绿茶是富含多种活性次级代谢物的未发酵茶，以抗菌、抗氧化及抗癌活性等健康益处而闻名[1-2]。非挥发性代谢物决定了绿茶的功能活性和风味品质[3-4]，其组成及含量会受到农业条件的影响，包括品种、采摘季节、栽培海拔、土壤和气候等[5-7]。茶树大多生长在山区，海拔是影响其代谢的重要农业因素之一，因此栽培海拔对茶叶品质影响很大[8]，但茶农和消费者多倾向于认为高海拔的光温等环境更有利于高品质茶叶的产生[9]。海拔对茶叶生化成分的影响已有报道。倪子鑫等[10]发现周宁高山云雾茶中，黄酮和咖啡碱含量随海拔升高而降低，氨基酸含量先随海拔高度升高而减少，高于一定海拔则增加。张悦等[11]测定了不同海拔烘青绿茶的主要生化成分，其高海拔茶样中游离氨基酸、咖啡碱、儿茶素总量、儿茶素（catechin，C）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）的含量更高，表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）和表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）的含量则相反。Chen 等[12]通过研究不同海拔乌龙茶品质发现，随海拔升高，EC、EGC、ECG 和EGCG 4 种儿茶素单体含量总体呈下降趋势。
涩感是多酚类物质（单宁）与特殊类型的唾液蛋白质（富含脯氨酸的蛋白质）相互作用产生的收敛性，单宁蛋白复合物聚集沉淀导致口腔中的润滑感消失，从而引起口腔的粗糙干燥[13]。茶的收敛性归因于多酚化合物的存在，EC 和EGC 及其酯化物ECG 和EGCG 约占绿茶总多酚化合物的80%，因此被认为是造成茶叶收敛性的主要成分[14]。与其母体儿茶素（EC 和EGC）相比，酸酯衍生物（ECG 和EGCG）具有相对较低的溶解度和较高的收敛性，从而在很大程度上影响茶叶的感官品质和功效[15]。即茶叶中儿茶素的酰基化程度越高，茶叶的收敛性越强。儿茶素的成分和含量因品种、海拔和茶园管理而异[16]，研究表明，海拔500 m 乌龙茶中EGCG 含量高于海拔350 m 的乌龙茶，且EGCG 含量与品质评分呈正相关[8]。另一项研究表明海拔600 m 的红茶中ECG 的含量高于海拔200 m 的红茶，EGCG 的含量分布则相反[17]。Chen等[12]研究同一座山不同海拔采集的乌龙茶，其EGCG 和ECG 含量随栽培海拔的增加而降低，在一定程度上验证了乌龙茶涩味与栽培海拔呈负相关关系。
为探究海拔高度对信阳毛尖茶品质的影响，对其生化成分含量进行比较分析，并结合多元统计分析方法，挖掘不同海拔茶样的特征差异成分，揭示其在海拔间的分布规律，以期为栽培条件的改善和产品品质定位的提升提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以2019 年信阳毛尖茶为研究材料，选取低海拔（＜200 m）茶样7 个，编号L1～L7；高海拔（＞600 m）茶样6 个，编号H1～H6。
C、EC、EGC、ECG、EGCG、没食子酸（gallic acid，GA）、咖啡碱标准品（纯度＞98%）：上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、乙酸（均为色谱纯）：美国Fisher 公司；甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、茚三酮、氯化亚锡、谷氨酸、三氯化铝（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
液相色谱仪（e2695）：美国Waters 公司；紫外分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平（XPR 105）：瑞士梅特勒-托利多国际有限公司；水浴锅（HWS-21）：上海一恒科学仪器有限公司；离心机（TD4C）：常州金坛良友仪器有限公司。
1.3 试验方法
游离氨基酸含量的测定：GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》；黄酮类物质含量的测定：采用三氯化铝比色法；咖啡碱、GA 和儿茶素类组分含量的测定：GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。每个样品重复3 次。
1.4 数据处理
采用Excel 2019 进行数据初步处理，结果采用平均值±标准差表示。采用SPSS 27.0 软件进行显著性分析；TBtools 1.120 绘制热图；SIMCA 14.1 软件进行层次聚类分析（hierarchical clustering an-alysis，HCA）、主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least-square method，PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA），采用随机200 次的置换检验判别模型的有效性和可靠性，变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）大于1 为标准筛选重要变量。
