新质生产力的探索与创新正成为功能食品产业提升品质与营养价值、满足健康需求、促进可持续发展的核心动力。苹果，不仅因为其美味的风味而受到赞誉，也因为其所含的多种维生素和矿物质而赢得了各地消费者的青睐。中国作为全球最大的苹果生产国，却面临一个实际问题：相比于其生鲜销售，加工制成的苹果制品（例如苹果汁酒、苹果发酵醋或苹果干等）在市场上所占的份额相对较小[1]。尽管如此，苹果业务的迅猛扩展和市场的日渐饱和，加之加工技术的局限性，已经导致市场供应过剩，这一现象给果农的收入带来了不小的压力。因此，为提升商品价值和满足消费者需求，开发创新的苹果加工技术变得尤其紧迫。
作为食品工艺领域的一项前沿技术，高温发酵处理（high temperature fermentation process，HTFP）已经在提升黑蒜、黑枸杞和黑荞麦等食品的营养和健康特性方面显示了较大潜力。以黑蒜为例，HTFP 处理技术不仅显著改善了其外观和风味，更重要的是，它显著提高了黑蒜中的抗氧化成分，如S-丙基半胱氨酸和多酚类化合物的含量。此外，HTFP 处理还降低了黑蒜中的抗营养因子，从而增强了其营养的生物可利用性和消化吸收效率，对心脏和血管健康带来了积极的影响[2]。乳酸菌在HTFP 过程中发挥着核心作用，它们通过产生有机酸和细菌素等代谢产物来拮抗病原体，对食品的保鲜和增加功能性具有不可忽视的传统食品加工价值[3]。因此，HTFP 与乳酸菌的结合为延长食品的保质期及增强其健康效益提供了一种有效手段。
本研究旨在全面评估高温发酵处理（HTFP）对苹果品质及风味的综合影响，通过深入分析苹果的颜色、糖分、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）、酶活性、总酚含量、总黄酮含量、抗氧化活性以及挥发性化合物的定量变化，揭示HTFP 作用下苹果品质与风味的演变规律，以期为乳酸菌在黑苹果加工过程中的应用提供坚实的科学基础，也为创新功能性食品的开发提供重要的理论支撑，同时为黑苹果的制作工艺优化及其在食品产业中的广泛应用开辟新的研究视角。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果样品为静宁苹果（‘长富二号’），果径80 mm以上，无病虫害，无机械损伤。初始阶段，选取未经处理的苹果作为参照样本。随后，将苹果彻底清洗并接种活性乳酸菌，进行24～48 h 的基础发酵。接着在设定的温度范围（50～90 ℃）及相对湿度（50%～90%）条件下，对苹果进行长达90 d 的持续发酵。在发酵初期（10～30 d）、发酵中期（30～60 d）和发酵后期（60～90 d）取出苹果样本进行后续分析。
福林酚、芦丁、2，6-二氯靛酚（纯度均≥98.0%）、水溶性维生素E（Trolox）、Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-tripyridyl-triazine，TPTZ，纯度≥98.0%）、铁离子还原/抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power assay，FRAP）、2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻嗪-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：美国Sigma 生物科技有限公司；葡萄糖、果糖、亚硝酸钠、乙醇、过氧化氢、氯化铝、蔗糖、六水氯化铁、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸亚铁、丙酮、Tris-HCl 缓冲液、邻苯三酚、水杨酸（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）测试盒、过氧化物酶（peroxidase，POD）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）测试盒：苏州梦犀生物医药科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9003 电加热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；CR-400 色度计：日本柯尼卡美能达公司；HH-2 恒温水浴锅：山东赫维生物科技股份有限公司；BL-2200H 电子天平：浙江百捷仪器有限公司；UV2400紫外可见分光光度计：上海仪天科学仪器有限公司；TGL-22S 高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；ICS-3000 离子色谱仪（配有脉冲安培检测器）：美国Dionex公司；FlavourSpec®气相色谱-离子迁移谱联用仪：德国GAS 公司。
