现代食品工业的主要趋势是开发用于改善人类健康的功能性食品[1]。食源生物活性化合物（如类胡萝卜素、多酚、维生素和功能性脂质），因具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病和预防心血管疾病等生理活性而备受关注[2]。β-胡萝卜素具有最高的维生素A 原活性，通过抗氧化和抗炎作用，提高人体免疫力，以及治疗某些疾病（如眼瞳症和干眼症），对人体至关重要，因此是掺入功能性食品的有力候选者[3-5]。然而，β-胡萝卜素的溶解性差、稳定性低、生物利用度有限，极大地限制了其在食品工业中的应用。因此，开发各种载体来提高其分散性、稳定性和生物利用度，从而扩大β-胡萝卜素的应用范围，具有广泛的应用前景[6]。
脂肪酸（fatty acid，FA）广泛用于食品工业中，被认为是赋予生物大分子疏水性的安全试剂。明胶含有多种官能团，如—NH2，可与各种合适的有机分子结合[7]。鱼类固体废物包括不同的副产品，如骨头、鳞片，其中胶原蛋白含量较高，提取的鱼鳞明胶（fish scale gelatin，FSG）不仅可以替代牛、猪明胶，还可以提高鱼的废物利用率，减少污染[8]。然而，FSG 的天然特性（如弱凝胶硬度）使其不适用于传统的明胶应用领域。近年来，两亲性蛋白质（增加FSG 的疏水性）因其良好的生物相容性和可降解性而受到越来越多的关注，并因其可调的物理、化学和生物制药特性而被认为是较适宜的营养递送载体[9]。前期研究发现，可通过两种改性方法来有效提升FSG 的疏水性，包括将外部疏水基团（hydrophobic grouping，HG）接枝到FSG 上和通过酸水解将内部疏水区域暴露在FSG 表面[9-10]。在前期研究的基础上，本研究用明胶-脂肪酸偶联物荷载β-胡萝卜素制备饮料不仅可以帮助人体摄取特定营养素（β-胡萝卜素），还可以减少鱼鳞的浪费和提高β-胡萝卜素的溶解性以扩大应用范围。
因此，深入了解明胶-脂肪酸偶联物（gelatin-fatty acid conjugate，GFC）负载疏水分子的结构特征，有助于促进GFC 在功能食品设计中的应用。Zhang 等[11]发现疏水基团的取代度显著影响改性明胶的疏水性。然而，鲜有研究关注疏水基团的长度对改性明胶与疏水分子的相互作用和稳定性的影响。为此，研究不同烷基链长的GFC 对β-胡萝卜素荷载效率的影响，本研究通过调节GFC 荷载β-胡萝卜素的外部环境条件，获得GFC 对β-胡萝卜素的最大荷载量，以制备成饮料，为探究饮料中荷载β-胡萝卜素是否稳定，进一步探讨该产品的热加工和储藏稳定性。由于人体利用β-胡萝卜素是通过肠道细胞吸收[12]，同时探讨了模拟胃肠消化过程中β-胡萝卜素的稳定性，以期为FSG 在疏水性营养物质荷载中的应用提供有价值的信息，也为未来饮料产品的研发提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲤鱼鱼鳞（Cyprinuscarpio L.）：贵州省水产研究所实验基地。首先用自来水冲洗鱼鳞3 次，去除黏附的鱼皮和其他杂质。洗净的鱼鳞放入烤箱，40 ℃下烘干12 h，以去除大部分水分，然后将烘箱温度提高至60 ℃，使鱼鳞最终含水量达到（15±1）%；β-胡萝卜素（纯度≥98%）、胃蛋白酶（4 000 U/g）、考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（3 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐[1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC]：上海瀚香生物科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）：西安凯新生物科技有限公司；2-巯基乙醇：山东德诺弘成化工有限公司；石油醚：天津市富宇精细化工有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子天平（BS-223S）、pH 