五味子为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果实，五味子性温味酸、甘，具有收敛固涩、益气生津的传统功效[1]。现代研究表明，五味子具有抗氧化、抗衰老、保肝和调节免疫等多种药理活性[2]，在医疗和保健领域具有广泛的应用价值。国内外对于五味子成分的研究主要集中在木脂素、有机酸、挥发油、多糖等生物活性成分上，并且这些活性成分主要分布在五味子果肉中。
蛋白质是组成人体的一切细胞、组织的重要成分。近年来，植物蛋白对人体健康具有重要的生理调节作用，因其具有抗氧化、抗菌、降血压以及增强免疫功能等多种生物活性而得到广泛关注。研究表明，五味子蛋白具有优良的抗氧化和抗疲劳活性[3-4]，但由于蛋白质属于生物大分子，空间结构复杂，被人体摄入后不易消化吸收，难以有效发挥其营养价值。因此可以通过酶促降解蛋白使其变为小分子肽类物质达到改性目的。研究表明，蛋白质适度酶解对于蛋白质的生物活性和功能特性有明显的改善作用，使其分子量明显降低，柔性增加，能够更快地展开并在分子之间相互作用[5-6]。
预试验初步研究表明，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对其酶解效果和抗氧化活性较好。本研究应用以上两种蛋白酶对五味子蛋白进行酶解，对其抗氧化活性和功能特性研究，以期为增加五味子蛋白及其酶解产物的附加值并为其在健康产品中的应用提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
五味子：吉林省长春中医药大学附属医院，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]干燥成熟的果实；标准蛋白Marker、福林酚试剂、邻啡罗啉（邻二氮菲）、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、维生素C（抗坏血酸）、还原型谷胱甘肽（均为分析纯）、5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DNTB]、三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）试剂盒、牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝R-250、菲洛嗪（Ferrozine）：美国Sigma 公司。
1.2 仪器与设备
Infinite M200 PRO 酶标仪：瑞士TECAN 公司；MS303S 千分之一分析天平、AL204 万分之一分析天平、AB135-S 十万分之一分析天平、S220-K-CN 标准型pH 计：梅特勒-托利多仪器有限公司；PowerPacTMHC蛋白电泳仪：美国伯乐公司；Infinite M200 PRO 酶标仪：瑞士TECAN 公司；UV-2550 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；S82-2 磁力搅拌器：上海志威电器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅：常州佳美仪器制造有限公司；SCIENTZ-50F 真空冷冻干燥机：宁波新芝冻干设备股份有限公司；Sorvall LYNX 高速离心机：美国Thermo Fisher 公司；SU8010 型高分辨场发射扫描电子显微镜：日本HITACHI 公司。
1.3 方法
1.3.1 五味子蛋白酶解产物的制备
将五味子浸泡过夜，去果肉，粉碎后经石油醚脱脂12 h，依据文献[6]的方法制备五味子蛋白，将其配制成5%溶液，分别加入酶底比为2%的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，调pH 值分别为7 和6，分别于60 ℃和50 ℃恒温水浴摇床酶解，酶解过程中每隔30 min 分别调pH 值至7 和6，维持pH 值不变，酶解3 h，结束后于100 ℃沸水浴灭酶10 min，冷却后于4 ℃离心（10 000 r/min，20 min），上清液冷冻干燥，-20 ℃保存备用。
1.3.2 水解度的测定
