亚硝胺是一类强致癌物，如二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamnie，NDEA）是致癌性最强的亚硝胺之一[1]。NDEA 能在发酵食品特别是香肠、腊肉、培根等发酵肉制品中生成，也能产生于人体胃肠内。此现象与发酵肉制品和人体胃肠内含有较丰富的亚硝酸盐、硝酸盐、蛋白质、氨基酸等多种NDEA 前体物有关，这些前体物在肉制品发酵、人体消化过程中逐步形成NDEA[2-4]。此外，亚硝胺的形成还与某些微生物能促进亚硝胺生成有关。有学者发现肠道无菌大鼠胃肠内的亚硝胺含量显著低于对照组的有菌大鼠[5-6]。Engemann 等[7]基于猪的盲肠模型研究也证实了肠道微生物的存在会促进亚硝胺形成。
课题组前期考察了37 株分离自健康人体肠道的乳酸菌对NDEA 的影响，发现其中19 株会促进NDEA形成。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）6A 的促进作用最强，可能由于L.plantarum 6A 在NDEA 胁迫下激发某些基因的表达。众所周知，乳酸菌在人体肠道菌群平衡和肉制品发酵方面不可或缺，它既是人体肠道菌群的常见微生物，也是发酵食品的关键微生物制剂。因此，研究乳酸菌与亚硝胺的关系、揭示乳酸菌促进NDEA 形成的机制尤为重要。
然而，乳酸菌促进NDEA 机理研究较少，促进作用的关键基因、调控蛋白、代谢通路等分子机制尚未阐明[8]。转录组学技术能深入挖掘细胞的基因转录和表达的序列信息，导入数据库后可进一步确定功能基因、构建转录途径，具有高效率、高分辨率和强分析力的优势，因此，近年来越来越多被应用于食品安全控制、食品微生物领域的机制研究[9-12]。
Tyx 等[13]基于转录组学探究了无烟烟叶中影响NDEA 形成的关键微生物和转录途径，证实硝酸盐/亚硝酸盐逆向运输蛋白促进烟叶中NDEA 的形成。Zeng等[14]采用转录组技术报道了发酵乳杆菌L.fermentum RC4 降解NO2-的关键基因，除已知调控亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase，NiRs）的nirB 基因外，还发现AdhE、lpdA、cysK 等也能参与调控氮代谢的基因，完善了乳酸菌降解NO2-的机理。
因此，本研究考察了不同环境因素对L.plantarum 6A 促进NDEA 生成作用的影响，基于环境因素结果，进一步采用转录组学分析了菌株促进作用的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）、调控蛋白和代谢途径，从分子层面构建L.plantarum 6A 对NDEA形成的促进机制，以期为阐明亚硝胺的生物合成提供研究思路，为发酵行业的发展和升级奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌种与试剂
试验菌种来自四川师范大学生命科学学院微生物学实验室提供的健康人体肠道乳酸菌，经过分离纯化、筛选和鉴定为L.plantarum。
NDEA 标准品（纯度＞99%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；酵母粉、牛肉膏：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲醇（色谱纯）、葡萄糖、柠檬酸三铵、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温80（均为分析纯）：上海易恩化学技术有限公司。试验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Aglient 1260）：美国安捷伦有限公司；紫外分光光度计（UV1102）：上海天美科学仪器有限公司；全自动高压灭菌锅（GI54DWS）：致微仪器有限公司；超纯水仪（UPT-II-5T）：四川优普超纯科技有限公司；电子天平（ME204/02）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超净工作台（HCB-1300V）：青岛海尔特种电器有限公司；电热恒温培养箱（HPX-9272MBE）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超低温高速冷冻离心机（Centrifuge 5804 R）：德国艾本徳股份有限公司；pH 计（PHS-320）：方舟科技有限公司；厌氧培养箱（JC-QX-II）：青岛聚创世纪环保科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 NDEA 的检测
采用高效液相色谱法检测NDEA。色谱柱：5020-01732 INERTSIL ODS-3（5 μm，4.6 mm×250 mm）；检测器：二极管阵列检测器；检测器波长：230 nm；流动相：甲醇/水=35/65；流速：0.8 mL/min；取1 mL 待测样品用0.22 μm 微孔滤膜过滤得滤液待检；进样量：10 μL。标准曲线为Y=65.209X-9.682 9（R2=0.999），浓度范围为0～10.0 μg/mL。