计（PB-10）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；高速离心机（H1650）：湘潭湘仪仪器有限公司；紫外分光光度计（ILNESA-L5）：上海仪电分析仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-28）：上海一恒科学仪器有限公司；磁力搅拌器（MS-H280）：大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；冷冻干燥机（SCINTZ-10YD/A）：宁波新芝生物科技股份有限公司；粉碎机（FW177）：天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A）：上海飞越实验仪器有限公司；高速分散器（T18）：德国IKA-WerkeGmbH 公司。
1.3 方法
1.3.1 FSG 及GFC 的制备
依据Li 等[13]的研究方法提取FSG，干燥的鱼鳞用粉碎机研磨2 min，然后放入装有蒸馏水[鱼鳞∶水=1∶15（g/mL）]的烧瓶中，用磁力搅拌器在90 ℃下搅拌1 h。提取后用自来水冷却至25 ℃，4 000×g 离心5 min，去除残留物。将FSG 上清液放入透析袋中透析24 h，排除球状分子的尺寸为14 000 g/mol。提取物经过透析后，转移至冰箱（-18 ℃）。随后，将冻结样品置于真空冷冻干燥机中，冻干24 h。随后通过粉碎机研磨，过100 目筛，放入干燥器中备用，最终产品得率为（25.5±0.1）%（质量百分数）。
GFC 包括明胶-辛酸结合物（gelatin-caprylic acid conjugate，GCC）、明胶-月桂酸结合物（gelatin-lauric acid conjugate，GLC）和明胶-油酸结合物（gelatin-oleic acid conjugate，GOC），制备方法如下[14]。
1.3.1.1 EDC/NHS 活化脂肪酸
FSG 含有不能直接与水中的脂肪酸结合的胺基，必须激活脂肪酸才能进行反应。因此，选择安全的活化剂EDC/NHS 来激活脂肪酸，使疏水脂肪酸与水中明胶的亲水部分作为中间物质结合[15]。将1 mL 等量的辛酸、月桂酸和油酸分别分散在20 mL 60% 乙醇和200 μL 氢氧化钠（1 mol/L）中，使这些脂肪酸完全溶解。随后，将38.34 mg EDC 和57.54 mg NHS 加入上述溶液中，然后进行涡流处理，并将得到的溶液置于30 ℃的水浴锅中。脂肪酸活化反应以100 r/min 振荡30 min。反应结束时，加入150 μL 的2-巯基乙醇，在相同条件下摇动15 min，使未反应的内皮细胞失活。
1.3.1.2 共轭反应
将500 mg FSG 完全溶解于20 mL 60%乙醇中，加入1 mol/L 氢氧化钠200 μL。然后将该溶液分别倒入活化的脂肪酸溶液中，在30 ℃的磁力搅拌器中以300 r/min 孵化12 h。反应结束后，装入透析袋，用50%的乙醇透析，并在48 h 内逐渐降低乙醇的比例直至最终为纯水，最终产物在-60 ℃下冷冻干燥2 d。
1.3.2 GFC 荷载β-胡萝卜素
参照Liu 等[16]的方法，首先将冻干的GFC（40 mg）分别溶解于20 mL 蒸馏水中并加热至沸腾状态（1 min），待样品完全溶解后，将溶液冷却至（15±1）℃，然后用蒸馏水将体积补足至20 mL。β-胡萝卜素粉末（10 mg）加入上述20 mL GFC 溶液中，并在高速分散器下以12 000 r/min的速率均质1 min。最后，将此分散液在特定搅拌速率及室温下持续搅拌24 h。待搅拌结束后，将混合液在离心机中以5 600×g 离心10 min，收集上清液待测，并计算β-胡萝卜素荷载率（μg/mL），即在1 mL β-GFC 溶液中负载的β-胡萝卜素的质量（μg）。
1.3.3 GFC 荷载β-胡萝卜素浓度的测定
