甜菜素是一种重要的天然植物色素,有着色力强、生理活性高的特点,在众多领域有巨大应用价值。本文从甜菜素的基本结构、生理作用、提取工艺、稳定性、护色方法以及在不同领域的研究进展进行综述,以期为甜菜素的研究提供参考。
1918 年,甜菜素从红甜菜根中分离得到,是一种水溶性含氮色素,属于醌类衍生物色素,易溶于水和极性溶剂,但不溶于大多数有机溶剂(如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等)[1]。长期以来,红甜菜根是提取甜菜素的唯一来源。然而,由于甜菜根提取物中含大量硝酸盐和土腥味,限制了甜菜源甜菜素的开发利用[2]。因此,在自然界中寻找其它来源的甜菜素意义重大。
甜菜素主要分布在石竹目下17 个科属植物中,如表1 所示,从不同种属植物中共发现了75 种不同类型的甜菜素次生代谢产物[3]。
表1 甜菜素分布
Table 1 Distribution of betalains
目科石竹目藜科(Chenopodiaceae)参考文献[1][3][4]仙人掌科(Cactaceae)[5]苋科(Amaranthaceae)紫茉莉科(Nyctaginaceae)植物藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)、红甜菜(Beta vulgaris L.)、盐地碱蓬[Suaeda salsa(Linn.)Pall.]仙人掌[Opuntia stricta(Haw.)Haw.var.dillenii(Ker-Gawl.)Benson]鸡冠花(Celosia cristata Linn.)三角梅(Bougainvillea spectabilis Willd.)[6][7]
近年来,学者们主要集中于红甜菜(Beta vulgaris L.)、火龙果(Hylocereus undulatus Britt.)、仙人掌果[Opuntia stricta(Haw.)Haw.var.dillenii(Ker-Gawl.)Benson]等植物中的甜菜素的研究,提取方法并不统一[3]。同时,甜菜素和众多天然色素一样,其结构不稳定,易受温度、光照、pH 值、金属离子等因素影响。研究表明,甜菜素生理活性高,有抗菌、抗氧化、抗疲劳、预防癌症等作用[2]。由于甜菜素着色能力强,常将其用于食品、化妆品和药品等行业[3]。
不同类型甜菜素化学通用式见图1。
图1 不同类型甜菜素化学通用式
Fig.1 General chemical formula of different types of betalains
(A)甜菜红素;(B)甜菜黄素;(C)甜菜醛氨酸。⊕、⊖表示正负电荷。
由图1 可知,甜菜素为液泡色素,由核心生色团甜菜醛氨酸(图1 C)与不同类型的环状多巴(cyclo-dihydroxyphenylalani,c-DOPA)或氨基酸构成,其产物分别为甜菜红素(图1 A)和甜菜黄素(图1 B),最大吸收峰分别在532~550 nm 和457~485 nm,分别呈红紫色和黄橙色[5]。
甜菜素在植物体内主要合成途径为酪氨酸首先形成左旋多巴(levodopa,L-DOPA),进一步形成环状多巴,同时L-DOPA 会形成甜菜醛氨酸,当甜菜醛氨酸和环状多巴结合则形成甜菜红素,当甜菜醛氨酸和氨基酸结合则形成甜菜黄素[8]。甜菜素骨架上存在的不同的修饰基团(-R、-R1 和-R2)可产生不同活性的次生代谢产物[8]。甜菜红素与甜菜黄素含量的占比优势往往可从植物外观中呈现,甜菜红素为优势色素,徐夙侠等[7]研究发现,三角梅中甜菜红素为主要色素,而黄色的藜麦种子中甜菜黄素为主要色素。从红甜菜中提取的7 种甜菜素代谢产物,甜菜红素的含量均在61~163 mg/100 g 之间,甜菜黄素的含量均在31~95 mg/100 g 之间,甜菜及不同植物甜菜红素和甜菜黄素比值在1.75∶1 左右[9]。部分植物中甜菜素类别和含量见表2。