水解度是蛋白质在水解过程中发生裂解的肽键数与底物中蛋白质所含总肽键数的比值，采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定总氮含量。采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法测定氨基酸态氮含量。水解度（degree of hydrolysis，DH）的计算公式如下。
式中：H 为水解度，%；A 为酶解液中氨基酸态氮含量，g；B 为酶解液中游离氨基酸态氮含量，g；C 为酶解液中总氮含量，g。
1.3.3 扫描电子显微镜分析
运用导电双面胶将充分冷冻干燥后的五味子蛋白及两种酶解产物的上清液冻干粉均匀平铺在金属样品台上，经真空镀金器中镀金后，在电压为20 kV、压力为15 Pa 低真空模式下，将金属样品台置于扫描电子显微镜中扫描拍照观察其表面形态。
1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，SDSPAGE）
制备质量浓度为5 mg/mL 的两种五味子蛋白酶解产物，8 000 r/min 离心10 min，将上清液与上样缓冲液按体积比1∶1 混匀，沸水浴5 min 后冷却，每个泳道上样量为10 μL，分别使用浓度为5%和12%聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶进行SDS-PAGE ，浓缩胶和分离胶的电压和时间分别设置为70 V、30 min 和140 V、50 min。结束电泳后采用考马斯亮蓝R-250 室温摇床染色1 h，脱色液脱色数次后使用凝胶成像仪扫描成像[7]。
1.3.5 Tricine-SDS-PAGE
两种五味子蛋白酶解产物的Tricine-SDS-PAGE采用试剂盒说明书的方法，采用16.5%分离凝胶、10%夹层胶和4%浓缩胶。上样量为10 μL，30 V 电泳1 h，然后在100 V 电压操作4～6 h 至溴酚蓝到达分离胶底端。考马斯亮蓝R-250 染色1 h，脱色液脱色数次，直到条带清晰，背景透明，凝胶成像分析。
1.3.6 巯基（—SH）和二硫键
称取20 mg 五味子蛋白酶解产物上清液冻干粉样品，溶于10 mL 含8 mol/L 尿素的Tris-Gly 缓冲液中，测定—SH。然后加入50 μL 的Ellman 试剂（DNTB 溶于0.1 mol/L Tris-Gly 缓冲液中）。混合分散液在25 ℃避光孵育30 min，8 000 r/min 离心10 min。收集上清液，于412 nm 处测定其吸光度。同时以含有Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白。总巯基含量测定：取20 mg 五味子蛋白及其两种酶解产物样品分散于10 mL 含8 mol/L尿素的Tris-Gly 缓冲液中，随后加入2-巯基乙醇100 μL。然后将这些分散液在25 ℃孵育30 min。孵育后，向分散液中加入12%三氯乙酸10 mL 沉淀蛋白，8 000 r/min 离心10 min。沉淀用12%三氯乙酸10 mL 洗涤3 次，离心除去2-巯基乙醇。沉淀蛋白用10 mL Tris-Gly 缓冲液溶解，加入50 μL Ellman 试剂显色[8]。测定412 nm处的吸光度[9]。巯基和二硫键含量按下列公式计算。
式中：B 为巯基含量，μmol/g；E 为二硫键含量，μmol/g；A412 为样品的吸光度；D 为上清液稀释倍数；C为五味子蛋白酶解肽浓度，mg/mL；F 为总巯基含量，μmol/g；G 为游离巯基含量，μmol/g。
1.3.7 自由基清除能力
1.3.7.1 羟基自由基清除能力
通过邻二氮菲法对·OH 清除活性进行测定，样品组加入0.75 mmol/L 邻二氮菲溶液1 mL 和0.2 mol/L磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液2 mL，随后加入1 mL 浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 和2.5 mg/mL 的两种五味子蛋白酶解产物的样品溶液，混匀后加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL，立即混匀，最后加入1 mL 0.025% H2O2 溶液，混匀，VC 和谷胱甘肽（glutathione，GSH）为阳性对照组，37 ℃水浴1 h，于536 nm吸收波长处测其吸光度，空白对照组以1 mL 蒸馏水代替样品溶液，样品对照组以1 mL 蒸馏水代替0.025% H2O2溶液，依据以下公式计算两种酶解产物对·OH 清除率。