参考李青卓等[17]的方法，称取10 mg β-胡萝卜素标准样品，分别用石油醚稀释成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/mL，以石油醚为空白溶剂，在450 nm 测定吸光度，绘制标准曲线，计算线性回归方程。分别取GFC溶液500 μL，溶于2.5 mL 石油醚中，在高速离心机中以10 000 r/min 离心10 min，用紫外分光光度计测定上清液吸光度，代入线性回归方程，得β-胡萝卜素含量。
1.3.4 外部因素对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的影响
1.3.4.1 搅拌速率对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的影响
将10 mg β-胡萝卜素粉末分别加至2 mg/mL 的GCC、GLC 和GOC 溶液中。将此溶液置于高速分散器上以12 000 r/min 分散1 min。最后，将此3 种分散液在30 ℃下分别以搅拌速率为300、400、500、600、700 r/min持续搅拌24 h。
1.3.4.2 温度对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的影响
将10 mg β-胡萝卜素粉末分别加至2 mg/mL 的GCC、GLC 和GOC 溶液中。将此溶液置于高速分散器上以12 000 r/min 分散1 min。最后，将此3 种分散液分别以1.3.4.1 优化的最优搅拌速率在20、30、40、50、60 ℃下持续搅拌24 h。
1.3.4.3 GFC 浓度对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的影响
将10 mg β-胡萝卜素粉末分别加至1、2、3、4、5 mg/mL 的GCC、GLC 和GOC 溶液中。将此溶液置于高速分散器上以12 000 r/min 分散1 min。最后，将此3 种分散液分别在1.3.4.1 和1.3.4.2 优化的最优搅拌速率及最优温度下持续搅拌24 h。
1.3.5 GFC 饮料体系中β-胡萝卜素的热降解及储藏动力学
1.3.5.1 β-胡萝卜素荷载GFC（β-GFC）饮料的热降解动力学研究
配制β-GFC 饮料，然后装入具塞试管中，分别在70、80、90 ℃下恒温水浴连续加热50 min，分别在10、20、30、40、50 min 时取出试管，置于冰水浴中迅速冷却。然后，用紫外分光光度计测定其β-胡萝卜素浓度，并计算β-胡萝卜素降解的速率常数、半衰期和活化能。
1.3.5.2 β-GFC 饮料的储藏动力学研究
配制β-GFC 饮料，装入具塞试管中，于80 ℃处理30 min，分别取适量于具塞试管（无顶隙空间），于4 ℃和25 ℃下避光放置，分别于1、2、3、4、6、8、12、16、20、28、36 d 时取出样品。然后，测定β-胡萝卜素浓度，并计算β-胡萝卜素降解的速率常数、半衰期和活化能。
1.3.5.3 β-胡萝卜素降解速率常数、半衰期和活化能的计算
1）零级反应动力学参数的计算
零级动力学的降解速率可由下式表示[18]。
式中：A 为加热后β-胡萝卜素的浓度，μg/mL；A0 为初始时刻β-胡萝卜素的浓度，μg/mL；At 为一定温度下加热t min 或储藏t d 后β-胡萝卜素的浓度，μg/mL；t1/2为β-胡萝卜素降解的半衰期，d；k 为降解动力学反应速率常数。
2）一级反应动力学参数的计算
按公式（4）～（5）计算一级反应速率常数（k）、半衰期（t1/2）[19-20]。
式中：A0 为初始时刻β-胡萝卜素浓度，μg/mL；At为一定温度下加热t min 或储藏t d 后β-胡萝卜素浓度，μg/mL。β-胡萝卜素单体试验中，A0 和At 分别为初始时刻和加热t min 后各β-胡萝卜素的浓度，μg/mL。
反应活化能（Ea）按式（6）计算。
式中：k 为热降解反应速率常数；R 为气体常数，8.314×10-3 kJ/（mol·K）；k0 为频率常数；T 为绝对温度，K。当Arrhenius 方程[式（6）]两边同时取对数时，由式（5）可得不同温度下的热降解反应速率常数k，根据不同温度下的k 值，以lnk 对1/T 作线性回归，直线的斜率为-Ea/R，截距为lnk0，由直线的斜率即可求出反应活化能（Ea）。