2 结果与分析
2.1 生化成分含量分析
茶树的代谢产物受气温影响，不同海拔高度其茶样中品质成分的组成和比例不同，本研究对不同海拔信阳毛尖茶的主要生化成分进行检测分析，结果见表1。
表1 不同海拔信阳毛尖茶中生化成分含量差异
Table 1 Biochemical components differences in Xinyang Maojian tea at different altitudes
注：*表示两组数据的平均含量存在统计学差异（P＜0.05）。
主要生化成分游离氨基酸咖啡碱黄酮类物质GA C EC EGC ECG EGCG非酯型儿茶素酯型儿茶素儿茶素总量低海拔（＜200 m）含量范围/%3.50～4.90 3.00～4.10 0.50～1.00 0.49～1.09 0.75～3.70 0.47～1.29 0.37～2.81 2.09～3.22 7.65～9.75 4.29～4.85 10.26～12.56 14.69～17.37平均含量/%4.10±0.51 3.56±0.38 0.77±0.16 0.79±0.24 2.13±1.07 0.86±0.26 1.59±0.87 2.58±0.37 8.73±0.75*4.58±0.20*11.31±0.83*15.89±0.87高海拔（＞600 m）含量范围/%2.90～4.80 2.96～4.50 0.60～1.10 0.39～0.97 0.58～1.79 0.51～1.03 1.17～2.99 1.97～3.23 9.14～11.35 3.23～4.46 11.35～14.06 15.34～17.55平均含量/%3.50±0.67 3.64±0.68 0.85±0.21 0.65±0.24 1.06±0.54 0.82±0.18 2.12±0.73 2.46±0.51 10.05±0.96*4.01±0.45*12.51±1.06*16.52±0.81
由表1 可知，不同海拔信阳毛尖茶中游离氨基酸含量介于2.90%～4.90%，咖啡碱含量介于2.96%～4.50%，黄酮类物质含量介于0.50%～1.10%，GA 含量介于0.39%～1.09%。儿茶素总量是C、EC、EGC、ECG和EGCG 5 种儿茶素含量的总和，酯型儿茶素包括ECG 和EGCG，C、EC 和EGC 组成了非酯型儿茶素。儿茶素总量介于14.69%～17.55%，与酯型儿茶素含量均在高海拔茶样中含量更高，非酯型儿茶素则在低海拔含量更高。5 种儿茶素单体在不同海拔间分布趋势不同：低海拔的儿茶素单体含量为EGCG＞ECG＞C＞EGC＞EC，高海拔的儿茶素单体含量为EGCG＞ECG＞EGC＞C＞EC，儿茶素单体在不同海拔间变化趋势并不相同，EGC 和EGCG 在高海拔茶样中含量更高，其他3 种儿茶素单体则相反，儿茶素单体含量的差异最终导致高低海拔间总儿茶素含量差异不显著。统计分析表明，EGCG、非酯型儿茶素和酯型儿茶素含量在不同海拔间呈5% 的显著差异，其他生化成分在不同海拔信阳毛尖茶中均不存在统计学差异（P＞0.05）。
2.2 多元统计分析
2.2.1 基于生化成分的聚类及热图分析
为进一步探究生化成分与不同海拔的关系，以欧式距离采用离差平方和法对信阳毛尖茶的12 种生化成分进行聚类分析，结果见图1。
图1 不同海拔信阳毛尖茶生化成分的层次聚类及热图分析
Fig.1 Hierarchical clustering and heat map analysis of biochemical components of Xinyang Maojian tea at different altitudes
A.层次聚类图；B.热图。
由图1A 可知，当距离小于5 时，茶样被聚分为2 类，第一组为高海拔信阳毛尖茶，第二组为低海拔信阳毛尖茶，因此生化成分含量可以作为区分不同海拔信阳毛尖茶的依据，也能进一步印证海拔高度对成品茶生化成分的含量有重要影响。
除聚类分析外，还通过热图分析来表征不同海拔信阳毛尖茶的差异性。不同海拔信阳毛尖茶的咖啡碱、黄酮类物质和儿茶素类物质等生化成分差异如图1B 所示，可分为3 组。第Ⅰ组包含黄酮类物质、EC、EGC 和非酯型儿茶素，低海拔茶样（L1～L7）含量较高。咖啡碱、EGCG、酯型儿茶素和儿茶素总量组成Ⅱ组，4 种生化成分含量在高海拔茶样中含量更高。第Ⅲ组包含游离氨基酸、GA、C 和ECG，H1～H6 茶样的含量低于L1～L7。整体来看，低海拔信阳毛尖茶的生化成分含量更高。
2.2.2 不同海拔信阳毛尖茶的关键差异成分
不同海拔信阳毛尖茶的多元统计分析结果见图2。
图2 不同海拔信阳毛尖茶的多元统计分析结果
Fig.2 Multivariate statistical analysis results of Xinyang Maojian tea at different altitudes