式中：A 为羟基自由基清除率，%；A0 为空白对照组吸光度；A1为样品组吸光度；A2为样品对照组吸光度。
1.3.7.2 DPPH 自由基清除能力
在若干支具塞试管中加入2 mL 两种酶解产物水溶液，再加入2 mL 浓度为0.04 mg/mL 的DPPH 溶液，涡旋混匀。于暗处避光反应30 min，结束后517 nm 处测定吸光度，样品对照组将DPPH 溶液替换为2 mL 甲醇，空白对照组将两种酶解产物溶液换为2 mL 蒸馏水。以VC 和GSH 为阳性对照组[10]。通过以下公式计算其清除率。
式中：A 为DPPH 自由基清除率，%；A0 为空白对照组吸光度；A1 为样品组吸光度；A2 为样品对照组吸光度。
1.3.7.3 ABTS+自由基清除能力
用去离子水配制浓度为7.4 mmol/L ABTS 溶液和2.6 mmol/L 的过硫酸钾溶液，将2.5 mL ABTS 储备液与44 μL 过硫酸钾混匀作为工作液，4 ℃避光静置12～16 h，使用前用0.01 mol/L pH7.4 PBS 溶液稀释至734 nm处吸光度在0.7±0.2，作为空白对照组的吸光度。将0.2 mL ABTS 工作液与10 μL 不同浓度的两种五味子蛋白酶解产物样品溶液混匀，室温下避光放置10 min，于波长734 nm 处测定吸光度[11]。通过以下公式计算ABTS+自由基清除能力。
式中：A 为ABTS+自由基清除率，%；A0 为空白对照组吸光度；A1 为样品组吸光度。
1.3.8 还原能力
1.3.8.1 Fe2+螯合能力
取96 孔板，向100 μL 不同浓度的两种五味子蛋白酶解产物中加入50 μL 1.3 mmol/L FeCl2·4H2O 溶液后，室温孵育30 min，然后加入50 μL 0.1 mmol/L Ferrozine 溶液。样品对照组以100 μL 蒸馏水代替样品溶液，以VC 和GSH 为阳性对照，对562 nm 处的吸光度进行测定[12]。Fe2+螯合能力计算公式如下。
式中：A 为Fe2+螯合能力，%；A0 为样品对照组吸光度；A1 为试验组吸光度。
1.3.8.2 Fe3+还原能力
取1 mL 不同质量浓度的两种五味子蛋白酶解产物于具塞试管中，分别加入2.5 mL 浓度为0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液和1.0% 铁氰化钾溶液，涡旋均匀后于50 ℃保温20 min，冷却，加入10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，离心（3 000 r/min，10 min），取上清液2.5 mL，分别加入2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 0.1% 三氯化铁，充分混匀，以蒸馏水做空白调零，于700 nm 处测定吸光度，样品对照组以2.5 mL 蒸馏水代替样品溶液，以VC 和GSH 为阳性对照[13]。Fe3+还原能力通过以下公式计算。
A=A1-A2
式中：A 为Fe3+还原能力；A1 为样品组吸光度；A2为样品对照组吸光度。
1.3.9 功能特性
1.3.9.1 溶解度（solubility property，SP）
在蒸馏水中配制1%质量浓度的蛋白质分散体，酸碱度和离子浓度分别调至2～10 和0.1～1.0 mol/L，磁力搅拌器室温搅拌蛋白质分散体2 h，离心（5 000 r/min，20 min），以牛血清白蛋白作标准曲线，福林酚法测定蛋白酶解产物含量[14]。蛋白酶解产物溶解度根据以下公式计算。
式中：S 为溶解度，%；W1 为上清液中多肽含量，%；W2 为样品中多肽含量，%。
1.3.9.2 持水性（water holding capacity，WAC）