1.3.6 β-GFC 饮料中蛋白质和β-胡萝卜素的体外模拟胃肠稳定性
1.3.6.1 模拟胃肠液的配制
模拟胃液（simulated gastro fluids，SGF）由2.0 g NaCl、7.0 mL HCl（37%）、900 mL 蒸馏水和100 mL 含有3.2 g 胃蛋白酶的酶溶液组成[21]。模拟肠液（simulated intestinal fluids，SIF）由650 mL KH2PO4（6.8 g）、190 mL 0.2 mol/L NaOH 和160 mL 含有10.0 g 胰蛋白酶的酶液组成。用HCl 和NaOH 将SGF 和SIF 的最终pH 值分别调整为1.2±0.2 和7.2±0.2。
1.3.6.2 体外模拟胃肠稳定性测试
将4 mL β-GFC 饮料与16 mL SGF 或SIF 在旋涡混合器上混合（用塑料膜覆盖），然后在（37±1）℃的水浴中以120 r/min 搅拌培养。在设定的时间点（0、10、20、30、40、60、90 min），对0.1 mL 混合溶液（0.1 mL SGF 或SIF 被重新加入到混合溶液中）进行采集，通过考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量[22]，按1.3.3 方法测定β-胡萝卜素浓度。蛋白质和β-胡萝卜素的保留率计算公式如下。
式中：P 为蛋白质保留率，%；Ct 为一定时间间隔后溶液中蛋白质的浓度，mg/mL；C0 为初始蛋白质的浓度，mg/mL。
式中：B 为β-胡萝卜素保留率，%；Ct 为一定时间间隔后溶液中β-胡萝卜素的浓度，μg/mL；C0 为初始β-胡萝卜素的浓度，μg/mL。
1.4 统计分析
所有试验均重复3 次，结果以平均值±标准差表示，SPSS 26 软件对数据进行Turkey's 检验显著性分析（P＜0.05）。使用Origin 2021 作图。
2 结果与分析
2.1 环境因素对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的单因素试验结果
环境因素对荷载β-胡萝卜素的GFC 中β-胡萝卜素浓度的影响如图1 所示。
图1 环境因素对荷载β-胡萝卜素的GFC 中β-胡萝卜素浓度的影响
Fig.1 Effect of environmental factors on β-carotene concentration in GFC loaded with β-carotene
A.搅拌速率；B.温度；C.GFC 浓度。不同小写字母表示组间存在显著性差异，P＜0.05。
由图1A 可知，GCC 溶液中β-胡萝卜素浓度在600 r/min 时达到最大值（6.40±0.29）μg/mL，GLC 溶液中的β-胡萝卜素浓度在400 r/min 时达到最大值，为（7.87±0.30）μg/mL。相比之下，GOC 对β-胡萝卜素的荷载效果最好，在速率为500 r/min 时，溶液中β-胡萝卜素浓度达到最大，为（11.04±0.33）μg/mL。单独的β-胡萝卜素在水中的溶解性差，几乎不溶于水[6]，而用GFC 荷载β-胡萝卜素能够明显提高其溶解性。从上述结果可以推断，经适当的搅拌可以提高GFC 荷载疏水性生物活性物质的能力，GOC 对β-胡萝卜素的增溶效果高于GLC 和GCC。随着脂肪酸烷基链长度的增加（从0 增加到18），聚合物的表面疏水性增加，这可能归因于聚合物构型的变化和蛋白质内部疏水基团的暴露导致比表面积的增加[23]。适宜的搅拌速率可以促进GFC 的展开，当GFC 荷载β-胡萝卜素时，增大搅拌速率，可以增加GFC 纳米颗粒与β-胡萝卜素之间的接触机会[24]，能够让β-胡萝卜素进入纳米颗粒内部。但是，过高的搅拌速率并不能增加溶液中β-胡萝卜素的浓度，因为较高的搅拌速率会加速β-胡萝卜素的分散。因此，GCC 的最适搅拌速率为600 r/min，GLC 和GOC最适搅拌速率分别为400、500 r/min。