表2 部分植物中甜菜素类别和含量
Table 2 Category and content of betalains in some plants
名称红苋菜(鲜)种类甜菜红素甜菜黄素含量/(mg/100 g)0.013~0.057 0.019~0.058参考文献[10]
续表2 部分植物中甜菜素类别和含量
Continue table 2 Category and content of betalains in some
plants
名称红甜菜(鲜)参考文献[9]仙人掌果(干)[11]火龙果(干)种类甜菜红素甜菜黄素甜菜红素甜菜黄素甜菜红素含量/(mg/100 g)61~163 31~95 1 400 843.67 486[12]
甜菜素含不饱和键和芳香环,易发生氧化反应,具有良好的抗氧化能力,其结构中羟基、酚基、环胺基团是良好的电子供体,能有效抑制自由基对机体的损伤,其结构中酚羟基也是高效的抗氧化基团[13]。Čanasavic-Brunet 等[13]通过试验证明甜菜素有较强的抗氧化活性,0.028 mg/mL 的甜菜素提取物DPPH·清除率达到50%,0.275 mg/mL 的提取物Fe3+还原能力达到50%,1.5 mg/mL 的提取物羟基自由基清除率达到50%。Rahimi 等[14]研究发现25 μg 的甜菜根粉末的DPPH·清除率达到72.5%,相当于2.75 μg 的抗坏血酸。Sarker等[10]发现25 种红苋菜中甜菜素均具有较强的抗氧化能力,具有延长食品保质期、提高食品品质的潜力。同时,富含甜菜素的植物大多具有较强的抗逆性(如藜麦、仙人掌、马齿苋等),其抗逆性可能与甜菜素抗氧化性有密切联系,但还有待进一步证实。
甜菜素具有一定的抗菌效果,是潜在的天然抗菌剂[15]。研究表明,许多植物中甜菜素均表现出不同程度的抗菌活性。Spórna-Kucab 等[15]将千日红(Gomphrena globose L)中的甜菜素进行提取纯化,测定其对16 种病原细菌和3 种病原真菌的体外抗菌活性,发现甜菜素对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有一定抑菌活性,对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)抑菌活性较强,对表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、酵母菌有轻微抑制作用,还发现添加酚酸能进一步提高甜菜素的抗菌活性。Canadanovic-Brunet 等[13]发现甜菜素对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑制作用大于对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑制作用。甜菜素对不同类型菌的抑制差异使其在乳制品发酵、饮料生产、食品保藏中有潜在应用价值,可保证有害菌受到抑制而不影响益生菌生长。
研究表明,甜菜素对癌细胞生长有一定抑制效果,其能促进细胞凋亡基因的表达[16]。Mancini 等[16]发现甜菜素对人体前列腺癌细胞(DU-145)生长有抑制作用,此抑制效果可能是甜菜素与其它活性成分协同作用产生的。Nowacki 等[17]探究了纯化后的甜菜素抗癌作用,甜菜素溶液提高细胞凋亡相关蛋白基因表达量,使自噬细胞活性增强,促进人乳腺癌细胞(MCF-7)凋亡,并对正常细胞没有影响。Henarejos-Escudero 等[18]用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)肿瘤模型研究甜菜素抗癌活性,发现甜菜黄素使线虫体内肿瘤体积减少了56.4%,甜菜黄素和甜菜红素分别使线虫的氧化应激反应减少了75%和94%,认为甜菜素是有力的抗肿瘤因子。同时,该研究还发现甜菜素能激活胰岛素信号通路,延长线虫9.3%的寿命,推测甜菜素的抗癌作用与其抗氧化作用密不可分。