参考文献[15]的方法，准确称取两种五味子蛋白酶解产物样品0.5 g 记m，空离心管质量记m1，蛋白样品放入离心管中，加入酸碱度和离子浓度分别为2～10 和0.1～1.0 mol/L 溶液10.0 mL。涡旋混匀，静置30 min后离心（5 000 r/min，20 min），弃上清液，离心管质量记m2。蛋白酶解产物的持水性根据以下公式计算。
式中：W 为持水性，%；m0 为样品质量，g；m1 为样品+离心管质量，g；m2 为持水后样品+离心管质量，g。
1.3.9.3 持油性（oil holding capacity，OAC）
参考文献[16]的方法，准确称取0.5 g 两种五味子蛋白酶解产物样品记m，空离心管质量记m1，蛋白样品放入离心管中，加大豆油10.0 mL，涡旋混匀，分别置于5、25、45、65、85 ℃条件下静置30 min 后离心（5 000 r/min，20 min），弃大豆油层，离心管质量记m2。蛋白的持油性根据以下公式计算。
式中：O 为持油性，%；m 为样品质量，g；m1 为样品+离心管质量，g；m2 为持油后样品+离心管质量，g。
1.3.9.4 乳化性（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（emulsifying stability index，ESI）
参考文献[17]的方法，去离子水配制5%两种五味子蛋白酶解产物溶液，将样品溶液酸碱度和离子浓度分别调节至2～10 和0.1～1.0 mol/L，离心管中加蛋白酶解产物溶液20 mL，40 ℃水浴振荡20 min，离心管中加20 mL 大豆油，混匀，均质机均质（10 000 r/min，3 min），记乳浊液体积V0、乳化层体积V1；乳浊液80 ℃水浴30 min，冷却至室温，离心（2 000 r/min，5 min），记剩余乳化层体积V2。以下两个公式分别计算不同pH 值和盐离子浓度的乳化性和乳化稳定性。
式中：E1 为乳化性，%；E2 为乳化稳定性，%；V0 为乳浊液体积，mL；V1 为乳化层体积，mL；V2 为水浴30 min后剩余乳化层体积，mL。
1.3.9.5 起泡性（foaming capacity，FC）和泡沫稳定性（foaming stability，FS）
用去离子水配制1%蛋白酶解产物溶液，将样品溶液酸碱度和离子浓度分别调节至2～10 和0.1～1.0 mol/L，离心管中加样品溶液15 mL，记体积V0。均质机均质（10 000 r/min，2 min），测起泡后总体积V1，静置30 min，测起泡后静置30 min 后总体积V2[18]。不同pH 值和离子强度下的起泡性和泡沫稳定性分别利用以下两个公式计算。
式中：F1 为起泡性，%；F2 为泡沫稳定性，%；V0 为样品初始体积，mL；V1 为起泡后体积，mL；V2 为起泡后静置30 min 后体积，mL。
1.4 统计分析
以上所有试验至少重复3 次，所得数据使用Origin 2021 和Excel 2021 进行分析，结果表示为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 水解度的测定结果
用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解五味子蛋白，水解度结果见图1。
图1 两种酶解产物的水解度
Fig.1 Degree of hydrolysis of two enzymolysis products
由图1 可知，中性蛋白酶酶解后水解度明显优于木瓜蛋白酶，在两种酶的作用下，五味子蛋白水解度随着酶解时间的延长而增加，酶解3 h 时水解度增长速度趋于平缓，此时中性蛋白酶酶解产物和木瓜蛋白酶酶解产物水解度分别为25.49% 和16.55%，因此将酶解3 h 作为水解的最适酶解时间，后续试验均采用水解3 h 的五味子蛋白上清酶解液冻干粉。
2.2 扫描电子显微镜分析结果
应用扫描电子显微镜观察五味子蛋白和两种酶解产物的表面形态见图2。
图2 五味子蛋白和两种酶解产物的扫描电子显微镜分析
Fig.2 Scanning electron microscope analysis of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
A.五味子蛋白；B.木瓜蛋白酶酶解产物；C.中性蛋白酶酶解产物。