由图1B 可知，不同样品溶液中的β-胡萝卜素浓度随温度变化呈先升高再降低的趋势。GCC 在温度40 ℃时，达到其对β-胡萝卜素的最大荷载量，为（7.26±0.14）μg/mL；GLC 在温度为40 ℃时，对β-胡萝卜素的荷载量最高，为（8.87±0.21）μg/mL；GOC 在30 ℃时，β-胡萝卜素有最大荷载量，为（11.99±0.13）μg/mL。以上结果表明，GOC 与β-胡萝卜素的结合能力高于其他样品，这可能是由于化学接枝较长烷基的GOC 产生了更多的疏水基团，从而提高蛋白质的结合亲和力[25]。Vo等[26]利用基于油酸的超声波辅助萃取胡萝卜渣中类胡萝卜素，在50 ℃时，类胡萝卜素含量约为（163.43±1.83）μg/g，说明适当的温度有助于β-胡萝卜素的溶解。但当温度继续升高到60 ℃时，溶液中β-胡萝卜素的溶解性显著降低。较高的温度可能会增加GFC 疏水相互作用的强度[27]，使得GFC 更容易形成团聚，不利于β-胡萝卜素的包埋。故GCC、GLC 和GOC 的最适温度分别为40、40、30 ℃。
β-胡萝卜素在GFC 溶液中的浓度是评价GFC 作为疏水分子载体是否成功的有效依据。由图1C 可知，GFC 的浓度对GFC 荷载β-胡萝卜素的效率影响较大，GFC 浓度越大，溶液中纳米颗粒数量越多，在一定范围内，被包埋在纳米颗粒中的β-胡萝卜素也就越多。当GCC 浓度为2 mg/mL 时，溶液中β-胡萝卜素浓度最高，为（7.31±0.14）μg/mL。而GLC 和GOC 在浓度为3 mg/mL 时，对β-胡萝卜素的荷载力最强，溶液中β-胡萝卜素含量分别达到（10.77±0.30）、（13.21±0.34）μg/mL。由此可见，由于β-胡萝卜素与GFC 之间的分子相互作用主要由疏水相互作用主导，GFC 中的疏水氨基酸为β-胡萝卜素的负载构建了一个疏水区域和疏水核心[28]。进一步增加GFC 的浓度并不会提高β-胡萝卜素的溶解度，反而使β-胡萝卜素浓度显著降低（P＜0.05）。这可能是由于溶液中的GFC 的浓度较高时，纳米粒子发生絮凝沉降[29]，致使溶液黏度变大，β-胡萝卜素的包埋受到影响。因此，GCC 的最适浓度为2 mg/mL，GLC 和GOC 的最适浓度为3 mg/mL。
2.2 β-GFC 饮料的热降解和储藏动力学
2.2.1 β-GFC 饮料的热降解动力学
β-胡萝卜素在不同饮料中的降解情况如图2所示。
图2 β-胡萝卜素在不同饮料中的降解情况
Fig.2 Degradation of β-carotene in different beverages
A.GCC；B.GLC；C.GOC；D.Arrhenius 曲线。
由图2A～图2 C 可知，不同饮料中β-胡萝卜素的降解速率均符合一级动力学方程，但存在明显差异。GOC 中β-胡萝卜素在70、80、90 ℃下的斜率均低于GLC 和GCC，说明β-胡萝卜素在GOC 饮料中的降解速率较小，而在GLC 和GCC 饮料中的降解速率大。由图2D 可知，β-胡萝卜素在GOC 饮料中的Arrhenius曲线的斜率高于GLC 和GCC 饮料，直线斜率越大，活化能越高。结果表明，β-胡萝卜素被GOC 包裹后，热稳定性明显提高，并且随着烷基链长的增加，β-胡萝卜素与GFC 之间的疏水相互作用增强，热稳定性提高，此研究结果与Liang 等[30]的研究结果一致。
不同饮料中β-胡萝卜素的热降解动力学参数如表1 所示。
表1 不同饮料中β-胡萝卜素的热降解动力学参数
Table 1 Thermal degradation kinetic parameters of β-carotene in different beverages
种类GCC活化能/（kJ/mol）29.62（R2=0.998 2）GLC 37.41（R2=0.987 2）GOC温度/℃70 80 90 70 80 90 70 80 90降解速率常数k（R2）0.013 8（0.982 5）0.018 7（0.995 4）0.024 4（0.999 6）0.010 1（0.996 3）0.015 1（0.985 0）0.020 6（0.996 8）0.008 4（0.988 7）0.010 9（0.982 9）0.018 0（0.987 6）半衰期/min 50 37 28 69 46 34 83 63 39 40.01（R2=0.942 2）
