我国饮酒历史悠久，适量饮酒可能有益于身心健康，但酒为湿热有毒之品，过度饮酒会造成人体脏腑功能紊乱，过量饮酒和滥用酒精已经成为酒精性肝病的主要原因[1-2]，酒精进行体内代谢主要依赖的器官是肝脏[3]，所以长时间大剂量饮酒极易导致肝细胞发生坏死、病变等[4]。摄入酒精后会降低机体抗氧化能力，诱导肝脏发生脂质过氧化进而损坏肝细胞，导致肝损伤疾病的发生[5]。英国国家统计局统计数据截止到2020 年9 月，饮酒相关的死亡记录与2019 年同期相比增加了16.4%。其中有四分之三的人死于酒精性肝病[6]。近年来的流行病学、临床与基础研究表明，酒精在世界范围内被广泛饮用[7]。而我国酒精消费增长速度高于世界上其他地方，预计2025 年人均酒精消费量将达到7.0 L[8]。因此，对酒精性肝损伤的相关研究具有重要的意义。
粉葛为豆科植物甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根，是国家卫生健康委员会收录的药食同源类中药[9-10]，可用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛、酒毒伤中等[9]。粉葛中含有很多活性成分，如葛根素、4'-O-甲基葛根素、大豆苷、黄豆黄苷等黄酮或异黄酮类，具有改善心脑血管系统、降血糖、降血脂、抗氧化、解热抗炎、解酒护肝等作用[11]。多项研究表明，黄酮类化合物是解酒保肝的主要活性成分。有学者研究指出，黄酮类化合物可抑制机体对乙醇的吸收，并通过加速代谢以降低体内血醇浓度，同时增强体内抗氧化能力，从而达到解酒保肝的作用[12-14]。而粉葛和葛根中含有丰富的黄酮类化合物，如葛根素、大豆苷元、二氢杨梅素和槲皮素等[12-13]，两者化学成分组成和生物活性相似，药理作用也非常相近。有研究表明，相较于葛根，粉葛的醒脾解酒作用更佳，粉葛中有效活性成分不仅可抑制血液中酒精浓度并促进其代谢，从而减少肠胃对乙醇吸收，而且可分解其毒性，降低酒精对人体的损伤[15]。
近年来，益生菌发酵中药受到广泛关注[16]。中药发酵是一项中药炮制新技术，在一定条件下，借助酶和微生物的作用，可以对中药产生减毒增效作用，增强或产生中药新功效[17]。前期研究证明，通过微生物对粉葛进行发酵可不同程度增加粉葛中活性成分含量，最优发酵工艺下粉葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、总异黄酮、可溶性多糖、支链淀粉含量分别为发酵前含量的1.727、1.726、1.685、1.295、5.101、0.896 倍[18]。
粉葛的解酒护肝作用为大众熟知，其在应用上也较为广泛，但目前尚未对粉葛发酵后成分含量变化对其药理作用的影响进行研究，因此本文围绕发酵后粉葛提取物的解酒护肝作用展开研究，以56% vol 白酒灌胃大鼠，然后分组给药干预，对肝损伤大鼠血清谷丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglycerides，TG）水平和肝组织中乙醇脱氢酶（alcohol dehydroge-nase，ADH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平进行分析，探究发酵后粉葛提取物的解酒护肝作用，以期为发酵粉葛解酒护肝功能产品的开发应用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
粉葛：山西国泰中药股份有限公司；嗜酸乳杆菌：保藏于山西中医药大学食品微生物实验室，经液态培养基培养后，总活菌数为3×107 CFU/mL 的菌液，于4 ℃冰箱中保藏，备用；56%vol 白酒：北京红星股份有限公司；SPF 级雄性wistar 大鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司，健康8 周龄、体质量（200±20）g，许可证编号SCXK（京）2019-0010；实验动物伦理批号：AWE20230203；海王牌金樽片：深圳市海王健康科技发展有限公司；AST、ALT、TG、SOD、MDA、GSH-Px、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、乙醇脱氢酶（1.5 U/g）：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