当人体受细菌、紫外线等刺激时,会产生炎症因子,继而发生一系列炎症反应。甜菜素对炎症有抑制作用,对关节炎作用最为明显,能降低炎症因子含量,对炎症治疗有辅助作用[19]。Pietrzkowski 等[20]发现甜菜素可以减少人体中性粒细胞释放次氯酸,抑制蛋白质氧化,从而缓解关节炎,患者每天摄入30~100 mg 甜菜素,10 d 后,被氧化的蛋白水平降低了48%,炎症缓解率达到33%。Martinez 等[21]也证实,乙醇提取的甜菜素具有很强的抗炎症活性,通过检测炎症因子含量,证实了甜菜素能缓解小鼠的疼痛。
随着研究不断深入,发现甜菜素还具有抗疲劳、预防冠心病、降血脂、减肥等功效[22]。Reyes-Izquierdo等[23]研究发现,甜菜素浓缩液可以提高人的运动能力。Rahimi 等[14]研究发现,甜菜素将抗冠心病基因表达量提高2.69 倍,对治疗冠心病有帮助。甜菜素能保护大鼠的肝脏、缓解大鼠百草枯中毒症状[22]。还有研究发现甜菜素可以降低动脉粥状硬化患者的血压、血脂和半胱氨酸水平[24]。因此,多食用富含甜菜素的水果和蔬菜(如火龙果、藜麦、红甜菜等),可有效预防冠心病、肥胖等疾病,增强抵抗力[23]。
甜菜素提取步骤主要包括原材料预处理、粉碎、烘干、色素提取、纯化、纯度鉴定等,也可直接将新鲜材料冻结后磨碎提取甜菜素,根据相似相溶原理,乙醇、水为常用的极性提取剂[25]。为提高甜菜素得率、缩短提取时间,辅助提取必不可少。
国内外很多学者对常见的植物中甜菜素进行了萃取。最常用的甜菜素提取方法多以乙醇溶液和水溶液为溶剂,料液比从1∶5~1∶40(g/mL)不等,提取时间在30 min 到1 h 之间,常用的甜菜素检测方法为分光光度法,其特征检测波长在535 nm 左右。常见甜菜素提取条件见表3。
表3 甜菜素提取条件
Table 3 Extraction conditions of betalains
注:-表示参考文献中未涉及该指标。
材料藜麦红甜菜白肉火龙果果皮盐地碱蓬温度/℃30 30 40溶剂pH水水料液比/(g/mL)1∶5 1∶6.67 1∶40值---提取时间/min 60 30 25检测波长/nm 538 538 538参考文献[1][25][26]-1∶20 3.0 30 550[4]仙人掌果52 30%乙醇60%乙醇30%乙醇1∶10-30 535[27]
超声波是一种波长低于2 cm 的机械波,广泛用于辅助提取。超声波辅助提取过程中,超声破坏植物细胞壁,甜菜素更易析出;另一方面,由于超声空化作用,溶剂渗透性增强,溶剂与甜菜素接触面积增加,从而提高了甜菜素提取率[25]。Tabio-Garcia 等[28]通过超声辅助提取苋菜中的甜菜素,得率最高可达到83.39%。但超声辅助提取并非功率越大效果越好,谢婧等[29]研究发现,216 W 超声波功率效果最佳,功率过大反而会破坏甜菜素结构。超声辅助提取能缩短甜菜素提取时间,提高甜菜素得率,对设备要求较低,能耗低,既适合实验室中少量提取,也适合工业中大量提取。
微波是指波长在1 mm~1 m 的电磁波,其可产生电磁辐射能,破坏植物组织细胞壁,使组织液更容易流出,从而使被提取物得以分离。微波辅助提取常用于提取动植物中的天然化学成分。Melgar 等[30]通过微波辅助提取仙人掌果中的甜菜素,最大得率为132.9 mg/g,但其发现微波比超声波更容易使甜菜素降解。陈伟娜等[31]通过微波辅助提取仙人掌果中的甜菜素,得到最佳提取条件为30 ℃、475 W、105 s。微波辅助提取具有效率高、时间短、能耗低等特点,但是微波处理会使样品升温,容易导致甜菜素降解。