1.3 测定方法
1.3.1 色泽测定
使用色度计测定样品的L*值、a*值和b*值，进行5 次平行测量[4]。根据以下公式计算ΔE 值。
式中：ΔL 为明度变化值，代表测试样品L*值与鲜样样品L0*值之差；Δa 为红绿色度变化值，代表测试样品a*值与鲜样样品a0*值之差；Δb 为黄蓝色度变化值，代表测试样品b*值与鲜样样品b0*值之差；ΔE 值越小，越接近于鲜样的颜色。
1.3.2 糖含量的测定
还原糖（蔗糖、果糖、葡萄糖）的含量通过离子色谱仪-脉冲安培检测器（ion chromatography with pulsed amperometric detection，IC-PAD）检测[5]。离子色谱仪用于样品测定，CarboPacPA10 保护柱（50 mm×4 mm，10 μm）和分析柱（250 mm×4 mm，10 μm）用于分离。洗脱模式：0.15 mol/L NaOH，0～12 min；0.1 mol/L NaOH，12.1～17.0 min；0.15 mol/L NaOH，17.1～22.0 min。流速为1.0 mL/min，柱温设置为30 ℃。
1.3.3 5-HMF 含量的测定
参考Chen 等[6]的研究方法并稍作调整。首先对样品溶液进行过滤（0.22 μm 有机滤膜），通过色谱柱（4.6 mm×250 mm，30 ℃）进样10 μL，流动相为甲醇（15%）+超纯水（85%），流速为1.2 mL/min。标准曲线y=4.730 2x-1.274 5，R²=0.999 9。于波长284 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。
1.3.4 酶活性检测
使用PPO、POD、SOD、PAL 测试盒测定PPO、POD、SOD 和PAL 的酶活性[7]。
1.3.5 总酚含量
按照Tran 等[8]的研究方法并稍作调整。首先称取苹果样品1 g（鲜样2 g），溶解于80%乙醇（20 mL）中，经过超声浓缩20 min。然后分别加入浓缩液1.5 mL、福林酚1 mL、7.5% Na2CO3 2.5 mL、蒸馏水6 mL，进行充分搅拌，放入水浴（42 ℃）中加热20 min，最后于765 nm处测定吸光值，重复试验3 次。
1.3.6 总黄酮含量
参考Osae 等[9]、张卫平等[10]的研究方法并稍作调整。首先吸取浓缩液1.5 mL，然后混合铝盐（10%）0.3 mL、NaNO2（5%）0.3 mL、1 mol/L NaOH 2 mL、蒸馏水4 mL，使用蒸馏水定容至10 mL，最后以芦丁作为标准样品来制备标准曲线，于510 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。
1.3.7 总抗氧化活性的测定
1.3.7.1 FRAP
参考Ma 等[11]的研究方法，稍作调整。首先吸取苹果样品提取液（120 mg/L）25 μL，然后加入FRAP 工作液2 mL、蒸馏水2 mL，水浴（37 ℃）加热15 min，最后用水溶性维生素E 作标样，绘制标准曲线，于593 nm处测吸定光值，重复试验3 次。
1.3.7.2 DPPH 自由基清除率
将100 μL 的苹果样品溶液与2.9 mL 的0.2 mmol/L DPPH/无水乙醇溶液混合，避光10 min，于517 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。DPPH 自由基清除率（N1，%）的计算公式如下[11]。
N1=[1-（A2-A1）/A0]×100
式中：A1 为样品和DPPH 溶液混匀测定的吸光值；A2 为样品和无水乙醇混匀测定的吸光值；A0 为未添加样品的DPPH 溶液和无水乙醇混匀测定的吸光值。
1.3.7.3 ABTS+自由基清除率
将5.0 mL 浓度为10 mmol/L ABTS 溶液中加入88 μL 浓度为140 mmol/L 过硫酸钾溶液，37 ℃避光静置过夜。将100 μL 的苹果样品溶液加入4.0 mL ABTS稀释液，避光静置7 min，于734 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。ABTS+自由基清除率（N2，%）的计算公式如下[11]。
N2=（A0-A1）/A0×100
式中：A0 为空白组的吸光值；A1 为加入样品后的吸光值。
1.3.8 羟自由基清除率的测定
参考Angeli 等[12]的研究方法，稍作调整。首先吸取样液1.5 mL，然后加入硫酸亚铁（4.5 mmol/L）1.5 mL、水杨酸-乙醇溶液（4.5 mol/L）1.5 mL、H2O2（10 mmol/L）1.5 mL 和蒸馏水10 mL，放入水浴（37 ℃）中加热25 min，于510 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。羟自由基清除率（N3，%）的计算公式如下。