RE-505 旋转蒸发器：广东怀远实业发展有限公司；BKQ-B50II 立式高压蒸汽灭菌器：山东博科消毒设备有限公司；BLY-B2 双层叠加恒温摇床：上海丙林电子科技有限公司；RC-HH-4 数显恒温水浴锅：北京睿诚永创科技有限公司；DNM-9606 酶标仪：无锡华卫德朗仪器有限公司；WONBIO-800 组织匀浆研磨仪：上海万柏生物科技有限公司；TGL-16M 高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；101-A4 电热恒温鼓风干燥箱：无锡展霖环境科技有限公司；UV-5100紫外分光光度计：南京贝登医疗股份有限公司；Eclipse Ci-L 正置白光拍照显微镜：北京荣兴光恒科技有限公司；YF500 中药打粉机：瑞安市永历制药机械有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵前后粉葛提取物的制备
基于前期选取的最优发酵提取条件[18]，发酵最优工艺为接种量5%、料液比1∶3（g/mL）、发酵时间36 h、发酵温度29 ℃。发酵后置于电热恒温鼓风干燥箱中进行干燥后粉碎。分别称取经中药打粉机粉碎后过60 目筛的粉葛和过40 目筛的发酵粉葛，置于锥形瓶中，加蒸馏水，80 ℃、500 W 超声提取50 min，过滤残渣，旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液于电热恒温鼓风干燥箱中进行干燥，得发酵前后粉葛提取物浸膏，备用。
1.3.2 大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的测定
取50 只大鼠，适应性喂养1 周后，随机分成5 组，分别为空白组、模型组、阳性组（海王金樽0.945 g/kg，药物浓度100 mg/mL）[19]、发酵前提取物组（1.6 g/kg）、发酵后提取物组（1.6 g/kg），粉葛提取物浓度200 mg/mL（按折算系数法换算大鼠给药剂量）。
空白组和酒精模型组按0.1 mL/10 g 灌胃给予蒸馏水，各给药组大鼠分别按相应给药体积灌胃给予对应药物。30 min 后，空白组给予生理盐水，酒精模型组、阳性对照组、发酵前提取物组和发酵后提取物组按13 mL/kg[20]灌胃给予56%vol 白酒。
记录给酒、给药时间，大鼠翻正反射消失时间（大鼠能够保持腹部朝上，背部朝下状态超过30 s，说明大鼠的翻正反射消失，即大鼠已醉酒）和翻正反射恢复时间（经过一段时间，大鼠能够翻身）。计算酒精耐受时间（翻正反射消失时间-给酒时间）、睡眠时间（翻正反射恢复时间-翻正反射消失时间）、醒酒时间（翻正反射恢复时间-给酒时间）[20]。
1.3.3 大鼠血清ALT、AST、TG 水平的测定
按1.3.2 所述方法，每天给药1 次，连续给药14 d，观察其生长状况，并记录其体质量变化情况。第15 天，大鼠禁食不禁水12 h，10% 水合氯醛麻醉（3 mL/kg），腹主动脉取血注入采血管内，4 000 r/min、4 ℃离心15 min后分离血清，取上清液，得到血清样品，-80 ℃冻存。按照相关试剂盒说明书，运用酶标仪检测ALT、AST、TG 水平。
1.3.4 大鼠肝组织中ADH、SOD、GSH-Px 活性和MDA水平的测定
取血完毕后，剖腹取出肝脏，生理盐水冲洗后用滤纸吸干称重，并计算肝脏指数（肝脏指数=肝质量÷体质量×100）[20]。取0.1 g 肝脏组织，加入0.9 mL 生理盐水，使用组织匀浆研磨仪破碎肝组织，得到10% 浓度的肝组织匀浆，在4 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液，按照相关试剂盒说明书，用酶标仪检测ADH、SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平。
1.3.5 肝脏组织病理学观察
切取部分肝脏右叶，生理盐水冲洗后用4% 的甲醛固定，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用显微镜观察其病理组织学变化，对肝脏组织的异常病变情况进行病理学分析（400×）。
1.4 数据处理
采用SPSS 27.0.1 统计软件，实验数据结果采用平均值±标准差表示，同一指标组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的测定结果
发酵前后粉葛提取物对大鼠酒精耐受时间、睡眠时间和醒酒时间的影响见表1。
表1 发酵前后粉葛提取物对大鼠酒精耐受、睡眠和醒酒时间的影响
Table 1 Effects of Pueraria lobata extracts before and after fermentation on alcohol tolerance，sleep，and waking time of rats
注：与模型组比较，#表示差异显著（P＜0.05）。
组别模型组阳性组发酵前提取物组发酵后提取物组酒精耐受时间/min 10.66±0.96 14.51±1.44#15.23±0.40#16.50±0.47#醒酒时间/min 50.08±0.90 42.09±0.36#49.04±0.55#45.78±00.57#睡眠时间/min 39.42±1.75 27.57±1.33#32.54±0.43#30.55±0.66#