据统计,脉冲电场、超临界CO2 等其它辅助手段也可用于提取天然活性物质。Nowacka 等[32]用脉冲电场处理红甜菜,脉冲电场破坏红甜菜的细胞膜通透性,使甜菜素得率提高329%,但对设备要求较高。Fathordoobady 等[33]将超临界CO2 萃取应用于提取火龙果甜菜素,提取率为(4.09±0.69)%。超临界CO2 萃取操作便捷,提取物活性高,被广泛用于提取天然色素。
甜菜素粗提液中常含有固形物颗粒、多糖、少量蛋白和纤维素等杂质。固形物等分子量较大的杂质可过滤去除,其它杂质还要进一步分离纯化。目前纯化天然色素主要有大孔树脂吸附法、高效液相色谱法、双水相法等。
大孔树脂是有大孔结构的高分子树脂,其比表面积较大,可与被提取物通过范德华力和氢键相结合,通过特定溶剂洗脱可将提取物分离、纯化[34]。陈宇等[34]探究大孔树脂对火龙果色素的静态吸附和解吸效果,结果显示NKA-9 的吸附率最大,达到87.4%,但是解吸效果较差;S-8 的吸附率达到63.2%,解吸效果也较好,其纯化后色素的色价提高了5.31~5.26 倍。Kaba等[35]探究了不同大孔树脂对甜菜根中甜菜素的动态吸附效果,发现聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)和聚二乙烯基苯(polydivinylbenzene,PDVB)聚合树脂对甜菜素分离效果较好。大孔树脂环保无污染、操作简单,可重复使用,在天然色素的纯化中经常被应用,既适合实验室少量纯化甜菜素,也适合工厂大量纯化甜菜素,但要得到更纯的甜菜素还需要进一步纯化。
高效液相色谱法是纯化和检测色素的常规方法,主要利用高压流动相,将不同极性物质分离并检测。在甜菜素混合物分离的色谱条件中,使用C-18 柱、甲醇-水为流动相居多[36]。阳辛凤等[37]通过高效液相色谱分离火龙果中的甜菜素,共鉴定出甜菜素次生代谢产物19 种,其中甜菜红素15 种,甜菜黄素4 种。红皮红肉火龙果中甜菜素种类最丰富、含量最高,在黄皮白肉火龙果中种类最少、含量最低。Sporna-Kucab 等[15]将高效液相色谱和高速逆流色谱相结合,分离千日红中的甜菜素,得到10 个纯化的甜菜素异构体,并发现酰基化的甜菜素抗菌活性更高。高效液相色谱法不仅可以将甜菜素纯化,还能将其次生代谢产物进行分离,并进行定性、定量分析,该方法高效、灵敏度高、重复性好、进样少,适合微量操作。
传统的双水相是指一些亲水性高分子聚合物在水溶液中达到一定温度、浓度条件就会形成两相,因不同组分分配系数不同而分离的方法。常见的有聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和(NH4)2SO4 体系[38]。Chethana 等[38]通过双水相体系分离甜菜根中的甜菜素和多糖,结果大约有70%~75% 的甜菜素分布在上相,90%的糖类分布于下相,发现PEG6000 和硫酸铵为最佳分离双水相体系,当其系线长度为34% 时,分离效果较好。胡金梅等[39]通过PEG 和(NH4)2SO4 双水相体系分离火龙果果皮甜菜素和果胶,结果表明,在质量分数为16%的PEG6000 和19%的硫酸铵双水相体系下富集效果最佳。双水相法操作简单,无残留,易放大和连续操作。
据统计,甜菜素还可以通过离子交换法、膜分离法等进行分离,不同方法还可结合使用[40]。总之,在纯化甜菜素的方法中,双水相法和大孔树脂吸附法较常用,高效液相法常用于后续甜菜素检测、分析,但其分离方法各有优势,在试验和生产中应酌情选用。
影响甜菜素稳定性的因素主要有温度、光照、pH值、金属离子和酶,其主要发生脱羧、脱氢、脱糖基以及亚胺键断裂等反应[2]。