N3=[A0-（AX-AX0）/A0]×100
式中：AX 为加入样品后的吸光值；A0 为空白组的吸光值；AX0 为未添加H2O2 时的吸光值。
1.3.9 超氧阴离子自由基清除率的测定
参考邢颖等[13]提出的研究方法，稍作调整。首先吸取Tris-HCl 缓冲液（50 mmol/L）4.6 mL、蒸馏水4.5 mL，放入水浴（37 ℃）中加热25 min，然后加入样液1.5 mL、邻苯三酚（3 mmol/L）0.5 mL，混合均匀后每30 s 于325 nm 处测定吸光值，重复试验3 次。超氧阴离子自由基（N4，%）的计算公式如下。
N4=（A0-A）/A0×100
式中：A0 为邻苯三酚的吸光值；A 为加入总酚样液后邻苯三酚的吸光值。
1.3.10 挥发性物质测定
采用气相色谱-离子迁移谱联用仪（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）检测样品挥发性物质[14]。
1.3.10.1 样品处理方法
在20 mL 顶空瓶中准确称取发酵样品1 g（鲜样2 g），待孵育15 min 后进样，重复试验3 次。
1.3.10.2 顶空进样条件
孵化温度50 ℃；进样体积500 μL；不分流进样；孵化转速500 r/min；进样针温度85 ℃。
1.3.10.3 气相色谱（gas chromatography，GC）条件
色谱柱的温度为60 ℃，使用高纯度（99.999%）氮气作为载气。升压程序：初始时流量为2.0 mL/min，在2 min 内保持不变；在8 min 内按线性方式增加到10.0 mL/min；在10 min 内按线性方式增加到100.0 mL/min。色谱运行时间20 min；进样口温度80 ℃。
1.3.10.4 离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）条件
电离源为氚源（3H）；迁移管长度53 mm；电场强度500 V/cm；迁移管温度45 ℃；漂移气为纯度高于99.999%的氮气；流速150 mL/min；正离子模式。
1.4 统计分析
统计分析使用Microsoft Excel 2016 和SPSS 19.0软件，图表绘制使用Origin 2021 软件。所有试验都重复3 次。
2 结果与分析
2.1 高温发酵处理对苹果品质的影响
2.1.1 色泽
制作黑苹果的过程涉及一连串复杂的化学变化，在特殊的潮湿高温环境中主要通过非酶化学反应，特别是美拉德反应，使苹果表面颜色深化。高温发酵处理对苹果外观的影响如图1 所示，对苹果色泽的影响如图2 所示。
图1 高温发酵处理对苹果外观的影响
Fig.1 Effect of high temperature fermentation treatment on appearance of apples
图2 高温发酵处理对苹果色泽的影响
Fig.2 Effect of high temperature fermentation treatment on color of apples
不同小写字母表示组内差异显著（p＜0.05）。
由图1 可知，苹果在经过一段时间的热处理后，表皮颜色逐渐从浅棕转为深棕乃至黑色。这种颜色的转换可能来自累积的类黑素和焦糖化等。与此同时，苹果的质地由发酵初期的硬实质感变得柔软，并出现特有的表面皱褶，到发酵后期形成了既黏稠又富有弹性的质地。
由图2 可知，苹果的ΔL 值（亮度值）在发酵初期有明显的下降趋势，从发酵初期（10 d）的36.31±0.31下降至发酵后期的27.77±1.31，这表明苹果从鲜艳的红色渐变为深棕。Δa 值（红绿色值）先增加后急剧降低，最终降至1.74±0.84，这表明随着发酵的进行红色素逐步转变成其他种类的色素。Δb 值（黄蓝值）则持续减少，从发酵初期（10 d）的17.09±0.57 降至发酵后期（90 d）的0.26±0.60，突显了黄色化学物质变成深棕色成分的过程。整体色彩变化量ΔE 值从29.07±1.04增加到50.11±0.93，不仅说明苹果颜色变深的程度增加，也显示出产品外观品质的提升，这符合生产过程中所追求的目标。根据Najman 等[15]、Nadafzadeh 等[16]的相关研究，苹果色泽的改变是由多种因素综合作用的结果，包括水分的流失、酶类和非酶类的化学反应、微生物的作用以及环境的温湿条件等，正是这些因素的相互作用促使了黑苹果独有的颜色和口味的形成。
2.1.2 糖含量
高温发酵处理对苹果糖含量的影响如图3 所示。
图3 高温发酵处理对苹果糖含量的影响
Fig.3 Effect of high temperature fermentation treatment on sugar content of apples