由表1 可知，与模型组相比，阳性组、发酵前后提取物组的酒精耐受时间均有所延长，睡眠时间和醒酒时间均有所缩短，且与发酵前相比发酵后提取物组解酒效果更明显。结果表明发酵前后粉葛提取物均可改善醉酒大鼠的行为学指标、提升大鼠酒精耐受程度、延缓醉酒时间，有较好的解酒防醉效果。且相较于发酵前提取物组，发酵后提取物组解酒效果更明显，这可能是因为发酵后粉葛中的有效成分增多，减缓酒精的吸收速度，抑制血液中酒精浓度并促进其代谢[15，18]。
2.2 发酵前后粉葛提取物对大鼠体质量及肝脏指数的影响
发酵前后粉葛提取物对大鼠体质量和肝脏指数的影响见图1。
图1 发酵前后粉葛提取物对大鼠体质量和肝脏指数的影响
Fig.1 Effect of Pueraria lobata extracts before and after fermentation on body mass and liver index of rats
A.体质量；B.肝脏指数。与空白组比较，##表示差异极显著（P＜0.01）；与模型组比较，*表示差异显著（P＜0.05）。
由图1A 可知，从实验开始后第9 天，相较于空白组，给酒给药组大鼠体质量减轻，模型组大鼠体质量降低较为明显。相较于模型组，发酵前后提取物组大鼠体质量明显升高，发酵前提取物组大鼠体质量和发酵后提取物组差别较小。由图1B 可知，相较于空白组，模型组大鼠肝脏指数极显著升高（P＜0.01），相较于模型组，各给药组大鼠肝脏指数均显著降低（P＜0.05），发酵后提取物组降低更为明显。综上，发酵后粉葛提取物能有效减轻酒精引起的体质量减轻和肝脏指数升高。
2.3 发酵前后粉葛提取物对大鼠血清肝损伤指标的影响
发酵前后粉葛提取物对大鼠血清肝损伤指标的影响见图2。
图2 发酵前后粉葛提取物对大鼠血清肝损伤指标的影响
Fig.2 Effect of Pueraria lobata extracts before and after fermentation on rat serum liver injury indices
与空白组比较，##表示差异极显著（P＜0.01），###表示差异高度显著（P＜0.001）；与模型组比较，**表示差异极显著（P＜0.01），***表示差异高度显著（P＜0.001）。
血清ALT、AST 和TG 水平均是评价急性肝损伤的重要指标[21]，饮酒过量会损伤肝脏，导致肝功能异常或肝细胞结构破坏，使血清中ALT、AST 由破损处释放入血液，导致其在血中含量升高，在肝中含量降低[22]。如图2 所示，相较于空白组，模型组大鼠血清中ALT、AST 和TG 水平明显上升；相较于模型组，各给药组均可降低大鼠血清中ALT、AST 和TG 水平；相较于发酵前粉葛提取物组，发酵后粉葛提取物组降低大鼠血清中ALT、AST 和TG 水平的能力更强，表明发酵后粉葛提取物解酒护肝效果优于发酵前粉葛提取物，可以更有效减少酒精对肝细胞的损伤，其原因可能是发酵后粉葛提取物中的主要解酒护肝功能组分黄酮类化合物含量高于发酵前粉葛提取物[11，18]。
2.4 发酵前后粉葛提取物对大鼠肝脏氧化应激指标的影响
发酵前后粉葛提取物对大鼠肝脏氧化应激指标的影响见图3。
图3 发酵前后粉葛对大鼠肝脏氧化应激指标的影响
Fig.3 Effects of Pueraria lobata extracts before and after fermentation on liver oxidative stress indices of rats
A.GSH-Px 活性；B.SOD 活性；C.ADH 活性；D.MDA 水平。与空白组比较，#表示差异显著（P＜0.05），##表示差异极显著（P＜0.01），###表示差异高度显著（P＜0.001）；与模型组比较，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01），***表示差异高度显著（P＜0.001）。
ADH 是酒精代谢的关键酶，其活性会影响血液中乙醇的含量，所以可用ADH 的活性来衡量药物的解酒效果[23]。当酒精摄入过量时，会在体内短时间大量蓄积，使ADH、GSH-Px 的活性显著降低，对肝脏产生直接损伤作用。其代谢机理主要涉及乙醇的代谢产物乙醛的生理损伤，氧缺乏、氧应激、自由基的损伤以及还原性辅酶异常引起代谢紊乱等方面[24]。酒精代谢后MDA 含量会显著降低，同时会提高SOD 和GSH-Px 的活性，改善氧化应激水平[25]。因此低活性GSH-Px、SOD、ADH 和高水平MDA 是肝脏发生氧化应激的重要标志[26]。