温度是影响甜菜素稳定性的最主要因素,且难以避免。较高温度会导致红色的甜菜苷脱氢,生成黄色的新甜菜苷[41]。同时,加热会导致红色的甜菜苷降解成黄色的甜菜醛氨酸和无色的环状多巴-5-O-β-葡萄糖苷[3]。温度也会改变甜菜素颜色,温度超过20 ℃时,甜菜红素的吸光度就会开始下降,在60 ℃以上,甜菜红素会由红色变为黄色,在100 ℃条件下15 min,甜菜红素就会发生褐变[41]。Sawicki 等[42]将红甜菜在100 ℃条件下煮沸1 h,甜菜素总量下降了54%。Chew 等[43]研究火龙果中的甜菜素,发现甜菜素降解符合一级动力学模型,甜菜红素的活化能为-49.2 kJ/mol,甜菜黄素为-40.0 kJ/mol,认为甜菜黄素比甜菜红素更稳定。甜菜黄素和甜菜红素的热稳定性强弱有待进一步确认。总之,为了减少温度对甜菜素的影响,在其原材料处理时,应选择温和的处理方式,如阴干、冷冻干燥等。
pH 值是影响甜菜素稳定性的重要因素。在酸性较强的条件下,红色的甜菜苷会发生脱羧反应,形成橙色的脱羧基甜菜苷,在碱性条件下红色的甜菜苷也会发生降解,生成黄色的甜菜黄素。同时,在强酸或碱性条件下还会发生脱糖基反应,生成紫红色的甜菜苷配基[3]。pH 值在1.0~2.0 时,甜菜素溶液为橙色,在3.0~7.0 之间时呈红色,在7.0~10.0 之间时呈紫色,当pH值大于10.0 时,甜菜红素会转化为甜菜黄素,使溶液呈黄色[44]。蔡庭秀等[45]研究发现,在有氧条件下,甜菜块根中提取的甜菜素在pH 值为5.5~5.8 之间最稳定,在无氧条件下,pH 值为4.0~5.0 的条件下最稳定。大量研究表明,甜菜素在pH 值为中性或弱酸性时更稳定,所以在甜菜素提取和产品开发时应保持在中性或弱酸性环境,同时,其颜色变化可为其产品品质变化起到很好的指示作用。
光照也是影响甜菜素稳定性的一大因素。在光照条件下,甜菜素发色团的电子处于高能状态,分子反应活性更强,容易被氧化降解。光照强度、光质和光照时间均会影响甜菜素稳定性,其中太阳光和紫外线影响最大[3]。陈冠林[46]研究发现,太阳光、室内散射光和黑暗条件均会引起色素降解,其中太阳光影响程度最大。高彦祥等[47]发现,甜菜素在紫外条件下照射2 h 后会完全降解。Ortega-Henandez 等[48]用6.4 W/m2 紫外光照射鲜仙人掌果24 h 后发现甜菜素增加了33%~40%,说明紫外线可能诱导了新鲜仙人掌果甜菜素合成基因的表达。因此在甜菜素提取、加工、运输过程中应该避光操作。
金属离子会影响甜菜素结构,部分离子会与甜菜素形成络合物,改变其颜色,部分离子也可起到护色作用。Butera 等[49]通过试验发现,Cu2+会导致甜菜红素的最大吸收峰从536 nm 向520 nm 处偏移,加入乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)将Cu2+螯合后,最大吸收峰又逐渐恢复到536 nm 处,认为Cu2+会和甜菜红素形成螯合物,导致甜菜红素颜色发生变化,但Cu2+对甜菜黄素影响较小。曹机良等[50]发现,部分金属离子会使甜菜素变色,如Fe3+使溶液变为橙色,Cu2+使溶液变为深紫色,Al3+使溶液变为粉色。然而,徐菡等[51]发现Ca2+溶液对甜菜素可起到保护作用。因此,在甜菜素的提取过程中要减少原材料与Fe3+和Cu2+接触,多采用玻璃或塑料器皿盛放。
氧气、水分活度、酶和一些有机溶剂等均会影响甜菜素结构稳定性,同时,甜菜素也会自发降解[46]。在β-葡萄糖苷酶或加热等条件下,甜菜红素由红色变为紫红色,是由甜菜红素脱糖基所致[3]。甜菜素亮度、红色程度、黄色程度都会随着储存时间变化。随储藏时间延长,甜菜素果汁的亮度增加,红色程度减小,黄色程度增加,储藏温度越高效果越明显[52]。总之,甜菜素的稳定性由多个因素共同影响,温度、pH 值、光照为主要因素,其中大多和氧气共同作用。提取甜菜素时氧气等因素几乎无法避免,因此,控制光照、pH 值、温度等其他因素尤为重要。