由表1 可知，β-胡萝卜素在不同饮料中的热降解动力学不同，GOC 和GLC 饮料中β-胡萝卜素的活化能分别为40.01 kJ/mol 和37.41 kJ/mol，高于GCC 饮料中β-胡萝卜素的活化能（29.62 kJ/mol），说明β-胡萝卜素在GOC 和GLC 饮料中相对稳定；而在GCC 饮料中β-胡萝卜素随温度的变化降解速率最快。
2.2.2 β-GFC 饮料的储藏动力学
25 ℃和4 ℃下不同饮料中β-胡萝卜素的保留率如图3 所示。
图3 25 ℃和4 ℃下不同饮料中β-胡萝卜素的保留率
Fig.3 β-carotene retention rate in different beverages at 25 ℃and 4 ℃
由图3 可知，在相同储藏时间下，不同饮料体系中β-胡萝卜素保留率在室温（25 ℃）储藏低于冷藏（4 ℃），说明储藏温度是影响饮料中β-胡萝卜素稳定性的重要因素。将β-胡萝卜素的保留率与储藏动力学研究结合，获得相关动力学参数。在某一温度范围内，一般采取反应降解速率常数来表征其降解速度，相关系数R2来推测反应级数，选取R2 较大的反应级数来描述降解反应[31]。
不同饮料中β-胡萝卜素在25 ℃和4 ℃储藏过程中的降解参数如表2 所示。
表2 不同饮料中β-胡萝卜素在25 ℃和4 ℃储藏过程中的降解参数
Table 2 Degradation parameters of β-carotene in different beverages during storage at 25 ℃and 4 ℃
温度/℃25反应级数一级反应动力学4种类β-GCC β-GLC β-GOC β-GCC β-GLC β-GOC降解速率常数k（R2）0.014 6（0.994 1）0.011 6（0.998 5）0.007 2（0.994 8）0.061 7（0.965 5）0.073 5（0.965 1）0.060 0（0.930 2）半衰期/d 47 60 96 59 73 112零级反应动力学
由表2 可知，根据各储藏温度下的相关系数R2 可知25 ℃储藏温度下不同饮料中的β-胡萝卜素降解均符合一级反应动力学，而储藏在4 ℃时，则符合零级反应动力学。根据零级和一级反应动力学方程，通过计算分别得到不同储藏温度下饮料中β-胡萝卜素的降解速率常数及半衰期。在4 ℃时，β-胡萝卜素在GOC 饮料中的半衰期最长，即温度越高，半衰期越短。β-GOC 在25 ℃下保留率为77.02%，在4 ℃下保留率为83.87%，相比于GCC 和GLC，GOC 对β-胡萝卜素荷载有显著保护作用，这可能与GFC 的疏水性相关[32]。孙乾等[33]以莲子分离蛋白（lotus seed protein isolate，LSPI）为乳化剂制备β-胡萝卜素复合乳液（LSPI-BC），发现由LSPI 制备的LSPI-BC 在低温下（4 ℃）具有长期稳定性，β-胡萝卜素保留率可达85%以上，但在高于25 ℃时稳定性与保留率明显降低，与本试验研究结果一致。这些结果表明，温度可有效改变饮料的物理化学稳定性及β-胡萝卜素的降解，适当的低温更有助于延长饮料的保存。
2.3 β-GFC 饮料中蛋白质的体外模拟胃肠稳定性
体外模拟胃液和肠液中β-GFC 饮料中蛋白质的稳定性如图4 所示。
图4 体外模拟胃液和肠液中β-GFC 饮料中蛋白质的稳定性
Fig.4 Protein stability in β-GFC beverage under simulated in vitro gastric and intestinal juice conditions
A.模拟胃液；B.模拟肠液。同一时间不同小写字母表示不同处理间具有显著性差异（P＜0.05）。
