细菌门（相对丰度＞0.4%），分别为厚壁菌门（Firmicutes）97.04%、放线菌门（Actinobacteria）0.68%和绿弯菌门（Chloroflexi）0.40%，表明厚壁菌门占臭豆豉微生物菌群的绝大多数。研究发现，厚壁菌门可能是不同类型豆豉发酵的核心优势菌门。聂黔丽等[7]研究发现，遵义细菌型自然发酵干豆豉中厚壁菌门相对丰度为94.33%。赵文鹏等[13]研究发现，厚壁菌门在曲霉型豆豉发酵过程中相对丰度为81.15%。
基于属水平对臭豆豉的菌群结构进行分析，结果见图3。
图3 属水平上的菌群相对丰度
Fig.3 Relative abundance of flora at genus level
由图3 可知，在属水平上，菌群主要由芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和微球菌属（Micrococcaceae）3 个优势属（相对丰度＞0.5%）组成，其相对丰度分别为94.39%、0.98%和0.54%，表明该豆豉中芽孢杆菌属的细菌占绝对优势。这与杨艳莉[14]的研究结果基本一致。
基于种水平对臭豆豉的菌群结构进行分析，结果见图4。
图4 种水平上的菌群相对丰度
Fig.4 Relative abundance of flora at species level
由图4 可知，臭豆豉样品中已明确的优势菌群（相对丰度＞1%）有副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）、嗜热淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）、斯密氏芽孢杆菌（Bacillus smithii），其平均相对丰度分别为68.83%、19.17%、4.02%，优势菌群的相对丰度为92.02%，菌群结构与已报道的其他地区产的臭豆豉存在明显不同[15-16]。副地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧的芽孢杆菌，16S rRNA 序列分析表明，该菌与地衣芽孢杆菌有99.4% 的同源性[17]。相关报道证实，副地衣芽孢杆菌在大豆酱[17]、巴氏杀菌的奶酪、乳清食品[18]、脱脂奶粉[19]、手工水果乳制品[20]等发酵食品中广泛存在，并被认为是一种安全的益生菌[21]。嗜热淀粉芽孢杆菌是一种耐高温的解淀粉细菌，通常用于香料和酿酒。相关报道证实，嗜热淀粉芽孢杆菌在贵阳、遵义和湄潭地区的豆豉中为高丰度菌[22]。Coorevits等[23]报道，从奶牛场的稻草中分离得到了嗜热淀粉芽孢杆菌。由于国内传统发酵臭豆豉均采用稻草覆盖保温，推测嗜热淀粉芽孢杆菌可能来自于稻草。此外，已报道的贵州地区传统细菌型豆豉中也存在斯密氏芽孢杆菌。该菌为一种兼性厌氧嗜热细菌，具有一定的生物学功能。Huang 等[24]研究发现斯密氏芽孢杆菌可以帮助恢复斑马鱼肠道上皮细胞的完整性，减轻炎症反应的生物学功能。
2.2 基础品质分析
臭豆豉的水分含量、pH 值、总酸、氨基酸态氮、粗蛋白、粗脂肪含量见表3。
表3 臭豆豉基础品质分析结果
Table 3 Basic quality results of smelly douchi
水分含量/%51.87 pH 值7.54总酸含量/（g/100 g）0.36氨基酸态氮含量/（g/100 g）0.39粗蛋白含量/（g/100 g）38.94粗脂肪含量/（g/100 g）22.07
由表3 可知，保康传统发酵臭豆豉水分含量为51.87%，结合GB/T 42464—2023《豆豉质量通则》，保康传统发酵臭豆豉属于稀态豆豉。pH 值和总酸含量分别为7.54 和0.36 g/100 g，说明该豆豉产品的酸度不高，与品尝时口感一致。这与高梦颖等[25]报道自然发酵的细菌型豆豉的pH 值结果相符。粗蛋白含量和粗脂肪含量分别为38.94、22.07 g/100 g，与常见传统发酵豆豉产品相似[26]。氨基酸态氮含量为0.39 g/100 g，符合GB/T 42464—2023 要求（≥0.25 g/100 g），但低于常见的传统发酵豆豉产品[27]。
2.3 风味品质分析
臭豆豉挥发性风味物质组成见表4。
表4 臭豆豉挥发性风味物质组成
Table 4 Composition of volatile flavor substances in smelly douchi