由图2 可知，五味子蛋白经两种不同蛋白酶酶解后，表面形态和松散程度存在差异。两种酶解产物采用沸水灭酶，由于蛋白酶将蛋白酶解，消除了高温对蛋白质结构的影响，并抑制了残余的蛋白酶活性。同时，五味子蛋白的形态呈现出不规则的片状和条状，碎片表面相对光滑，可能是由于碱溶液提取引起，并且片状结构在空间中呈现出多层弯曲的状态，有利于其发生折叠进而形成纹理，增强吸附性，这也可能是其持水性最好的原因之一。五味子蛋白经两种不同蛋白酶酶解后，产生不同程度的碎片和条状结构，并且木瓜蛋白酶的酶解产物中存在部分较大的片状结构，可能由于其酶解效果低于中性蛋白酶，且在电泳中木瓜蛋白酶酶解后的分子量高于中性蛋白酶。中性蛋白酶酶解产物呈现出细小的无规则碎片结构，这与李泓颉等[19]研究的亚麻籽蛋白经蛋白酶处理后产生的结果相似，分子量相对较小，酶解效果相对较好，使更多的亲水基团暴露，二硫键含量低于五味子蛋白和木瓜蛋白酶酶解产物，相对松散。
2.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
五味子蛋白两种酶解产物分子量的情况见图3。
图3 五味子蛋白及其两种酶解产物的SDS-PAGE 和Tricine-SDSPAGE 图
Fig.3 SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE of Schisandra chinensis protein and its two enzymolysis products
A.SDS-PAGE；B.Tricine-SDS-PAGE。泳道M 为标准蛋白质Marker，泳道1、3、5 为还原性条件五味子蛋白、木瓜蛋白酶酶解产物、中性蛋白酶酶解产物；泳道2、4、6 为非还原性条件五味子蛋白、木瓜蛋白酶酶解产物、中性蛋白酶酶解产物。
SDS-PAGE 通常用于蛋白质的分子量和亚基组成分析，利用电泳图可以观察到五味子蛋白的分子量及其酶解产物分子量的变化情况。如图3 可知，五味子蛋白经酶解后分子量明显降低，相比木瓜蛋白酶酶解产物，中性蛋白酶产物分子量更低，说明中性蛋白酶酶解效果更好。在非还原性条件下，五味子蛋白分子量集中于12.0～45.0 kDa，分别为12.0、34.0、36.0、45.0 kDa；木瓜蛋白酶酶解产物分子量集中于9.0～47.0 kDa，分别为9.0、13.0、24.0、35.0、38.0、47.0 kDa；中性蛋白酶酶解产物分子量较低，集中于8.0～38.0 kDa，分别为8.0、20.0、23.0、34.0、38.0 kDa。在还原性条件下，五味子蛋白分子集中于6.5～47.0 kDa，分别为6.5、19.0、32.0、35.0、47.0 kDa；木瓜蛋白酶酶解产物分子量集中于9.0～47.0 kDa，分别为9.0、13.0、24.0、33.0、47.0 kDa；中性蛋白酶酶解产物分子量较低，集中于8.0～38.0 kDa，分别为8.0、20.0、35.0 kDa。在还原性条件下，五味子蛋白处于35.0 kDa 处的亚基增多，木瓜蛋白酶酶解产物19.0、32.0 kDa 条带变深，中性蛋白酶酶解产物在20.0 kDa 条带颜色变深，而条带颜色的加深，可能是因为在还原性条件下，添加了β-巯基乙醇，分子量大的五味子蛋白及其酶解产物亚基中的二硫键断裂，使蛋白质分子发生降解，迁移率增加，产生分子量小的亚基，使处于还原性条件下的五味子蛋白亚基迁移率变大[20]。还原性电泳和非还原性电泳证实了二硫键的存在，变化程度的大小反映了二硫键数目的多少。
2.4 巯基和二硫键含量
巯基和二硫键可以发挥维持蛋白分子空间结构的重要作用，因此可以通过测定巯基和二硫键的含量来揭示蛋白质的结构状态。两种酶解产物巯基和二硫键含量见图4。
图4 五味子蛋白和两种酶解产物的巯基和二硫键含量
Fig.4 Sulfydryl and disulfide bond content of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