1.3.2 环境因素对L.plantarum 6A 促进作用的影响
L.plantarum 6A 于液体培养基[14]中培养12 h，离心（10 000 r/min）3 min，用灭菌生理盐水制得活菌量107 cfu/mL 的菌悬液。将菌悬液接种于含4.75 μg/mL NDEA 的pH6.0 液体培养基中，非NDEA 胁迫的对照组以等体积超纯水替代NDEA 溶液。置于37 ℃恒温培养箱内，分别培养3、6、9、12、24、48 h，考察培养时间对L.plantarum 6A 促进作用的影响；分别于4、20、37、42 ℃环境下培养24 h，考察温度对L.plantarum 6A 促进作用的影响；分别于培养基pH 值为2、3、4、5、6、7、8 的37 ℃恒温培养箱中培养24 h，考察pH 值的影响；分别于37 ℃的恒温培养箱或恒温厌氧培养箱中培养24 h，考察有/厌氧环境的影响。检测样品中NDEA 增量（即为NDEA 检测浓度与NDEA 初始浓度之差），同时，检测微生物的生长量（以OD600 表示）。
1.3.3 转录组分析
将L.plantarum 6A 菌悬液接种于含4.75 μg/mL NDEA 的pH5.0 液体培养基中，以等体积超纯水替代NDEA 溶液为非NDEA 胁迫的对照组。于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，超低温冷冻离心（7 000 r/min）3 min，将菌体沉淀用液氮急冻后于-80 ℃冰箱中保存，进行RNA 提取、完整性检查、文库构建及在Illumina平台进行测序。
DEGs 分析及功能注释：对处理组和对照组的DEGs 进行筛选，筛选标准为|log2差异倍数（fold change，FC）|≥1 且错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05。将DEGs 导入基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，运用超几何检验进行GO和KEGG 富集分析，确定DEGs 参与的代谢通路及所发挥的生物学作用。
1.4 数据处理
采用OriginPro 2018 制图。所有结果用平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 环境因素对促进作用的影响
培养时间、培养温度、pH 值、有氧/厌氧对菌株生长情况及L.plantarum 6A 促进NDEA 作用的影响，如图1 所示。
图1 环境因素对L.plantarum 6A 生长量及促进NDEA 作用的影响
Fig.1 Influence of environmental factors on growth of L.plantarum 6A and promotion of NDEA synthesis
A.培养时间；B.培养温度；C.pH 值；D.有氧/厌氧。
由图1 可知，对照组在不同培养时间、培养温度、pH 值、有氧/厌氧条件下，均无NDEA 生成，而试验组可检测到NDEA 含量增加（P＜0.05），说明L.plantarum6A 在NDEA 胁迫下表现为促进NDEA 形成，同时，试验组中菌株的生长量低于对照组。由图1A 可知，L.plantarum 6A 在0～24 h 生长迅速，之后生长量基本不变。试验组中NDEA 含量也表现为先增多后趋于平稳，与L.plantarum 6A 的生长情况变化趋势一致。图1B 可看出，菌株促进NDEA 的能力与其生长情况受温度影响的变化趋势相同：在4～37 ℃时，菌株的生长量和对NDEA 的促进作用随温度升高而逐渐升高，37 ℃时促进作用最强；在42 ℃的生长量比37 ℃略有减少，对NDEA 的促进作用也略有减弱。由图1C 可知，L.plantarum 6A 生长量OD600 值在pH5～pH7 范围内较高，在pH 值为5 时，对NDEA 促进作用最强，NDEA含量增加了1.76 μg/mL。L.plantarum 6A 在有氧环境中的生长情况、促进能力略强于厌氧环境（图1D）。为探索L.plantarum 6A 促进NDEA 的内在机制，进一步考察L.plantarum 6A 促进能力最强的环境中（pH5，37 ℃，有氧条件，4.75 μg/mL NDEA，24 h）与非NDEA胁迫的对照组（0 μg/mL NDEA）的DEGs。
2.2 转录组测序数据质量评估
对测序得到的原始序列进行过滤，进而对过滤后序列进行碱基测序错误率、鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine，GC）含量分布的考察以评估各样品的测序质量，具体结果见表1。
表1 L.plantarum 6A 的转录组测序数据质量统计
Table 1 Quality statistics of transcriptome sequencing data of L.plantarum 6A