A.PCA；B.PLS-DA；C.OPLS-DA；D.置换检验200 次结果；E.VIP 图。
基于不同海拔信阳毛尖茶生化成分的含量进行PCA，提取得到2 个主成分，累计方差贡献度为71.7%。由图2A 可知，信阳毛尖茶具有明显的海拔分布特征，其中低海拔茶样分布在两个主成分的正侧，高海拔茶样分布在第一主成分的正侧和第二主成分的负侧。由于PCA 属于无监督分析模式，没有考虑茶样的类别信息，海拔区分不够明显，进而采用有监督的PLSDA 模型，由图2B 可知，不同海拔信阳毛尖茶被明显区分，R2X 为0.763，R2Y 为0.901，Q2 为0.534，通过该模型能成功区分高海拔和低海拔2 组茶样。
OPLS-DA 分析是一种有监督的多变量统计分析方法[18]，用于识别代谢组学数据的光谱特征和代谢物变化等，从而构建易于解释和更高效的数据，为获得更好的分析结果，进一步筛选不同海拔的差异性特征成分，采用OPLS-DA 分析（图2C）。其拟合参数R2X 为0.763，R2Y 为0.901，Q2 为0.62，该模型可以解释76.3%的X 矩阵和90.1% 的Y 矩阵，模型具有62% 的预测能力。低海拔茶样聚集于一、四象限，高海拔茶样聚集于二、三象限，表明特征性生化成分有助于不同海拔信阳毛尖茶的区分。200 次的置换检验有助于判别明该模型的可靠性（图2D），Q2 与Y 轴的截距小于0，表明构建的OPLS-DA 判别模型不存在过度拟合现象，有较好的预测能力（R2=0.429，Q2=-0.936）。通过该模型可以区分不同海拔信阳毛尖茶，并筛选出VIP＞1 的4 种关键生化成分（图2E），包括C、EGCG、非酯型儿茶素和酯型儿茶素。
2.3 儿茶素酰基化程度
为检测不同海拔信阳毛尖茶的儿茶素酰基化程度，计算ECG/（EC+ECG）和EGCG/（EGC+EGCG）的数值[12]，结果见图3。
图3 不同海拔信阳毛尖茶儿茶素的酰基化程度
Fig.3 Degree of catechin galloylation of Xinyang Maojian tea at different altitudes
由图3 可知，儿茶素酰基化程度与栽培海拔无明显关联，低海拔信阳毛尖茶EC 的酰基化程度高于高海拔茶样，低海拔茶样EGC 的酰基化程度更甚，儿茶素类含量差异和高海拔不同茶样间离散度大导致不同海拔间茶样的酰基化差异不明显。
3 讨论与结论
鲜叶是成品茶品质的基础，环境因子在茶树生长发育过程中起重要作用[19]，绿茶的加工不涉及强烈的氧化反应，其品质很大程度上取决于鲜叶的内含成分，因此绿茶品质更容易受到环境影响。温度、湿度和海拔高度等与茶叶品质密切相关[20-23]，如栽培海拔会影响氨基酸、可溶性糖等生化成分的含量，从而对茶叶品质起决定性作用。本研究中低海拔茶样中游离氨基酸含量更高，儿茶素总量、咖啡碱和黄酮类物质则在高海拔茶样中含量更高，与Özdemİr 等[17]、唐颢等[24]研究结果一致。高海拔信阳毛尖茶的儿茶素总量高于低海拔茶样，低海拔茶区大气温度较高，有利于茶树碳代谢的进行，儿茶素类组分和黄酮类物质等成分积累，但绿茶的加工工艺会促使酚类物质发生转化，从而造成低海拔信阳毛尖茶的儿茶素总量低于高海拔茶样[25]。
OPLS-DA 结果能有效判别不同海拔的信阳毛尖茶，并鉴定出C、EGCG、非酯型儿茶素和酯型儿茶素是区分不同海拔信阳毛尖茶的关键差异成分。非酯型儿茶素和酯型儿茶素含量是由表儿茶素没食子酰基转移酶的活性维持的，该酶能在很宽的温度范围内保持活性[26]。Han 等[16]研究庐山的5 个采样点温度随栽培海拔升高而下降，认为茶树表儿茶素没食子酰基转移酶活性随海拔升高而下降，ECG 和EGCG 含量也呈相同趋势且低海拔儿茶素总量更高，低海拔地区温度的升高可能会促进儿茶素的生物合成[27]。本研究中低海拔茶样中C、EC、ECG 和非酯型儿茶素含量更高，而EGC、EGCG、酯型儿茶素和儿茶素总量在高海拔茶样中含量更高，与前人研究结果有部分差异[12，16]。本研究结果与其他观测结果之间的差异可能是由于品种、栽培海拔和地理位置等方面的差异造成的。
Chen 等[12]研究表明没食子酰基化程度与栽培海拔呈负相关，即随着栽培海拔增加，茶叶中总儿茶素含量的减少使茶汤的涩味减轻。但其茶样是在海拔200、800、1 300 m 处收集的，所在地的气候条件尤其是温度可能会影响儿茶素的酰基化程度。本研究中EGCG、非酯型儿茶素和酯型儿茶素在不同海拔间差异显著，其它儿茶素单体无显著差异，因此造成不同海拔信阳毛尖茶的儿茶素没食子酰基化程度虽然不同，但无显著差异。本研究中没食子酰基化程度未与栽培海拔呈负相关，推测是因为研究对象为成品茶而非鲜叶和茶汤[11，15]，儿茶素在加工过程中发生了转化。
本研究从成品茶的角度入手探讨海拔高度差异对茶叶品质的影响，研究分析获得的特征性差异化合物为鉴别不同海拔信阳毛尖茶提供了科学依据。本研究有助于提高人们对不同海拔信阳毛尖茶生化成分分布的科学认知，为后续茶叶品质提升研究提供理论基础。
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