色素在人们的生活中有着重要地位，它能赋予生物体各种不同的颜色[1-3]。真菌色素是色素的主要来源之一，具有可批量生产、不受环境影响的特点[4-5]，挖掘出更多可产色素的真菌是目前的主要开发方向。可产生色素的真菌种类丰富，例如曲霉属、镰刀菌属、青霉属等真菌[6-8]。但是，产色素真菌具有一个极大缺陷——菌株易退化，菌株退化易导致色素产量降低甚至是不产色素。因此，挖掘出新的可产色素的真菌对于丰富色素来源具有重要意义。
优化真菌发酵产色素的条件，有利于获取更多色素原料进行研究，何亚涛等[9]利用Box-Behnken 试验设计原理优化出产红色素内生真菌RJL03 的最佳发酵条件；卢上飞等[10]以红色素色价为响应值，通过固态发酵优化出三七渣生产红色素的工艺条件；孔菲等[11]以Plackett-Burman 试验结合响应面法进行分析，优化出莱比托泉动性球菌Planococcus rifietoensis 发酵产色素的最佳培养基。
金色毛壳菌（Chaetomium aureum）属于子囊菌门（Ascomycota）、核菌纲（Pyrenomycetes）、粪壳菌目（Sordariales）、毛壳菌科（Chaetomiaceae）、毛壳菌属真菌[12]。研究表明，毛壳菌主要是被用作生防菌来防治各种植物病虫害[13-16]，对于金色毛壳菌可以产生色素的情况鲜有报道，张丰[17]研究发现金色毛壳菌在生长过程中会有红色物质产生。项目组在前期研究发现一株高产色素的金色毛壳菌，因此，本研究采用单因素试验结合响应面优化出该金色毛壳菌发酵产色素的最佳条件，探索金色毛壳菌在不同条件下的色素产生情况，以期为后续金色毛壳菌所产色素的研究和开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源金色毛壳菌：保存于西南林业大学生物化学实验室，菌株号YLHT-2A。
1.1.2 培养基
活化培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L；种子培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L。
1.1.3 材料与试剂
葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、硝酸钠、氯化铵、尿素、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、盐酸、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司；琼脂、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母粉：广东环凯微生物科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.1.4 仪器与设备
恒温培养箱（DHP-9082）：上海一恒科学仪器有限公司；恒温摇床（ZD-85）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；紫外-可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株的活化
将实验室保藏的金色毛壳菌YLHT-2A 菌株接种于活化培养基上，置于30 ℃的恒温培养箱中培养。
1.2.2 种子液的制备
在250 mL 的锥形瓶中装入100 mL 的种子培养基，使用灭菌打孔器打取直径大小一致的金色毛壳菌菌块，每瓶种子液中接种3 块大小相同的菌块，置于30 ℃、120 r/min 的恒温摇床上培养120 h，得到种子液。
1.2.3 发酵培养基配方的筛选
1.2.3.1 不同碳源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
以10 g/L 的蛋白胨为基础培养基中的氮源，分别选用20 g/L 的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖为碳源，依次替换培养基中的碳源，按照接种量8%、装液量100 mL/250 mL、pH 自然、30 ℃、120 r/min的条件培养10 d，在波长510 nm 处检测发酵液的吸光度并将菌丝烘干至恒重测定其生物量[18]。以只添加蛋白胨的培养基为对照，根据不同碳源条件下的色价选择出最佳的碳源，并选取碳源浓度10、15、20、25、30、35 g/L 来进行浓度梯度试验，确定单因素条件下最佳的碳源及其浓度。
1.2.3.2 不同氮源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
以1.2.3.1 中筛选出的最佳碳源为基础培养基中的碳源，分别选用10 g/L 的蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、氯化铵、尿素、硫酸铵为氮源，依次替换培养基中的氮源，筛选出培养基的最佳氮源和浓度，氮源浓度梯度设置为6、10、14、18、22 g/L，培养条件及测定方法同1.2.3.1。
1.2.3.3 不同无机盐对金色毛壳菌发酵产色素的影响
以1.2.3.1 和1.2.3.2 中筛选出的最佳碳源、氮源为基础培养基配方，分别选用浓度为0.10%的磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、磷酸氢二钾和硫酸镁、磷酸氢二钾和氯化钠、磷酸氢二钾和氯化钙、硫酸镁和氯化钠、硫酸镁和氯化钙、氯化钠和氯化钙几种组合添加到培养基中，筛选出培养基的最佳无机盐和浓度，培养条件及测定方法同1.2.3.1。
1.2.4 金色毛壳菌发酵条件的单因素试验