样品名称对照组-1对照组-2对照组-3处理组-1处理组-2处理组-3原始测序序列29 367 664 33 847 480 48 509 848 30 956 028 41 741 844 38 772 340过滤后序列28 992 528 33 540 080 47 916 436 30 466 620 41 198 764 38 319 916测序碱基错误率/%0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 Q20/%98.12 98.11 98.49 98.28 98.19 98.21 Q30/%94.19 94.18 95.15 94.64 94.33 94.40 GC 含量/%44.60 44.56 44.58 44.59 44.56 44.58
转录组测序质量要求测序碱基错误率应小于1%，Q20、Q30 的比值应分别大于等于90% 和80%，GC 含量比例在50%左右。从表1 可知，本次测序的碱基错误率小于0.1%，Q20 和Q30 值均大于90%，处理组和对照组的平均GC 含量分别为44.58%和44.58%。表明转录组测序数据数量和质量可信度较高，可进行后续的数据分析。
同时，为保证后续定量分析的准确性，对3 个平行样品进行样品间相关性检测，结果见图2。
图2 样品相关性
Fig.2 Correlation among samples
在转录组学定量分析中要求有生物学重复的样品间R2 值应大于0.8，从图2 可以看出，对照样品及试验样品间的R2 均大于0.8，满足后续定量分析要求。
2.3 DEGs 分析
比较试验组和非NDEA 胁迫的对照组中L.plantarum 6A 的表达基因的差异，结果如图3 所示。
图3 L.plantarum 6A 的DEGs 火山图
Fig.3 Volcano plot of DEGs of L.plantarum 6A
火山图中，横坐标为基因在两组间表达差异的倍数变化值log2FC，纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值，值越高则表达差异越显著。图中每个点代表一个特定的基因，红色点表示上调基因，绿色点表示下调基因，蓝色点表示无差异基因。
图3 结果显示，两者共有52 个DEGs，其中，30 个基因上调、22 个基因下调。因此，将这些DEGs 导入GO 和KEGG 数据库，进一步分析L.plantarum 6A 促进作用的转录通路。
2.4 GO 富集分析
GO 是国际基因功能分类标准体系，包括生物过程、细胞组成和分子功能三部分，GO 数据库可以对DEGs 进行功能分类和富集分析。以矫正后的P＜0.05为评判指标，筛选出GO 富集最显著的通路进行分析，结果见图4。
图4 DEGs 的GO 富集分析
Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs
由图4 可知，L.plantarum 6A 在促进NDEA 过程中，DEGs 富集于生物过程通路的维生素合成和代谢过程、核黄素代谢和生物合成过程、含黄素化合物的复合代谢和生物合成过程、药物代谢过程；细胞成分中细胞外基质通路中的DEGs 上调；核黄素合酶复合物通路中的DEGs 下调；分子功能中的腺苷琥珀酸合酶活性、硫胺-磷酸二磷酸化酶活性通路中DEGs 上调；磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶活性通路中的DEGs 下调。
2.5 KEGG 富集分析
L.plantarum 6A 促进作用的DEGs 基于KEGG 功能分析的结果见图5。KEGG 的富集分析可用散点图表示，散点大小、颜色和富集分数都是KEGG 通路中DEGs 富集程度的指标。散点越大表示同一通路中富集的DEGs 数量越多，颜色越红表示富集越显著。富集分数表示该通路中富集的DEGs 数量与注释基因数量的比值，比值越大表示富集程度越高。
图5 DEGs 的KEGG 富集分析
Fig.5 KEGG enrichment analysis of DEGs
由图5 可知，DEGs 主要富集在嘌呤代谢、核黄素代谢途径，环境信息处理中的双组分体系和阳离子抗菌肽耐药性。其中，富集到嘌呤代谢途径的DEGs 有5 个上调基因（purA、purB、purC、purL、purK），2 个下调基因（guaC、frdA）；富集到核黄素代谢途径的有3 个DEGs，均是上调基因（ribBA、ribH、ribE）；富集到双组分体系的有3 个上调基因（dltD、dltB、dltA）和2 个下调基因（frdA、cydA）。
3 讨论
乳酸菌既是食品中常用发酵剂，也是人体肠道中优势益生菌。然而，亚硝胺在发酵食品和胃肠道中相对容易形成，乳酸菌促进亚硝胺形成的作用特性和内在机制尚待阐释。因此，首先考察了环境因素对L.plantarum 6A 促进作用的影响。NDEA 胁迫L.plantarum 6A 表现出促进亚硝胺形成，培养时间、培养温度、氧气含量、pH 值对菌株的促进能力与其生长量的影响变化一致，呈正相关关系。可能由于在NDEA 胁迫下，菌株生长的同时产生了NDEA 的前体物，或是产生加快亚硝胺形成的某些催化剂[15]。所以，基于环境因素的研究，进一步采用转录组技术探究促进作用的关键基因和转录途径，构建L.plantarum 6A 促进NDEA 的可能机制，如图6 所示。