不同小写字母表示组内差异显著（p＜0.05）。
由图3 可知，新鲜苹果的甜味主要源自含量较高的果糖，含量达到（207.41±0.41）mg/g DM，同时伴随有葡萄糖[（158.99±0.30）mg/g DM]以及适量的蔗糖[（132.16±0.37）mg/g DM]。发酵期间的苹果样品中蔗糖含量大幅下降，最低为（6.64±0.78）mg/g DM，其下降归因于蔗糖逐步分解成果糖和葡萄糖。然而，这两种糖的含量在发酵初期（10 d）略有增加，但最终呈下降趋势。发酵后期（90 d）的苹果样品中果糖和葡萄糖浓度降至（77.04±0.58）mg/g DM 和（24.75±0.73）mg/g DM，相反，还原糖的浓度则明显上升至（409.36±0.64）mg/g DM。这些变化是由酶活动[17]、微生物代谢[18]、糖代谢及环境等[19]因素综合作用的结果，这不仅影响黑苹果的甜度，还对其整体口味和质感产生了决定性的作用。
2.1.3 5-羟甲基糠醛含量
在高温条件下，5-羟甲基糠醛（5-HMF）对于控制食品加工过程中的色泽和风味具有重要意义。高温发酵处理对苹果5-HMF 含量的影响如图4 所示。
图4 高温发酵处理对苹果5-HMF 含量的影响
Fig.4 Effect of high temperature fermentation treatment on 5-HMF content of apples
不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图4 可知，随着发酵时间的延长，5-HMF 含量呈现出逐渐增长的趋势。在发酵初期（10 d）5-HMF 含量从（0.19±0.09）mg/g DM 迅速增加到发酵后期（90 d）的峰值水平[（16.21±0.36）mg/g DM]。这可能是高温环境加快了美拉德反应的速率，同时高湿条件激发微生物活性，两者共同作用，提升了苹果中糖类及其他前体物质的转化效率，从而影响了5-HMF 的生成[6]。
2.1.4 酶活性
在苹果的发酵过程中，SOD、PPO、POD 和PAL 等关键酶通过催化酚类化合物，引导合成和氧化反应，对形成苹果特有的棕黑色素起着至关重要的作用。高温发酵处理对苹果酶活性的影响如图5 所示。
图5 高温发酵处理对苹果酶活性的影响
Fig.5 Effect of high temperature fermentation treatment on activity of apple enzymes
不同小写字母表示组内差异显著（p＜0.05）。
由图5 可知，发酵初期（10 d）的苹果中SOD 酶活性迅速升高，达到一定高峰后逐渐下降，表明发酵初期苹果的自由基增多，增加了色素生成。在发酵5 d的苹果中多酚氧化酶（PPO）酶活性达到峰值，这可能与酚类化合物的初步氧化有关。随后PPO 酶活性的下降可能是由于酚类化合物的消耗或转化。过氧化物酶（POD）酶活性的稳定性表明苹果在高温发酵条件下仍具有较强的抗氧化活性。苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性在发酵初期迅速上升，随后下降，表明苹果在应对氧化压力时，增强了酚类化合物的合成，从而促进了色素的形成。这些结果与Wu 等[20]、Zhu等[21]的研究结果类似，揭示了苹果在发酵过程中通过调节氧化保护机制和色素沉淀的复杂相互作用来实现酶活性的变化。
2.1.5 总酚和总黄酮含量
在高温处理过程中，苹果的褐变现象与酶活性和苹果内部的总酚和总黄酮含量密切相关。高温发酵处理对苹果总酚和总黄酮含量的影响如图6 所示。
图6 高温发酵处理对苹果总酚和总黄酮含量的影响
Fig.6 Effect of high temperature fermentation treatment on total phenolics and total flavonoids content of apples
不同小写字母表示组内差异显著（p＜0.05）。
由图6 可知，在苹果发酵过程中，总酚含量先降至（2.65±0.17）mg/g DM，随后上升至（7.11±0.21）mg/g DM，这意味着高温处理后黑苹果的总酚含量比新鲜苹果提高了约1.45 倍。发酵初期（10 d）的苹果总酚含量下降可能由于酚类物质的氧化或降解，而发酵中后期（30～90 d）的苹果总酚含量的增加则可能归因于高温湿润环境促进了新酚类化合物的形成[22]。与此同时，苹果内的总黄酮含量呈现下降趋势，这可能是由于乳酸菌发酵过程中产生的代谢物促进黄酮类物质的溶解和释放，导致总黄酮含量减少[23]。
2.1.6 不同干燥方式对苹果抗氧化活性的影响
通过FRAP、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率以及对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率等多项指标进行定量分析，探究高温发酵处理对黑苹果抗氧化活性的影响，结果如图7 所示。