确定最佳培养基成分和浓度后，选取接种量（5%、6%、7%、8%、9%、10%）、装液量（50、75、100、125、150 mL/250 mL）、初始pH 值（4、5、6、7、8、9、10）、发酵时间（2、6、10、14、18、22 d）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）和培养转速（90、120、150、180、210 r/min）进行单因素试验，改变单一条件确定出金色毛壳菌的最佳产色素发酵条件。单因素试验时，除了改变所探究因素，其余条件均设置为接种量8%、装液量100 mL/250 mL、pH 自然、发酵温度30 ℃、培养转速120 r/min、发酵时间10 d，检测发酵液的吸光度并将菌丝烘干至恒重测定其生物量。根据色价的测定公式计算色价，筛选出金色毛壳菌产色素的最佳发酵条件。
1.2.5 Plackett-Burman（PB）试验
根据前期发酵培养基和发酵条件优化的单因素试验结果，选择碳源浓度、氮源浓度、无机盐浓度、装液量、初始pH 值、接种量、发酵时间、发酵温度、培养转速9 个因素进行PB 试验，筛选出对金色毛壳菌发酵产色素影响较大的3 个因素。每个因子选取高低两个水平，高水平一般为低水平的1.25～2.00 倍[19]，以色价为响应值，筛选出对菌株发酵产色素影响较大的因子。PB 试验因素水平见表1。
表1 Plackett-Burman 试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test
因素水平E 初始pH 值G 发酵时间/高水平（1）低水平（-1）A 碳源浓度/（g/L）30 15 B 氮源浓度/（g/L）18 10 C 无机盐浓度/%0.30 0.15 D 装液量/（mL/250 mL）150 75 6 4 F 接种量/%10 6 d6 3 H 发酵温度/℃35 25 J 培养转速/（r/min）180 90
1.2.6 最陡爬坡试验
根据PB 试验筛选出影响显著的因子，针对显著因子进一步设计最陡爬坡试验。通过PB 试验拟合方程系数确定显著影响因子爬坡的方向和步长，其他条件保持一致，设计不同试验组合，逼近最大的响应值范围[20]，根据色价结果选取最佳组合条件，为后续响应面试验的设计确定中心点。
1.2.7 基于Box-Behnken 设计的响应面法
根据最陡爬坡试验的结果确定Box-Behnken 试验的中心点，以此设计三因素三水平的试验方案，分析试验结果，对模型进行回归分析，预测出金色毛壳菌发酵产色素的最优条件。响应面设计因素水平见表2。
表2 响应面设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface design
因素水平F 接种量/%-1 0 1 A 碳源浓度/（g/L）5 10 15 D 装液量/（mL/250 mL）25 50 75 8 9 10
1.2.8 验证试验
根据响应面试验结果优化出来的最佳发酵条件，进行3 次平行验证试验，确定最佳发酵条件。
1.2.9 色价的测定
采用文献[21]的方法测定色价，将不同培养条件下的发酵液置于510 nm 处检测吸光度，同时将不同培养条件下的菌丝烘干至恒重测定其生物量，根据公式计算色价。
E=（A510×n）/m
式中：E 为不同培养条件下的色价，U/g；A510 为不同培养条件下的发酵液在510 nm 处的吸光度；n 为稀释发酵液稀释倍数；m 为菌丝烘干至恒重的生物量，g。
1.3 数据处理
使用Design-Expert 8.0.6 进行响应面设计及分析，Origin 9.1 进行数据处理及图形绘制。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基的配方初步优化结果
2.1.1 碳源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同碳源对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图1。
图1 碳源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.1 The effect of different carbon sources on the pigment production of C.aureum by fermentation
A.不同碳源条件对金色毛壳菌发酵产色素的影响；B.不同浓度的葡萄糖作为碳源对金色毛壳菌发酵产色素的影响。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1A 可知，在不同碳源存在的条件下，金色毛壳菌的色素产生量不一样。当培养基中以葡萄糖为碳源时，菌株产色素的能力最高，色价为3.51 U/g，而以乳糖为碳源时，色价最低，仅为0.66 U/g，说明该金色毛壳菌对于葡萄糖的利用率更高。可能是由于单糖更容易被菌株所吸收，因此选择葡萄糖为金色毛壳菌液体发酵培养基的最佳碳源。
由图1B 可看出，不同浓度的葡萄糖对金色毛壳菌发酵产色素具有明显影响，15 g/L 是葡萄糖最适宜金色毛壳菌产色素的浓度，浓度过高时色素色价反而呈现下降趋势，因此，选择15 g/L 的碳源浓度进行后续发酵产色素的试验。
2.1.2 氮源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同氮源对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图2。
图2 不同氮源对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.2 The effect of different nitrogen sources on the pigment production of C.aureum by fermentation