如图4 可知，与五味子蛋白相比，两种酶解产物游离巯基含量均增加，其中中性蛋白酶酶解产物二硫键含量最小，为15.07 μmol/g，在扫描电子显微镜中表现出更小的碎片，进而使其溶解性最优；木瓜蛋白酶酶解产物二硫键含量为20.69 μmol/g；五味子蛋白二硫键含量最高为21.41 μmol/g。在蛋白质分子中，二硫键含量影响着蛋白质的空间结构及功能性质，二硫键含量高的蛋白质更有利于发生折叠进而形成纹理结构，这可能是导致五味子蛋白在扫描电子显微镜中表现出多层弯曲的片状结构的原因之一。
2.5 自由基清除能力测定结果
2.5.1 羟基自由基清除能力
五味子蛋白及其酶解产物的羟基自由基清除能力见图5。
图5 五味子蛋白和两种酶解产物的羟基自由基清除能力
Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
·OH 是生物细胞内反应活性最强的氧族自由基，·OH 会严重损伤生物大分子，进而引起细胞发生凋亡、坏死或突变，导致机体损伤[21]。如图5 所示，随着样品浓度的增加，其羟基自由基清除率也逐渐增加，当浓度达到1.5 mg/mL 时，五味子中性蛋白酶酶解产物清除率最高，为61.84%，可能是因为五味子经中性蛋白酶酶解后产生的多肽具有更小的分子量，小分子量易与自由基结合。因此，中性蛋白酶具有相对优良的·OH 清除活性。
2.5.2 DPPH 自由基清除能力
五味子蛋白和两种酶解产物的DPPH 自由基清除能力见图6。
图6 五味子蛋白和两种酶解产物的DPPH 自由基清除活性
Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
DPPH·清除能力表明抗氧化化合物提供电子或氢的能力，从而将自由基转化为更稳定的种类。以VC 和GSH 作为阳性对照，由图6 可以看出，五味子蛋白经两种蛋白酶酶解后对DPPH·清除能力明显提升，当样品浓度在0.1～2.5 mg/mL 范围时，五味子蛋白及其酶解产物的DPPH 自由基清除率伴随样品浓度的升高而增加，且中性蛋白酶酶解产物清除效果最优，0.1～1.5 mg/mL 浓度时提升较快而1.5～2.5 mg/mL 浓度时趋向于平缓。样品浓度为2.5 mg/mL 时，五味子中性蛋白酶酶解产物DPPH·清除率为79.46%。表明五味子蛋白酶解产物，尤其是中性蛋白酶酶解产物，可作为一种良好的DPPH 自由基清除剂。
2.5.3 ABTS+自由基清除能力
五味子蛋白和两种酶解产物的ABTS+自由基清除能力见图7。
图7 五味子蛋白和两种酶解产物的ABTS+自由基清除能力
Fig.7 ABTS+radical scavenging activity of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
清除ABTS+自由基的能力是总抗氧化能力的重要体现[22]，如图7 所示，样品浓度在0.1～2.5 mg/mL 范围内，五味子蛋白及其酶解产物的ABTS+自由基清除率与其样品浓度呈正相关，随着样品浓度的升高而升高，浓度为0.1～1.5 mg/mL 时提升较快，而浓度为1.5～2.5 mg/mL 时趋向于平缓，在浓度为1.5 mg/mL 时，五味子中性蛋白酶酶解产物对ABTS+自由基清除率最大，为69.82 mg/mL。五味子中性蛋白酶酶解产物ABTS+自由基清除率明显高于木瓜蛋白酶酶解产物（除浓度为1.0 mg/mL 外）和五味子蛋白，可能中性蛋白酶的水解度高，与五味子反应速率更快，酶解效果好，导致暴露出更多的氨基酸残基，并且五味子经中性蛋白酶酶解后产生更多有利于清除自由基的肽段，使中性蛋白酶酶解产物具有较强的自由基清除能力，可作为一种潜在的抗氧化剂。
2.6 还原能力测定结果
2.6.1 Fe2+螯合能力结果
五味子蛋白及其酶解产物对亚铁离子的螯合能力见图8。
图8 五味子蛋白和两种酶解产物的亚铁离子螯合能力
Fig.8 Ferrous ion chelating ability of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