图7 高温发酵处理对苹果抗氧化活性的影响
Fig.7 Effect of high temperature fermentation treatment on antioxidant activity of apples
不同小写字母表示组内差异显著（p＜0.05）。
由图7 可知，高温处理的黑苹果的抗氧化活性明显优于新鲜苹果。苹果的DPPH 自由基清除率从发酵初期（10 d）的（2.28±1.75）%逐渐增加发酵后期的（41.30±1.62）%，与多酚含量的增加趋势一致，表明多酚类化合物在抵御氧化应激中发挥了重要作用。ABTS+自由基的清除能力也有类似的提升，到发酵后期（90 d）达到了（68.36±2.63）%，是新鲜苹果的近10 倍。FRAP 值同样随着发酵过程的进行而增加，最终达到（181.12±2.52）μmol Trolox/g DM，约为新鲜苹果的8 倍，特别是在非酶催化的褐变反应后期，这种增长尤为显著。尽管在发酵初期（10 d）超氧阴离子自由基的清除率有所下降，但随着发酵的进行，其清除率最终上升至（84.35±2.13）%。这种显著的抗氧化效果可能归因于高温高湿的发酵环境，这为微生物的生长和代谢活动提供了有利条件，从而促进了抗氧化分子如多酚、维生素和抗氧化酶的合成，显著提升了黑苹果的抗氧化活性[9，12]。
2.2 高温发酵处理对苹果挥发性物质的影响
2.2.1 指纹图谱比对分析
通过对不同苹果样品的挥发性物质进行指纹图谱分析，揭示发酵过程中香气成分的变化情况。高温发酵苹果的挥发性物质指纹图谱如图8 所示。
图8 高温发酵苹果的挥发性物质指纹图谱
Fig.8 Fingerprints of volatiles from high-temperature fermented apples
图下1～11 表示离子迁移谱数据库未检索到挥发性物质；图中1～6 为物质划分区域编号。
由图8 可知，鲜样样品（A）展现出最丰富的挥发性物质种类和含量，而发酵初期（B，10 d）和发酵中期（C，60 d）样品之间的差异较不大，发酵后期（D，90 d）的挥发性物质种类差异明显。结果表明，图中1 号区域物质是鲜样和高温发酵苹果（B、C、D）共有的挥发性香气成分，主要包括乙醇、2-甲基-1-丁醇（单体、二聚体、多聚体）、异戊醛（单体、二聚体）等；图中2 号区域包含了鲜样中特有的高浓度香气成分，主要包括酯类（2-甲基丁酸甲酯、乙酸异丁酯、丁酸丙酯、乙酸戊酯、壬酸甲酯等）、醇类（正戊醇、3-甲基-1-戊醇等）和醛类[（E）-2-庚烯醛]等，这些成分在发酵过程中逐渐减少。图中3～6 号区域是苹果在发酵过程中新生成的挥发性化合物，其中3 号区域物质主要包括糠醛（单体、二聚体）、丙酮、2-丁酮等；4 号区域物质在发酵初期（B，10 d）中浓度最高，主要包括己醛（二聚体）、苯乙酸甲酯、3-羟基-2-丁酮、苯甲醛等；5 号区域物质在发酵中期（C，60 d）中浓度最高，主要包括苯乙醛、正辛醛等；6 号区域物质在发酵后期（D，90 d）中浓度最高，主要包括3-戊酮、异丙硫醇、丙醛、丁醛、羟基丙酮、乙酸甲酯、3-甲基-2-丁醇、二甲基二硫、丁酸（单体、二聚体）、3-甲基-2-丁烯醛、2-乙酰基呋喃（单体、二聚体）、异戊醛（单体、二聚体）、反式-2-壬烯醛等。这些变化与黑苦荞[24]、黑蒜[25]、黑枣粉[26]、黑枸杞[27]等的研究结果类似，可能是由于高温加速了酶促反应和美拉德反应，增加了产品中的醛类和游离氨基酸含量，从而促进了苹果高温处理后挥发性风味物质种类增加，并通过各风味物质的相互作用形成了独特的风味特征。
2.2.2 挥发性物质的定性分析
利用GC-IMS 技术对苹果样品中挥发性组分进行测定，结果如表1 所示。
表1 高温发酵的苹果挥发性物质GC-IMS 定性分析
Table 1 GC-IMS characterization of apple volatiles from high temperature fermentation
挥发性物质相对含量/%组分CAS 号分子式备注1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C4H8O2 C4H8O2单体二聚体单体二聚体单体二聚体单体二聚体11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26酯类乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸丁酯乙酸丁酯2-甲基丁基乙酸酯2-甲基丁基乙酸酯2-甲基丁酸甲酯2-甲基丁酸甲酯乙酸异丁酯丁酸异戊酯乙酸丙酯乙酸戊酯乙酸戊酯苯乙酸甲酯异戊酸丁酯异戊酸丁酯2-甲基丁酸丁酯2-甲基丁酸丁酯丙酸丁酯丙酸丁酯2-甲基丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯正己酸乙酯正己酸乙酯丁酸己酯乙酸甲酯C141786 