A.不同氮源条件对金色毛壳菌发酵产色素的影响；B.不同浓度的酵母粉作为氮源对金色毛壳菌发酵产色素的影响。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2A 可知，酵母粉对于菌株发酵产色素的影响最大，可使色素色价达到3.27 U/g，而无机氮源（如氯化铵、硫酸铵）作为氮源不利于菌株的生长，也不利于菌株产生色素。因此，在金色毛壳菌发酵产色素培养基中以酵母粉作为最佳氮源。
由图2B 可知，不同浓度的酵母粉影响着金色毛壳菌发酵产色素情况，当酵母粉浓度为10 g/L 时，色素色价最高，随着浓度的升高色价呈现出下降的趋势，该菌株更适宜在低氮的环境下培养，氮源浓度过高反而抑制色素的产生。因此，选择10 g/L 的氮源浓度进行后续发酵产色素的试验。
2.1.3 无机盐对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同无机盐对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图3。
图3 不同无机盐种类对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.3 The effect of different inorganic salts on the pigment production of C.aureum by fermentation
A.不同无机盐条件对金色毛壳菌发酵产色素的影响；B.不同浓度的磷酸氢二钾作为无机盐对金色毛壳菌发酵产色素的影响。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3A 可知，在培养基中添加磷酸氢二钾有利于发酵产色素，可使色价达到3.79 U/g，若同时添加磷酸氢二钾与硫酸镁或氯化钠等无机盐，反而会使色价降低，这可能是由于两种无机盐之间可能存在互相竞争或抑制，使得菌株不能充分利用营养，导致色价降低。因此，选择磷酸氢二钾作为液体发酵培养基中的最佳无机盐。
由图3B 可知，色素的色价随着磷酸氢二钾浓度的增加呈现先增大后减小的趋势，在浓度为0.10%时色价达到最大值，之后增大浓度，色价开始递减，当磷酸氢二钾浓度超过0.20%后，色价显著降低（P＜0.05）。综上所述，选择0.10%的磷酸氢二钾进行后续发酵产色素的试验。
2.2 发酵条件的优化结果
2.2.1 接种量对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同接种量对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图4。
图4 不同接种量对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.4 The effect of different inoculation amount on the pigment production of C.aureum by fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可看出，色价随着接种量的增加呈现先上升后下降的趋势，当接种量为6% 时，色素色价最高，继续增加接种量，色素色价呈下降趋势。因此，选择6%的接种量进行后续发酵产色素的试验。
2.2.2 装液量对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同装液量对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图5。
图5 不同装液量对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.5 The effect of different liquid volumes on the pigment production of C.aureum by fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，随着装液量的增加，色素色价呈先上升后下降的趋势，装液量为75 mL/250 mL 时，色素色价最高，达到4.47 U/g，且显著高于其他装液量（P＜0.05），因此，选择75 mL/250 mL 的装液量进行后续发酵产色素的试验。
2.2.3 初始pH 值对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同初始pH 值对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图6。
图6 不同初始pH 值对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.6 The effect of different initial pH on the pigment production of C.aureum by fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，随着初始pH 值的升高，色素色价整体呈先上升后下降的趋势，在初始pH 值为6 时，色素色价最高，pH 值过酸或过碱均会影响金色毛壳菌发酵产色素。因此，选择初始pH 值为6 进行后续发酵产色素的试验。
2.2.4 发酵时间对金色毛壳菌产色素的影响
不同发酵时间对金色毛壳菌产色素的影响见图7。
图7 不同发酵时间对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.7 The effect of different fermentation times on the pigment production of C.aureum
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图7 可知，随着发酵时间的延长，色价先逐渐上升，发酵时间为10 d 时，色价达到最大，继续发酵培养，色价反而下降直至趋于平稳。因此，选择10 d 的发酵时间进行后续发酵产色素的试验。