类别吡嗪类名称分子式相对含量/%总含量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 2-甲基吡嗪2，5-二甲基吡嗪2，3-二甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪2-丁基-3，5-二甲基吡嗪2，6-二乙基吡嗪2-乙基-3，6-二甲基吡嗪川芎嗪2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪C5H6N2 67.35 C6H8N2 C6H8N2 C7H10N2 C10H16N2 C8H12N2 C8H12N2 C8H12N2 C9H14N2 0.10 19.59 0.07 0.05 27.83 0.75 0.19 17.61 1.16羧酸类1 2 3 4 5 6醇异戊酸2-氨基-4-甲基苯甲酸2-甲基-3-羟基-2-氨基丁酸2-甲基-4-羟基-2-氨基丁酸苹果酸四氢吡喃-2-甲酸C5H10O2 C8H9NO2 C5H11NO3 C5H11NO3 C4H6O5 C6H10O3 0.17 0.06 3.57 1.26 0.77 0.13 5.96类1 2 3 2，6-二甲基-4-庚醇1-辛烯-3-醇1-辛醇C9H20O C8H16O C8H16O 0.93 1.06 0.12 2.39
续表4 臭豆豉挥发性风味物质组成
Continue table 4 Composition of volatile flavor substances in smelly douchi
类别总含量/%4 5 6 7酮名称十一醇16-烯醇十七醇十五烷醇分子式C11H24O C17H32O C17H36O C15H32O相对含量/%0.09 0.06 0.07 0.06类1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C7H14O C7H12O2 C7H12O C8H16O C11H22O C8H14O2 C9H18O C4H4N2O2 0.26 0.04 0.05 4.95 0.24 0.09 0.19 0.50 2-庚酮2，4-庚二酮1-庚烯-3-酮3-辛酮2，8-二甲基-5-壬酮6-甲基-2，4-庚二酮2-壬酮5-亚甲基-2，4-咪唑烷二酮2-壬酮3-甲基-1-苯乙基-4-哌啶酮2-庚酮9-葵烯-2-酮2-十三烷酮2-十四酮2-十九烷酮2-十二酮2-十五烷酮2-十九烷酮10.30 C9H18O C14H19NO 0.92 1.86 11 12 13 14 15 16 17 18烯烃类C7H14O C10H18O C13H26O C14H28O C19H38O C12H24O C15H30O C19H38O 0.04 0.07 0.19 0.26 0.24 0.05 0.20 0.15 1 2 3 4 5酯2，3-二甲基-1-己烯1，8，11-十七碳三烯1，8，11-十七碳三烯1，7-十六烷二烯1-十三烯C8H16 C17H30 C17H30 C16H30 C13H26 0.04 0.08 1.53 0.36 0.06 2.07类1 2 3 4 5 6 7邻苯二甲酸丁基环己酯棕榈酸乙酯油酸乙酯10-烯-十二酯丙烯酸丁酯2-甲基庚酸酯苯乙酸甲酯C18H24O4 0.09 1.86 C18H36O2 C20H38O2 C23H42O2 C7H12O2 C9H18O2 C9H10O2 0.70 0.27 0.29 0.23 0.05 0.23烷烃类1 2 3 4醚乙氧基环己烷3-甲基十五烷3，7-二甲基十一烷甘菊蓝C8H16O C16H34 C13H28 C10H8 0.26 0.07 0.06 0.07 0.46类1 2醛对羟基苯甲醚正丁醚C7H8O2 4.04 C8H18O 3.90 0.14类1 2苯乙醛正壬醛C8H8O 0.24 C9H18O 0.12 0.12
续表4 臭豆豉挥发性风味物质组成
Continue table 4 Composition of volatile flavor substances in smelly douchi
类别含氮化合物名称分子式相对含量/%总含量/%1 2 3 4 5 6 7 2，4-二氨基嘧啶2，4-二羟基嘧啶2，2-二乙基-3-甲基-1，3-恶唑烷2，4，5-三甲基恶唑N-甲基-N-羟乙基苄胺6-十一胺N，N-二甲基脲C4H6N4 4.32 C4H4N2O2 C8H17NO C6H9NO C10H15NO C11H25N C3H8N2O 0.14 0.39 0.13 0.22 0.25 0.23 2.96含硫化合物1 2 3 4 5 1-甲硫基丁烯3-甲基丁硫醇丙酯1-乙硫基-1，3-丁二烯二甲基二硫醚2-乙基己基亚硫酸酯C5H10S C8H16OS C6H10S C2H6S2 C14H30O3S 0.04 0.38 0.10 0.45 0.04 1.01
由表4 可知，从臭豆豉中共检出72 种风味物质，其中有9 种吡嗪类、6 种羧酸类、7 种醇类、18 种酮类、5 种烯烃类、4 种烷烃类、2 种醚类、2 种醛类、7 种酯类、7 种含氮化合物及5 种含硫化合物，其中酮类、吡嗪类、醇类、酯类和含氮化合物种类最为丰富。从挥发性物质相对含量上看，该豆豉吡嗪类化合物相对含量达到67.35%，其次是酮类（10.30%），羧酸类相对含量为5.96%。