C141786 C123864 C123864 C624419 C624419 C868575 C868575 C110190 C106274 C109604 C628637 C628637 C101417 C109193 C109193 C15706737 C15706737 C590012 C590012 C7452791 C7452791 C123660 C123660 C2639636 C79209 C6H12O2 C6H12O2 C7H14O2 C7H14O2 C6H12O2 C6H12O2 C6H12O2 C9H18O2 C5H10O2 C7H14O2 C7H14O2 C9H10O2 C9H18O2 C9H18O2 C9H18O2 C9H18O2 C7H14O2 C7H14O2 C7H14O2 C7H14O2 C8H16O2 C8H16O2 C10H20O2 C3H6O2保留时间/s 148.59 147.37 287.94 286.93 367.95 370.05 251.57 250.07 246.97 711.49 199.01 424.06 424.65 1 000.21 632.76 629.84 679.94 681.09 415.45 412.85 327.83 326.82 590.83 591.99 985.18 126.70 A（鲜样）0.81a 0.48a 0.95a 0.53a 0.96a 0.59a 0.92a 0.61a 0.94a 0.58a 0.02c 0.55a 0.03d 0.25b 0.78a 0.71a 0.87a 0.78a 0.75a 0.08c 0.67a 0.87a 0.78a 0.50a 0.15bc 0.83a B（发酵初期）0.02c 0.12c 0.02b 0.19b 0.01b 0.17b 0.02b 0.07c 0.01b 0.13b 0.39a 0.04c 0.43a 0.17c 0.15b 0.09b 0.04b 0.04c 0.06c 0.08c 0.09c 0.04b 0.06c 0.17b 0.18b 0.02c C（发酵中期）0.02c 0.06d 0.01b 0.07c 0.01b 0.11b 0.02b 0.11c 0.01b 0.14b 0.31b 0.04c 0.31b 0.15c 0.03c 0.08b 0.04b 0.05c 0.02c 0.16b 0.12b 0.04b 0.03c 0.16b 0.13c 0.02c D（发酵后期）0.13b 0.33b 0.01b 0.19b 0.01b 0.11b 0.02b 0.19b 0.02b 0.13b 0.27bc 0.35b 0.20c 0.41a 0.02c 0.10b 0.03b 0.11b 0.15b 0.67a 0.15b 0.04b 0.12b 0.15b 0.52a 0.11b---单体二聚体-单体二聚体单体二聚体单体二聚体单体二聚体单体二聚体--
续表1 高温发酵的苹果挥发性物质GC-IMS 定性分析
Continue table 1 GC-IMS characterization of apple volatiles from high temperature fermentation
挥发性物质相对含量/%组分CAS 号分子式备注27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76酯类单体二聚体--单体醛类二聚体单体二聚体-单体二聚体单体二聚体单体二聚体单体二聚体单体二聚体-单体二聚体-单体二聚体醇类-------单体二聚体-单体二聚体多聚体单体二聚体酮类丁酸甲酯丁酸甲酯壬酸甲酯乙酸丙酯丁酸丙酯丁酸丙酯（E）-壬烯醛（E）-2-己烯醛（E）-2-己烯醛（E）-2-庚烯醛反-2-辛烯醛正己醛正己醛糠醛糠醛2-己烯醛2-己烯醛2-甲基丁醛2-甲基丁醛苯乙醛异戊醛异戊醛3-甲基-2-丁烯醛5-甲基呋喃醛5-甲基呋喃醛苯甲醛丁醛壬醛正辛醛丙醛正庚醇正己醇正戊醇正戊醇正丙醇2-甲基-1-丁醇2-甲基-1-丁醇2-甲基-1-丁醇异丁醇异丁醇异丙硫醇3-甲基-1-戊醇3-甲基-2-丁醇乙醇羟基丙酮2-丁酮3-戊酮甲基庚烯酮3-羟基-2-丁酮丙酮C623427 C623427 C1731846 C109604 C105668 C105668 C18829566 C6728263 C6728263 C18829555 C2548870 C7452791 C7452791 C98011 C98011 C505577 C505577 C96173 C96173 C122781 C590863 C590863 C107868 C620020 C620020 