2.2.5 发酵温度对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同发酵温度对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图8。
图8 不同发酵温度对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.8 The effect of different fermentation temperatures on the pigment production of C.aureum by fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图8 可知，随着发酵温度的升高，色素色价变化呈先上升后下降趋势，当发酵温度为25 ℃时，色价达到最大值，随后继续升高温度，色价逐渐降低，这可能是由于过高的温度影响金色毛壳菌的生长，进而影响发酵产色素，当温度达到40 ℃时，由于温度过高，菌株已不能正常生长。因此，选择25 ℃的发酵温度进行后续发酵产色素的试验。
2.2.6 培养转速对金色毛壳菌发酵产色素的影响
不同培养转速对金色毛壳菌发酵产色素的影响见图9。
图9 不同培养转速对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.9 The effect of different rotation speeds on the pigment production of C.aureum by fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图9 可知，随着培养转速的增加，色价逐渐升高，当培养转速为180 r/min 时，色价达到最大，且显著高于其他转速（P＜0.05），而后继续增加培养转速，色价开始逐渐下降。因此，选择180 r/min 的培养转速进行后续发酵产色素的试验。
2.3 PB 试验结果
根据前期优化试验结果，选用“n=11”的PB 设计进行12 组试验，预留2 个空白因素做误差分析，PB 试验组合设计及结果见表3。PB 试验的方差分析结果见表4。
表3 Plackett-Burman 试验设计组合及结果
Table 3 Plackett-Burman test design combination and results
序号C G H J L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A1--1-1 1 1-1 B1 1-1 1-D1-E1 1-F1 1 1--1-1-1-1-1 K1-1 1 1-1 1 1-1 1 1 1-1 1 1-1 1 1--1-1 1 1-1 1 1 1-1 1 1-1 1 1--1-1-1 1-1-1-1 1 1 1--1-1-1-1-1-1 1 1-1 1 1-1 1 1 1-1 1-1 1 1 1-1 1 1-1 1 1-1 1 1-11 12 1 1-1 1 1 1-1 1 1-1 1 1-1 1 1 1-1 1 1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-1 1 1 1-1-1-1-1 1 1 1-1色价/（U/g）0.610 2.500 0.500 0.003 2.020 1.040 0.610 0.720 1.120 0.410 0.500 1.100
表4 Plackett-Burman 试验方差分析
Table 4 Analysis of variance in Plackett-Burman test
注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。
变异来源模型自由度显著性A B C D E F G H J残差9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 11平方和5.43 0.76 0.015 0.74 2.09 0.15 1.10 0.013 0.56 8.67×10-3 0.034 5.47均方0.60 0.76 0.015 0.74 2.09 0.15 1.10 0.013 0.56 8.67×10-3 0.017 F 值35.02 43.97 0.85 43.04 120.98 8.78 63.99 0.77 32.33 0.50 P 值0.028 1 0.022 0 0.454 9 0.022 5 0.008 2 0.097 5 0.015 3 0.473 8 0.029 6 0.551 7*******总和
由表4 可知，试验选取的9 个因素对金色毛壳菌发酵产色素的影响顺序大小为装液量（D）＞接种量（F）＞碳源浓度（A）＞无机盐浓度（C）＞发酵温度（H）＞初始pH值（E）＞氮源浓度（B）＞发酵时间（G）＞培养转速（J）。以色价为响应值，得到一个多元一次回归方程：Y 色价=0.93-0.25A-0.035B+0.25C-0.42D+0.11E+0.30F+0.033G-0.22H-0.027J。其中，碳源浓度、氮源浓度、装液量、发酵温度、培养转速与色素色价呈负效应，而接种量、无机盐浓度、初始pH 值、发酵时间与色素色价呈正效应。选取影响最显著的前3 个因素进行最陡爬坡试验。
2.4 最陡爬坡试验结果
最陡爬坡试验的结果见表5。
表5 最陡爬坡试验设计与结果
Table 5 The steepest climbing test design and results
组合F 接种量/%1 2 3 4 5 A 碳源浓度/（g/L）25 20 15 10 5 D 装液量/（mL/250 mL）125 100 75 50 25 6 7 8 9 10色价/（U/g）0.70 2.33 4.17 10.85 10.61