受环境影响,甜菜素极易降解,其颜色和生理活性也会随之改变,因此,其护色尤为重要。微胶囊化是将微小甜菜素粉末用涂层或基质包裹的过程,包封剂有许多种类,如糊精、淀粉、树胶、蛋白质等,包埋剂可避免甜菜素外界因素直接接触,从而维持甜菜素结构稳定[3]。Thirugnanasambandham 等[27]对仙人掌果甜菜素进行微胶囊化,并进行喷雾干燥,提高了甜菜素的稳定性。Selig 等[53]将多糖、海藻酸钠、阿拉伯树胶等材料与甜菜素结合,在600 MPa、25 ℃条件下处理3 min,显著提高了甜菜素在高温和低pH 值环境下的稳定性,同时不影响甜菜素的抗氧化性。肖默艳等[54]发现在甜菜素溶液中加入一些抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸和EDTA,能减少金属离子对甜菜素的降解,但当抗坏血酸的浓度高于0.7%时,反而促进甜菜素氧化。为了提高甜菜素稳定性,选择性添加保护剂或将其微胶囊化必不可少。
甜菜素安全、无毒、着色力强[55],我国GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中也将甜菜红素列为食品添加剂[56]。国外还有甜菜素的面条、饼干、酒水等产品,但国内相对较少[55]。目前甜菜素产品并不常见,一方面由于甜菜素的来源和稳定性局限其开发应用,另一方面由于对甜菜素的研究起步较晚,不为大众所熟知。甜菜素可用于饮料、冰淇淋、酸奶等食品着色。如Roriz 等[57]将甜菜素应用于冰淇淋着色,由于冰淇淋储存条与甜菜素保存条件相契合,在冰淇淋的货架期内甜菜素稳定,着色效果好,颇受消费者青睐。Ghasempour 等[58]发现0.1%~0.2% 的甜菜根提取物可以维持酸奶的生理活性,如益生菌活性、抗氧化活性等。总之,将甜菜素应用于食品开发时,应注意将产品与甜菜素储藏条件、生理活性等属性尽可能保持一致。
甜菜素在预防肥胖、冠心病、癌症等药物开发领域有重大应用前景。Haswell 等[59]发现甜菜素可以调节内皮型一氧化氮合酶的基因表达,控制血管收缩,从而起到降压和改善冠心病的作用。Lechner 等[60]认为少量食用甜菜素或富含甜菜素食物能预防癌症,将甜菜素和花青素一起食用对癌症的预防效果可能更好。此外,由于甜菜素高效的着色性能,还可用于制作化妆品。甜菜素色调自然,可预防紫外线、清除面部自由基、维持面部水分,具有易涂抹、易清洗、易降解的特点,其可用于开发胭脂产品[3]。Azwanida 等[22]把火龙果中甜菜素制作成口红,放置1 个月以后,口红的颜色由红色变成深红色,产品具有良好的涂抹性、光滑性、稳定性,有改善口唇干裂、起皱等作用。总之,甜菜素的应用不局限于医药食品领域,在化妆品、高分子材料等其它领域依然有巨大潜力。
天然甜菜素具有较高的营养价值和药用价值,在食品医药领域有巨大开发潜力。但是,基于甜菜素理化特性,未来对其研究与开发利用应从以下方向入手:1)寻找优质植物源甜菜素,培育富含甜菜素的作物,弥补甜菜根来源的甜菜素含土腥味的不足;2)制定物种特异的甜菜素提取标准,将其提取、纯化方法进行规范和统一,为后续学者研究甜菜素提供参考;3)开发基于微生物发酵和组织培养的生物反应器,获得快速生产甜菜素的方法,满足甜菜素工业化生产的需求;4)从选择合适的甜菜素包埋剂、螯合剂、抗氧化剂和酶制剂等方面入手,开发甜菜素优质护色剂;5)开发甜菜素食品、化妆品,减少人们对合成色素滥用等现象的担忧;6)加强甜菜素药物研发,开发相关的抗癌、抗菌、预防肥胖等药物。
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