过渡态的金属离子（例如Fe2+和Cu2+）是生成自由基的强力剂，可以催化活性氧的生成，促进氧化反应的进行，造成肌体的氧化衰老。而还原剂可以通过螯合金属离子，间接阻止自由基的形成，从而达到抗氧化的目的[23]。如图8 所示，五味子蛋白及两种酶解产物对亚铁离子均具有一定的螯合能力，当样品浓度为0.1～2.5 mg/mL 范围时亚铁离子螯合率随着样品浓度的增加而增加，样品浓度为1.0 mg/mL 时，五味子木瓜蛋白酶酶解产物螯合率最大，为24.22%。五味子蛋白经酶解后，对Fe2+螯合能力增强，并且木瓜蛋白酶酶解产物螯合能力优于中性蛋白酶，可能是由于五味子蛋白经木瓜蛋白酶酶解后肽键的断裂暴露出了更多的酸性和碱性氨基酸，这样侧链的羧基和氨基可以结合Fe2+。肽的金属离子螯合能力可以与带电荷的氨基酸残基之间发生静电作用来实现，也可以在结构上通过对过渡态金属离子的俘获作用完成[24]，中性蛋白酶可能这种相互作用能力较弱，导致Fe2+螯合能力的低于木瓜蛋白酶。因此，木瓜蛋白酶酶解产物可以通过螯合金属离子来间接发挥抗氧化活性，是一种潜在的还原剂。
2.6.2 Fe3+还原能力结果
五味子蛋白及其酶解产物的Fe3+还原能力见图9。
图9 五味子蛋白和两种酶解产物的铁离子还原能力
Fig.9 Ferric ion reducing ability of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
有机化合物的还原活性与抗氧化性之间存在着一定的相关性，抗氧化剂可以通过自身的还原作用给出电子而使自由基结合形成稳定的惰性物质[25]，从而失去活性，其还原能力的测定可以作为一个重要的指标，可以用来评价其潜在的抗氧化能力[26]。如图9 所示，当样品浓度为2.5 mg/mL 时，木瓜蛋白酶酶解产物对Fe3+的还原能力最强，为1.27，中性蛋白酶酶解产物的还原能力低于木瓜蛋白酶。因此，木瓜蛋白酶酶解产物对Fe3+的还原能力更强，可能由于其螯合过渡态的金属离子能力优于中性蛋白酶酶解产物，是一种良好的还原剂，通过还原作用来间接达到抗氧化作用。
2.7 功能特性测定结果
2.7.1 溶解度
五味子蛋白及其酶解产物的溶解度见图10。
图10 五味子蛋白和两种酶解产物的溶解度
Fig.10 Solubility of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
溶解度可以作为蛋白质结构的聚集程度和变性的评价指标，蛋白质功能性质（乳化能力、凝胶特性、起泡性能等）与其溶解性相关。如图10 所示，酶解产物溶解度明显高于五味子蛋白，可以看出在同一pH 值下，中性蛋白酶酶解产物溶解性大于木瓜蛋白酶酶解产物，可能是因为中性蛋白酶解效果更好，形成更小分子量的肽，而小分子肽类物质可能含有更多的极性基团，与水作用形成氢键，从而提升其溶解性，这与刘丽莉等[27]研究的鸡蛋清卵白蛋白结果相似。所有样品在pH4 时溶解性最低，可能是因为pH4 时为等电点，由于靠近等电点的蛋白质表面电荷降低，导致静电斥力不足，从而蛋白出现聚集絮凝沉淀现象，所以导致溶解度变低。而后随pH 值逐渐增大，溶解性也随之增大，木瓜蛋白酶酶解产物和中性蛋白酶酶解产物在pH 值为10 时溶解性最大，分别为69.45%和83.46%。由此可见，中性蛋白酶酶解产物在保健食品中的应用具有更大的应用价值。
2.7.2 持水性
五味子蛋白及其酶解产物的持水性见图11。
图11 五味子蛋白和两种酶解产物的持水性
Fig.11 Water holding capacity of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
持水性是指在施加外力的条件下形成水基胶体后捕获和固定水的能力。如图11 所示，五味子蛋白经酶解后持水性降低，这可能与酶解产物的溶解性较高有关，经酶解后溶解性提升，酶解产物的分子量降低，降低了对水的物理截留能力，酶解产物的持水性随之降低。当pH4 时五味子蛋白及两种酶解产物持水性均最低，可能是处于等电点处的总电荷为0，缔合和收缩的蛋白质呈现最低的水化和膨胀；而后随着pH 值的增大持水性也整体随之变大，当pH10 时木瓜蛋白酶酶解产物持水性大于中性蛋白酶酶解产物，分别为1.46% 和0.84%，可能是因为当pH 值远离等电点时，酶解物以离子形式存在，蛋白溶胀性能和黏度增加，持水性增强，与安兆祥等[28]研究黑木耳蛋白的结果相似。
2.7.3 持油性
五味子蛋白及其酶解产物的持油性见图12。
图12 五味子蛋白和两种酶解产物的持油性
Fig.12 Oil holding capacity of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