C100527 C123728 C124196 C124130 C123386 C111706 C111273 C137326 C616251 C71238 C137326 C137326 C137326 C78831 C78831 C75332 C589355 C598754 C64175 C116096 C78933 C96220 C110930 C513860 C67641 C5H10O2 C5H10O2 C10H20O2 C5H10O2 C7H14O2 C7H14O2 C9H16O C6H10O C6H10O C7H12O C8H14O C7H14O2 C7H14O2 C5H4O2 C5H4O2 C6H10O C6H10O C5H10O C5H10O C8H8O C5H10O C5H10O C5H8O C6H6O2 C6H6O2 C7H6O C7H6O C9H18O C8H16O C3H6O C7H16O C6H14O C5H12O C5H10O C3H8O C5H12O C5H12O C5H12O C4H10O C4H10O C3H8S C6H14O C5H12O C2H5O C3H6O2 C4H8O C5H10O C8H14O C4H8O2 C3H6O保留时间/s 208.98 207.87 1098.11 200.39 397.26 393.91 922.28 324.30 322.28 502.88 705.66 272.38 269.52 314.27 313.03 335.92 335.45 177.67 175.18 679.17 167.70 166.59 243.00 519.81 518.89 509.25 145.26 786.33 606.36 120.39 543.34 357.21 240.88 241.91 131.69 220.61 219.78 219.51 157.15 158.01 131.41 329.30 187.09 112.02 178.87 142.49 180.45 567.69 198.45 117.01 A（鲜样）0.64a 0.30a 0.20b 0.49a 0.90a 0.64a 0.22b 0.82a 0.64a 0.51a 0.42a 0.84a 0.15b 0.01d 0.03b 0.95a 0.67a 0.45a 0.13c 0.18b 0.30a 0.18b 0.08c 0.02c 0.01d 0.23ab 0.15b 0.25b 0.54a 0.95a 0.43a 0.90a 0.87a 0.53a 0.74a 0.65a 0.27a 0.68a 0.91a 0.44a 0.12b 0.94a 0.12c 0.92a 0.05c 0.05c 0.09c 0.65a 0.17b 0.80a B（发酵初期）0.07c 0.23a 0.15c 0.19b 0.01b 0.05c 0.20b 0.05b 0.16b 0.28b 0.21b 0.06b 0.34a 0.19c 0.27ab 0.01b 0.13b 0.23b 0.42a 0.31a 0.18b 0.33a 0.14c 0.07bc 0.11c 0.31a 0.04c 0.21b 0.15b 0.02b 0.07b 0.03b 0.06b 0.22b 0.08b 0.12b 0.26a 0.11b 0.02b 0.19b 0.15b 0.01b 0.09c 0.02b 0.11c 0.35a 0.11c 0.12b 0.26ab 0.07b C（发酵中期）0.06c 0.29a 0.16c 0.18b 0.02b 0.03c 0.22b 0.06b 0.11b 0.13c 0.19b 0.02b 0.22b 0.33b 0.35a 0.01b 0.11b 0.11c 0.27b 0.37a 0.16b 0.33a 0.25b 0.12b 0.29b 0.24ab 0.05c 0.36a 0.14b 0.02b 0.09b 0.03b 0.03b 0.14bc 0.08b 0.16b 0.30a 0.15b 0.02b 0.21b 0.21b 0.01b 0.22b 0.03b 0.30b 0.45a 0.28b 0.13b 0.24ab 0.06b D（发酵后期）0.20b 0.16b 0.49a 0.12b 0.05b 0.26b 0.34a 0.05b 0.07b 0.06c 0.16b 0.02b 0.27b 0.45a 0.33a 0.01b 0.07b 0.20b 0.16c 0.12b 0.34a 0.14b 0.51a 0.77a 0.58a 0.20b 0.74a 0.16c 0.15b 0.01b 0.38a 0.02b 0.02b 0.10c 0.09b 0.05c 0.14b 0.04c 0.03b 0.14b 0.50a 0.02b 0.55a 0.03b 0.52a 0.12b 0.49a 0.09b 0.32a 0.05b----------