图6 L.plantarum 6A 促进NDEA 生成的机制
Fig.6 Mechanism of L.plantarum 6A in promoting NDEA synthesis
L.plantarum 6A 的促进作用与NDEA 诱使该菌的DEGs 表达有关。其中，purL、purK、purC、purB、purA 基因调控嘌呤代谢，ribBA、ribH、ribE 控制核黄素即水溶性维生素B2 的代谢和合成。由于亚硝胺的化学结构中氮元素占比较高，结构中的氨基和亚硝基都含有氮原子，所以富含氮元素的嘌呤和核黄素很可能为NDEA 形成提供原料。
L.plantarum 6A 在NDEA 胁迫下，嘌呤合成/代谢途径中一系列purL、purK、purC、purB、purA 基因上调，这些基因调控嘌呤的多步合成，影响嘌呤生物形成中氮元素的转移[16]。例如，purL 调控甲酰甘氨脒核苷酸合成酶，是腺嘌呤生物合成的关键基因[17-18]。purK 编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶，与氨基咪唑核苷酸（amino-imidazole ribotide，AIR）有关，AIR 是嘌呤核苷酸合成过程中形成咪唑环的中间产物，经过多步合成嘌呤核苷酸。purC 调控的磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酰胺合成酶是细菌生长传代中不可缺少的酶，是嘌呤生物合成途径中的关键酶之一[19]。purB 编码腺苷丁二酸裂解酶催化次黄嘌呤核苷酸（inosine monphosphate，IMP）的合成，是基因转录和细胞代谢的关键调控因子[20]。purA 编码腺苷琥珀酸合成酶，可催化IMP 反应生成腺苷琥珀酸[21]。purC、purB、purA 基因的表达还可促进琥珀酸、丁二酸的生物合成，而这两种酸是反硝化细菌的能量来源，反硝化细菌可将硝酸盐转化为亚硝酸盐、NO、NO2 等亚硝化剂，亚硝化剂进一步与胺类物质结合，生成亚硝胺。上述基因参与了嘌呤的合成/转化，可能促进氮元素从嘌呤、核苷酸或AIR、腺苷琥珀酸等物质向亚硝胺的转移，即为NDEA 的形成提供前体物，或是通过产生酶，间接催化NDEA 的形成。
嘌呤合成之后，核黄素以鸟嘌呤核苷酸三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）为起始进行合成，同时，核黄素还是多种氧化还原酶的辅酶，有递氢的作用、加快细胞代谢与氮元素的转移[22]。因此，核黄素也可能为L.plantarum 6A 促进亚硝胺的形成提供了前体物。参与此通路的DEGs 是ribBA、ribH、ribE，可调控核黄素激酶和核黄素合成酶的产生，可能加速亚硝化反应形成亚硝胺。
双组分体系反映了微生物感受和对抗外界环境变化的调控能力[23-24]。在该途径中的DEGs 为dltD（D-丙氨酸转移蛋白）、dltB（D-丙氨酰转移蛋白）、dltA（D-丙氨酸-聚磷酸二醇连接酶亚基），均为编码磷酸乙醇胺转移酶的基因，作用于细菌细胞壁内膜，与丙氨酸密切相关。有研究表明，丙氨酸是NDEA 形成的前体物，肉制品中丙氨酸的含量与NDEA 生产量呈正相关。可能是丙氨酸在微生物作用下发生脱羧反应，再与亚硝酸盐、NO、NO2 等亚硝化试剂反应生成NDEA[25-26]。由上可知，NDEA 胁迫L.plantarum 6A 编码嘌呤核苷酸合成/代谢、核黄素合成/代谢以及双组分系统途径的差异基因，通过产生NDEA 前体物促进其形成，还可能通过核黄素合成/代谢以及双组分系统产生某种酶进而催化亚硝胺形成[27]。
4 结论
本研究考察了在NDEA 胁迫下，环境因素对L.plantarum 6A 促进NDEA 形成的影响，进而采用转录组技术构建L.plantarum 6A 促进的机制途径。L.plantarum 6A 主要通过嘌呤代谢/合成、核黄素代谢/合成、双组分体系形成亚硝化前体物，从而促进NDEA 形成。其中，purL、purK、purC、purB、purA 基因调控嘌呤代谢/合成，ribBA、ribH、ribE 基因上调核黄素代谢/合成途径，产生富含氮元素的嘌呤和核黄素，可能为亚硝胺的合成提供原料，双组分体系中dltD、dltB、dltA 与丙氨酸密切相关，丙氨酸是形成NDEA 的前体物。同时，L.plantarum 6A 生长过程中可能产生加速亚硝化反应的物质。结果揭示乳酸菌对亚硝胺形成的促进机制。表明抑制L.plantarum 6A 促进作用基因的表达，或控制嘌呤、核黄素、丙氨酸等亚硝胺前体物含量，能减少亚硝胺的形成。本结果将为肠道菌群研究和益生菌应用奠定理论基础，有助于高效改进传统发酵食品工艺，提升发酵食品的安全性。
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