由表5 可知，组合4 的色价达到最高，因此以组合4 的条件来确定Box-Behnken 设计的中心点。
2.5 基于Box-Behnken 设计的响应面优化结果
以碳源浓度、装液量、接种量为考察因素，色价为响应值，根据最陡爬坡试验确定Box-Behnken 设计的中心点，设计三因素三水平的试验，响应面试验设计及结果见表6。
表6 响应面试验设计及结果
Table 6 Response surface test design and results
序号F 接种量1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 碳源浓度-1 1-1 1-1 1-1 D 装液量-1-1 1 1 0 0 0 0-0 0 0 0-1-1 1 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1-1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0色价/（U/g）12.09 25.40 2.95 4.52 5.18 11.65 5.60 12.73 20.09 4.88 19.08 4.46 6.25 6.38 8.54 7.74 8.57
Box-Behnken 设计试验的方差分析结果见表7。
表7 回归模型方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression model
注：**表示影响极显著（P＜0.01）。
变异来源模型自由A D F AD显著性********AF DF A2 D2**F2 F 值78.30 111.01 489.52 1.02×10-3 37.66 0.12 0.095 0.19 57.74 5.48 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.975 4 0.000 5 0.743 7 0.767 1 0.673 7 0.000 1 0.051 7残差失拟项纯误差总和平方和644.59 101.54 447.78 9.31×10-4 34.45 0.11 0.087 0.18 52.82 5.02 6.40 1.29 5.12 650.99度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方71.62 101.54 447.78 9.31×10-4 34.45 0.11 0.087 0.18 52.82 5.02 0.91 0.43 1.28 0.33 0.802 3
根据表6 设计的试验组合完成试验，利用Design-Expert 8.0.6 软件进行分析，得到以碳源浓度、装液量、接种量为考察因素，色价为响应值的回归方程：Y 色价=7.49+3.56A-7.48D+0.011F-2.93AD+0.16AF+0.15DF+0.20A2+3.54D2+1.09F2。
由表7 可看出该回归模型P＜0.000 1，模型极显著，而失拟项P=0.802 3＞0.05，失拟项不显著，说明该模型可靠性较好，用该回归方程解释各个因素与响应值之间的关系时具有较高的可信度。该回归模型的相关系数R2=0.990 2，表明该回归模型可用于解释99.02%的数据，具有较高的相关性。校正决定系数R2Adj=0.977 5，说明该模型能解释97.75% 的响应值的变化，具有较高的可信度。变异系数（C.V.%）为9.79%，该值可反映模型的置信度，即值越低，表明试验的可靠性越高。综上所述，所优化出来的金色毛壳菌产色素的发酵方法具有较高的可信度。
碳源浓度和装液量的交互作用对金色毛壳菌发酵产色素的影响如图10 所示。
图10 碳源浓度和装液量之间的交互作用对金色毛壳菌发酵产色素的影响
Fig.10 The effect of the interaction between the concentration of carbon source and the amount of liquid on the pigment production of C.aureum
结合方差分析结果，根据图10 的曲面倾斜程度可看出碳源浓度与装液量之间存在极显著交互作用，对金色毛壳菌发酵产色素有极显著影响。
2.6 响应面回归模型验证结果
根据响应面优化结果，得出金色毛壳菌发酵产色素的最佳条件为碳源浓度25.2 g/L、装液量20.76 mL/250 mL、接种量8.75%，最佳发酵条件下的色素色价预测值可达到44.23 U/g。在实际操作中，将试验条件修正为碳源浓度25 g/L、装液量21 mL/250 mL、接种量8.75%、其他发酵条件保持初始条件。在该条件下，进行验证试验，最终3 次重复试验得到金色毛壳菌发酵产色素的色价为39.92 U/g，与预测值符合度较高，优化得到的发酵条件可靠性较好。
3 讨论与结论
本研究对金色毛壳菌发酵产色素的条件进行优化，通过单因素试验和PB 试验确定出碳源浓度、装液量和接种量对金色毛壳菌发酵产色素具有显著影响，通过最陡爬坡试验确定显著影响因素的爬坡方向和步长，最后根据Box-Behnken 设计试验优化出金色毛壳菌发酵产色素的最佳条件为葡萄糖25 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氢二钾0.10%、装液量21 mL/250 mL、接种量8.75%、初始pH6、发酵温度30 ℃、培养转速120 r/min、发酵时间10 d。在最佳发酵条件下色素色价可达到39.92 U/g。
真菌色素的工业化是色素开发利用的关键步骤，优化金色毛壳菌发酵产色素的条件对于色素的应用有重大意义。本研究利用响应面法优化得到金色毛壳菌最佳发酵条件，并经验证具有一定的可靠性，可为后期菌株的应用和工业化生产提供一定的理论依据。
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