续表1 高温发酵的苹果挥发性物质GC-IMS 定性分析
Continue table 1 GC-IMS characterization of apple volatiles from high temperature fermentation
注：-表示苹果样品中挥发性物质是其原始形态，没有形成任何单体或二聚体等聚合体。同行不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
挥发性物质相对含量/%保留时间/s 组分CAS 号分子式备注77 78 79 80 81 82酸类C4H8O2 C4H8O2单体二聚体萜烯类脂肪族硫化合物杂环类丁酸丁酸α-萜品烯α-萜品烯二甲基二硫2-乙酰基呋喃C107926 C107926 C99865 C99865 C624920 C1192627 C10H16 C10H16 C2H6S2 C6H6O 250.06 250.26 589.44 588.47 224.77 420.64 A（鲜样）0.16b 0.85a 0.72a 0.86a 0.29a 0.08c B（发酵初期）0.07b 0.05b 0.07b 0.04b 0.30a 0.05c C（发酵中期）0.13b 0.04b 0.09b 0.04b 0.18b 0.16b D（发酵后期）0.61a 0.04b 0.10b 0.04b 0.21b 0.69a----
由表1 可知，高温发酵对苹果挥发性物质的种类与含量产生了明显的影响，共鉴定出93 种挥发性香气化合物，其中82 种为已知化合物，包含了酯类化合物32 种、醛类化合物24 种、醇类化合物14 种、酮类化合物6 种、酸类化合物2 种、萜烯类化合物2 种以及杂环类和脂肪族硫化合物各1 种。
在苹果发酵过程中酶解作用和微生物的代谢显著地重塑了果实内部的化学组成。从表1 可以看出，酯类（占比34.41%）和醇类（占比15.05%）化合物的浓度显著变化，而醛类（占比25.81%）、酮类（占比6.45%）、酸类和萜烯类化合物的浓度变化较小。特别是酯类和醇类化合物在发酵过程中的总体水平呈现下降趋势。然而，在发酵过程中，某些特定化合物的浓度表现出独特的变化趋势。例如，丙酸丁酯的二聚体、异丙硫醇以及3-甲基-2-丁醇等化合物的浓度随着发酵的进行而逐渐增加。另一方面，乙酸丙酯和乙酸戊酯的二聚体浓度则呈现出先增加后减少的波动性，而丁酸己酯的浓度变化则更为复杂，先是上升，随后下降，最终再次上升。这些化合物对苹果发酵过程中香味的形成极为关键，且其浓度变化与微生物的代谢活动密切相关。随着发酵时间的延长，醛和酮类物质的多样性及其含量也有所增加，例如（E）-壬烯醛、正己醛（二聚体）、糠醛、甲基-2-丁烯醛以及几种呋喃醛、羟基丙酮、2-丁酮、3-戊酮和3-羟基-2-丁酮等，这些具有显著风味特性的化合物可能通过微生物代谢途径影响黑苹果的感官品质。在发酵初期（10 d），某些酸类物质如丁酸的相对含量高，可能与有机酸的积累过程有关。尽管萜烯类、脂肪族硫化合物和杂环类化合物在总量中所占比例较小，但在发酵的特定阶段，它们对整体风味的贡献可能极为重要。这些发现与葡萄[28]、辣椒[29]、西瓜[30]等的研究结果相似，表明不同微生物产生的挥发性化合物各有差异，而长期的发酵过程可能导致某些成分的积累或转化。挥发性物质之间的酯化和氧化反应也可能影响其最终含量。这些复杂的相互作用最终共同塑造了黑苹果产品的独特风味和口感。
3 结论
本研究通过在高温高湿的环境中处理新鲜苹果，成功开发了一种新型黑苹果产品，该产品展现出独特的特性。与新鲜苹果相比，黑苹果在多个感官评价指标上表现出明显差异：其整体色泽为深褐色，总糖含量降低，多酚类化合物含量及5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量上升。在发酵过程中，关键酶如多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的酶活性均先增加后减少。此外，黑苹果中醇类和酯类挥发性化合物的含量减少，而生成新的呋喃和醛类化合物。这些综合变化不仅增强了黑苹果的抗氧化活性，也塑造了其独特的风味特征。本研究为黑苹果的制备和加工提供了科学的依据和实践指导，并为产品品质的提升及其市场竞争力的增强指明了方向。未来的研究可以利用高通量测序和代谢组学等先进技术，更深入地探究高温发酵如何影响黑苹果的品质，并优化发酵工艺。通过这些研究可以进一步分析苹果在发酵过程中的微生物群落变化、代谢途径的动态演替以及关键风味物质的生物合成机制，从而为生产实践提供指导，增强黑苹果的市场竞争力。
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