吡嗪是蛋白质、氨基酸热分解及蛋白质、氨基酸与糖发生美拉德反应的产物，常见于传统细菌发酵产品，对食品风味具有重要作用[1，28-29]。由表4 可知，臭豆豉中吡嗪类化合物相对含量为67.35%，说明吡嗪类化合物是挥发性风味成分的主要来源。2，5-二甲基吡嗪、2-丁基-3，5-二甲基吡嗪和川芎嗪相对含量分别为19.59%、27.83% 和17.61%，是臭豆豉特征风味物质，与其他地区臭豆豉风味物质有很大区别，表明保康传统臭豆豉具有独特的风味特征[22，30]。类似风味豆豉的研究报道仅见于重庆石柱县干豆豉样品，其吡嗪类物质占比为56.88%[6]。通常细菌型豆豉风味物质中常见的吡嗪类化合物有2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、川芎嗪等，研究表明川芎嗪具有特殊异臭味[31]。还有研究表明，低浓度“焙烤味、坚果味”的2，5-二甲基吡嗪在高浓度时则表现为“霉味”[4，32]。Deng等[28]研究发现，高含量的吡嗪是纳豆氨臭味和腐败味的主要来源。
酮类化合物是臭豆豉中仅次于吡嗪类的物质，该类化合物一般呈果香风味，由脂肪酸氧化作用产生。该类化合物阈值低且增香能力强，常见于各类豆豉产品中。由表4 可知，在臭豆豉中酮类化合物占比为10.30%，其中3-辛酮、3-甲基-1-苯乙基-4-哌啶酮和2-壬酮等物质对豆豉风味具有较高贡献度。
羧酸类物质多具有刺激性气味。由表4 可知，臭豆豉中羧酸类相对含量为5.96%，其中氨基丁酸的衍生物2-甲基-3-羟基-2-氨基丁酸、2-甲基-4-羟基-2-氨基丁酸含量分别为3.57%和1.26%。异戊酸和苹果酸相对含量虽然不高，但两者均有典型的风味，其中异戊酸具有刺激性酸臭味，苹果酸则具有特殊酸味[7，24，33]。
由表4 可知，醚类物质对羟基苯甲醚（3.90%）和含氮化合物N，N-二甲基脲（2.96%）的占比较高，但其对风味的贡献研究还未见报道。含硫化合物中二甲基二硫醚（0.45%）尽管含量较低，但其阀值也很低，具有强烈的异臭味，可能会对臭豆豉风味产生影响。
研究表明，不同细菌菌群在豆豉风味形成中发挥着重要作用[34]。单菌发酵的挥发性风味结果进一步证实，在曲霉型豆豉发酵中，芽孢杆菌产生的主体挥发性风味成分是酮类、吡嗪类、胺类，可能与芽孢杆菌的蛋白水解能力有关[33，35]。根据挥发性风味物质组成分析结果，推测保康传统发酵臭豆豉的特征风味物质2，5-二甲基吡嗪、2-丁基-3，5-二甲基吡嗪和川芎嗪可能来自于副地衣芽孢杆菌的作用。Jeong 等[36]也证实，在无菌大豆上接种地衣芽孢杆菌后的特征风味物质是2，3，5，6-四甲基吡嗪（川芎嗪）、2，3-丁二醇和3-羟基丁-2-酮。张颖[37]发现，与其他芽孢杆菌相比，从酱香型白酒曲中分离得到的地衣芽孢杆菌GTBL-168 的代谢产物中吡嗪类化合物类别最为丰富。嗜热淀粉芽孢杆菌在豆豉风味中的作用主要体现在产酸和产酯。谭小琴[22]研究发现，嗜热淀粉芽孢杆菌与挥发性风味物质异戊酸、2-甲基丁酸等呈正相关，与吡嗪类呈负相关。斯密氏芽孢杆菌与挥发性风味物质异戊酸、D-柠檬烯等呈负相关，与2，3，5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等呈正相关[22]。
3 结论
利用高通量测序技术对湖北保康传统发酵臭豆豉样品测序并按照97%相似性进行OTU 聚类分析和物种分类学分析，确定臭豆豉中的微生物菌群来源于22 个门、48 个纲、83 个目、103 个科、124 个属、137 个种。在门水平上，厚壁菌门细菌占总微生物菌群的97.04%，属于核心优势菌群，在属水平上，芽孢杆菌属占94.39%，为绝对优势菌属，在种水平上，副地衣芽孢杆菌、嗜热淀粉芽孢杆菌、斯密氏芽孢杆菌占比分别为68.83%、19.17%、4.02%，为优势种，与已报道的其他地区臭豆豉存在明显不同。基础风味品质分析结果显示，该豆豉水分含量为51.87%，是一种稀态豆豉。主要风味指标、氨基酸态氮含量符合GB/T 42464—2023要求；利用气相色谱-质谱联用技术从臭豆豉中检出了挥发性风味物质72 种，包括9 种吡嗪类、6 种羧酸类、7 种醇类、18 种酮类、5 种烯烃类、4 种烷烃类、2 种醚类、2 种醛类、7 种酯类、7 种含氮化合物及5 种含硫化合物，其中吡嗪类、酮类和羧酸类化合物相对含量分别为67.35%、10.30% 和5.96%，是挥发性风味成分的主要来源。2，5-二甲基吡嗪、2-丁基-3，5-二甲吡嗪和川芎嗪相对含量分别为19.59%、27.83%和17.61%，是保康传统发酵臭豆豉的特征风味物质，该特征风味物质可能与副地衣芽孢杆菌有关。综上所述，保康传统发酵臭豆豉是一种以副地衣芽孢杆菌为主要菌群的细菌型稀态豆豉，其特征风味物质为2，5-二甲基吡嗪、2-丁基-3，5-二甲吡嗪和川芎嗪，副地衣芽孢杆菌是特征风味物质的关联菌。
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