如图3 所示，相较于空白组，模型组大鼠GSH-Px、ADH 活性极显著降低（P＜0.01）、SOD 活性显著降低（P＜0.05），MDA 水平高度显著升高（P＜0.001），相较于模型组，发酵前后提取物组肝脏GSH-Px、SOD 和ADH 活性均有所提升（P＜0.05、P＜0.01），MDA 水平极显著降低（P＜0.01），且发酵后提取物组提高大鼠肝脏ADH 活性，降低MDA 水平效果更明显，表明发酵后提取物组可通过提高酶活性加速酒精的代谢，降低血液中乙醇的含量，且其解酒护肝效果更优。
2.5 发酵前后粉葛提取物对大鼠肝脏组织病理学的影响
发酵前后粉葛提取物对大鼠肝脏组织病理学的影响见图4。
图4 发酵前后粉葛提取物对大鼠肝脏的组织病理学影响（400×）
Fig.4 Effects of Pueraria lobata extracts before and after fermentation on rat liver histopathological（400×）
A.空白组；B.模型组；C.阳性组；D.发酵前粉葛提取物组；E.发酵后粉葛提取物组。
由图4 肝脏HE 染色结果可以看出，空白组大鼠肝脏组织可见肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝细胞圆润、饱满；肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显的炎性改变。模型组大鼠肝脏组织可见大量的肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见小泡性的圆形空泡，肝索排列紊乱。相较于模型组，阳性组及发酵前后粉葛提取物组肝细胞损伤程度明显减轻，阳性组肝索排列整齐，少量肝细胞出现轻微脂肪变性；发酵前粉葛提取物组肝脏组织少见以汇管区为中心，周围少量的肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见微小的圆形空泡；相较于发酵前提取物组，发酵后粉葛提取物组肝细胞结构较完整，肝索形状排列比较清晰，脂肪变性程度轻于发酵前粉葛提取物组，胞质内未见圆形空泡。
3 讨论与结论
实验结果表明，相较于模型组，发酵前后粉葛提取物组均可明显延长酒精耐受时间，并缩短睡眠、醒酒时间（P＜0.05），对延长大鼠酒精耐受时间方面，发酵后粉葛提取物的效果优于发酵前粉葛提取物；对大鼠血清指标而言，发酵前后粉葛提取物均可抑制酒精引起的大鼠血清AST、ALT 和TG 水平升高（P＜0.01、P＜0.001），且发酵后粉葛提取物效果优于发酵前粉葛提取物；对大鼠肝脏组织指标而言，发酵前后粉葛提取物均可增强肝脏组织中ADH、SOD 和GSH-Px 活性（P＜0.05、P＜0.01），降低MDA 水平（P＜0.01），HE 染色结果显示，两种提取物均可在一定程度上减轻酒精引起的肝细胞脂肪变性程度，发酵后粉葛提取物效果更明显。综上，发酵后粉葛提取物的解酒护肝作用优于发酵前粉葛提取物。
目前对解酒产品药效作用机制的研究发现，其主要是通过抑制胃肠等消化系统对酒精的吸收或直接作用于肝代谢酶系而加速酒精在体内的代谢而起到解酒效果[27]。酒精性肝损伤疾病发生机制很复杂，目前为止并未完全被阐明。乙醇代谢过程中产生氧化应激反应在酒精性肝损伤发病机制中发挥至关重要的作用，肝细胞的损伤与活性氧自由基损伤也密切相关[28]。所以通过评价急性肝损伤的重要指标ALT、AST、TG 水平和肝脏发生氧化应激的重要标志GSH-Px、SOD、ADH 活性和MDA 水平来研究发酵前后粉葛提取物的解酒护肝作用有一定理论依据。已有研究结果表明，总黄酮、葛根素等有效成分对化学性肝损伤有一定的辅助保护作用，常用于功能食品的研制[29]。粉葛中主要功能成分异黄酮类化合物，是传统医学和现代医学中最具代表性的解酒良物之一。主要体现在其对ADH 激活率达175.38%，超氧阴离子清除率达62.99%，有较好的解酒作用[25]。它可通过增加ADH 活性来加快乙醇代谢，还能增加GSH、SOD 活性，降低MDA、TG水平而发挥作用[26]。借助微生物发酵技术可不同程度增加粉葛中活性成分含量，发酵葛根的研究结果中也有所体现[30]。
因此，本研究推测发酵后粉葛提取物的解酒护肝作用优于发酵前粉葛提取物，可能是因为发酵后粉葛提取物中主要解酒护肝功能组分黄酮类化合物含量高于发酵前粉葛提取物，可能与其增强肝乙醇代谢关键酶及抗氧化酶活性，加速乙醇在体内代谢，减少自由基及脂质过氧化物的产生有关。
综上所述，相较于发酵前粉葛提取物，发酵后粉葛提取物通过微生物发酵的方法提高粉葛中有效物质含量，从而增强其机体抗氧化能力，缓解肝组织损伤，起到更好的解酒护肝作用。本研究为粉葛的合理开发利用提供了理论依据，为发酵粉葛加工解酒护肝功能性产品提供新的方法和思路，可开拓发酵粉葛相关功能性产品及保健品市场，促进粉葛产业发展。
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