由图4 可知，经过胃消化后，不同处理样品的蛋白质保留率呈不同程度下降，GCC、GLC 和GOC 饮料中蛋白质保留率在体外模拟胃液消化结束时分别为65.21%、58.7%和86.52%。这可能是因为蛋白分子在模拟胃液（pH1.2）中结构展开，包埋在分子内部的作用位点暴露出来，表现为总消化率的不断上升，使蛋白质发生解折叠，导致β-折叠结构含量下降[34]。Hu 等[35]发现随着磷酸基团的不断引入，蛋白质分子表面的负电荷增加，导致蛋白质的水合作用增强，所以明胶的水溶性增加。磷酸化处理可引起蛋白质变性，从而破坏分子内氢键，破坏蛋白质的空间结构，使其降解变成氨基酸长链。这样很容易在链之间形成分子间氢键，导致聚集团簇，不易溶解。而在体外模拟肠道消化结束时，GCC、GLC 和GOC 饮料中蛋白质保留率分别为54.11%、50.25%和62.23%，这可能是脂肪酸水解改变了FSG 的二级和三级结构，并且随着pH 值增加导致有序二级结构的丧失[36]。GFC 饮料中蛋白质的体外保留率研究结果表明，脂肪酸改性的FSG 并不会显著降低蛋白质的营养价值。
2.4 β-GFC 饮料中β-胡萝卜素的体外模拟胃肠稳定性
体外模拟胃液和肠液中β-GFC 饮料中β-胡萝卜素的稳定性如图5 所示。
图5 体外模拟胃液和肠液中β-GFC 饮料中β-胡萝卜素的稳定性
Fig.5 β-carotene stability in β-GFC beverage under simulated in vitro gastric and intestinal juice conditions
A.模拟胃液；B.模拟肠液。同一时间不同小写字母表示不同处理间具有显著性差异（P＜0.05）。
由图5 可知，在体外模拟胃液消化结束时，GCC、GLC 和GOC 饮料中β-胡萝卜素保留率分别为66.00%、77.65% 和86.01%，而在体外模拟肠道消化结束时，GCC、GLC 和GOC 饮料中β-胡萝卜素保留率分别为49.61%、60.24% 和72.43%。荷载β-胡萝卜素的样品在模拟肠液（SIF）中比模拟胃液（SGF）中的降解率更高。在模拟肠液反应中，GOC 饮料中β-胡萝卜素保留率最高，GLC 次之，且随着时间的延长，GFC 对β-胡萝卜素的保护效果尤为明显。藤梦静[37]采用中链甘油三酯/玉米醇溶蛋白负载β-胡萝卜素制备微胶囊，以柠檬酸和单宁酸为交联剂，微胶囊在SGF 中消化2 h 后，柠檬酸交联型微胶囊和单宁酸交联型微胶囊中的β-胡萝卜素保留率分别为72.8% 和79.7%，而在SIF 中消化6 h 后的生物接收度分别为72.4% 和77.2%。说明经包埋处理的β-胡萝卜素能够在人体胃肠得到有效保护免受微环境的影响，这与本试验研究结果一致。综上所述，经明胶-脂肪酸偶联物所得的GFC 可以作为β-胡萝卜素的理想载体，在体外模拟胃肠消化过程中对β-胡萝卜素发挥更好的保护作用，可以有效保证其在人体内的吸收利用。
3 结论
本文以明胶-脂肪酸偶联物作为研究对象，采用8～18 烷基链长的脂肪酸为原料，合成了明胶-脂肪酸偶联物，以β-胡萝卜素为模型荷载物质。通过单因素试验研究搅拌速率、温度和GFC 浓度对GFC 荷载β-胡萝卜素效率的影响，以确定最适外部环境条件。同时将β-GFC 制成饮料，探讨β-GFC 饮料体系中β-胡萝卜素的热加工、储藏及体外模拟消化稳定性。研究发现，GCC荷载β-胡萝卜素的最适条件为搅拌速率600 r/min、温度40 ℃、GCC 浓度2 mg/mL，而GLC 荷载β-胡萝卜素的量在搅拌速率为400 r/min、温度40 ℃、浓度3 mg/mL时达到最高，GOC 在搅拌速率为500 r/min、温度为30 ℃、GOC 浓度为3 mg/mL 时，对β-胡萝卜素的荷载效果最好。研究发现β-GOC 饮料体系中的β-胡萝卜素在热降解和储藏过程中最稳定，且β-GOC 饮料体系中蛋白质和β-胡萝卜素在模拟胃肠消化过程中其保留率均高于β-GCC、β-GLC。因此，GOC 可作为良好的β-胡萝卜素载体和成为食品体系中功能可调的稳定材料，同时扩大了FSG 的应用范围。该研究为FSG 作为输送营养物质载体提供参考依据，可为未来饮料的加工提供技术支撑。
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