持油性是指吸收脂肪的能力，对加工过程中产品对油脂成分的吸收和保持产生影响，有利于产品风味的改善和提升。如图12 可以看出，经酶解后持油性明显上升，木瓜蛋白酶酶解产物在45 ℃处持油性最大，为4.51%，而后持油性随着温度的升高而降低，在85 ℃持油性最低，为3.84%，木瓜蛋白酶酶解产物对高温耐受能力差，使其结构变得致密，蛋白易发生聚集，颗粒变大，破坏其网状结构，使其物理包覆能力降低，蛋白质的吸附能力减弱，降低其持油性，中性蛋白酶酶解产物持油性随温度的升高持续增加，可能由于随着温度的升高，中性蛋白酶酶解产物的氨基酸残基侧链的亲脂性结合位点增加。表明在低温条件下，木瓜蛋白酶酶解产物可以作为一种良好的持油剂，但是在高温条件下，中性蛋白酶更适用于肉糜制品的油脂乳化。
2.7.4 乳化性和乳化稳定性
五味子蛋白及其酶解产物的乳化性及乳化稳定性见图13。
图13 五味子蛋白和两种酶解产物的乳化性和乳化稳定性
Fig.13 Emulsification and emulsion stability of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
由图13 可知，相比木瓜蛋白酶酶解产物，中性蛋白酶酶解产物乳化性更好，可能是由于五味子蛋白经中性蛋白酶酶解后形成更多的小分子肽，一些暴露的亲油基团对油脂分子的吸收能力增强，乳浊体系随之快速形成，从而使乳化性增强。在pH4 时，两种酶解产物及五味子蛋白乳化性均最低，可能是由于pH 值为4 是等电点，这与高盼等[29]研究的核桃分离蛋白结果相似。同时，在pH4 时乳化稳定性最低，随着pH 值的增大，乳化稳定性也随之增大，在pH10 处达到最大的乳化性和乳化稳定性，可能是静电作用力把油分子吸到一侧从而阻碍了运动，使乳化稳定性随之提高。因此，中性蛋白酶酶解产物因其优良的乳化性和乳化稳定性在食品配料蛋白中具有更高的应用价值。
2.7.5 起泡性及泡沫稳定性
五味子蛋白及其酶解产物的起泡性及泡沫稳定性见图14。
图14 五味子蛋白和两种酶解产物的起泡性和泡沫稳定性
Fig.14 Foaming and foam stability of Schisandra chinensis protein and two enzymolysis products
如图14 所示，在同一pH 值下，起泡性和泡沫稳定性依次为中性蛋白酶酶解产物＞木瓜蛋白酶酶解产物＞五味子蛋白，中性蛋白酶酶解产物起泡性最优。在pH4 时起泡性和泡沫稳定性最低，可能是在pH4处为等电点，在等电点处溶解度降低，使分散在溶液中的蛋白质变少，导致起泡性和泡沫稳定性降低，而后随着pH 值的增大起泡性和泡沫稳定性也随之增大，在pH 值为10 时达到最大，木瓜蛋白酶酶解产物分别为239%和94.12%，中性蛋白酶酶解产物分别为261%和98.66%，高于孙乐常等[30]研究的蓝圆鲹分离蛋白研究结果。因此，中性蛋白酶酶解产物更适合作为食品生产中的发泡成分，更适用于不同食品的发泡剂。
3 结论
本研究应用两种不同蛋白酶对五味子蛋白酶解，分析比较了五味子蛋白酶解前后的抗氧化活性，结果表明，相比于木瓜蛋白酶，中性蛋白酶的酶解效果更优，使其酶解后相对分子量显著下降。还原型电泳和非还原型电泳证实了二硫键存在，扫描电镜证实了空间结构的不同，结构的变化进一步影响其抗氧化活性和功能特性。以五味子蛋白为参照，适度的酶解可以提升其抗氧化活性，中性蛋白酶酶解产物主要通过提升清除自由基能力达到优良的抗氧化活性，木瓜蛋白酶酶解产物通过提升其亚铁离子螯合能力进一步提升还原能力来达到间接的抗氧化活性。并且本研究分析比较了五味子蛋白酶解前后的功能特性，结果表明，适度的酶解可以提升其功能特性。五味子蛋白经酶解处理后，溶解性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性均提高，呈现出先降低后增加的趋势，并且中性蛋白酶酶解产物有着更好的功能特性，表明五味子蛋白中性蛋白酶酶解产物在乳化剂和起泡剂方面具有良好的应用前景。综上所述，本研究为五味子资源的开发利用和五味子蛋白及其附属酶解产物在食品工业和功能性抗氧化健康食品中的应用提供一定的理论参考。
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