大黄鱼（Larimichthys crocea）和小黄鱼（Larimichthys polyactis）均为石首鱼科、黄鱼属鱼类，统称为黄鱼，又名黄花鱼、石首鱼、桂花鱼，在我国黄海、渤海、东海、南海四大海域均有分布，是重要的海洋经济鱼类，大、小黄鱼与带鱼、乌贼被列为我国四大海产。大黄鱼、小黄鱼不仅肉质细腻、口感鲜美，而且富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素以及钙、磷、铁、钾、镁、硒等营养成分，具有较高的营养价值。
因大黄鱼、小黄鱼食用品质好，其价格高于一般海鱼，市场上黄鱼假冒、虚标的现象时有曝出。在冰鲜鱼销售方面，由于鱼类种类较多，部分形体相近、结构相似难以区分，不法商贩在利益驱动下借此假冒虚标、造假混杂，如以黄姑鱼、白姑鱼、三牙鱼冒充黄鱼销售[1-2]。而对于黄鱼加工制品，如鱼片、鱼干、鱼罐头、鱼酥、鱼丸等，由于不具备原有形态特征，改变了口感风味，部分使用了调味料，更容易弄虚作假。针对这些乱象，迫切需要技术监管识别鱼类成分的真实性，以维护消费者权益、确保食用安全。
长期以来，围绕鱼类产品真假鉴别，已开发了多种方法，除了传统的以外形特征为依据的形态法，还包括以特征化合物为基础的波谱分析法如红外光谱法[3-4]、拉曼光谱法[5-6]等，以蛋白质为分析对象的电泳法[7-8]、色谱及色谱质谱联用法[9-10]、酶联免疫法[11-12]，以DNA为监测对象的分子生物学法如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法、荧光定量PCR 法、等温PCR 法等[13-15]。由于实际样品分析过程不确定性较大，特别是对于加工制品而言，样品中干扰因素增多以及蛋白质变性等情况发生，在一定程度上制约了波谱分析法和蛋白分析法使用，而遗传物质DNA 分子具有高度的稳定性和物种特异性，因此，以DNA 为监测对象的分子生物学法是鱼源性成分分析最为理想的选择方案。其中，实时荧光定量PCR 法因灵敏度高、特异性好、操作便捷且具有一定的定量功能，是当前分子生物学检测最常用的手段，而数字PCR 技术因具有绝对定量的性能，被认为是第三代PCR 技术，目前已有将其应用于肉制品掺假鉴别的报道[16-20]。关于黄鱼成分鉴伪分析，已有利用线粒体DNA ND6 基因为目标的实时荧光定量PCR 方法[21]，但使用效果不理想。
细胞线粒体DNA 具有保守性，细胞色素b（Cyt b）基因、细胞色素C 氧化酶亚基I（COI）基因和16S rRNA 基因常作为物种鉴别的目标基因，其中以细胞色素b（Cyt b）基因使用最为广泛[22]。本研究基于黄鱼线粒体DNA 细胞色素b（Cyt b）保守序列，设计引物和探针，建立大黄鱼、小黄鱼及其制品的多重荧光定量PCR鉴别方法。同时，首次将数字PCR 技术应用于黄鱼成分的定量和定性分析，以期为黄鱼鱼源性成分有效识别提供新方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大黄鱼、小黄鱼、白姑鱼、黄姑鱼、罗非鱼、油鱼：市售；海洋动物DNA 提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；TaqProbe 2X qPCR-Low-ROX 预混液、核酸电泳相关试剂（琼脂糖、10X TBE 缓冲液预混合粉末，4S GelRed 核酸染料、50～500 bp DNA 标准分子量Marker、6X 甘油凝胶上样缓冲液）、荧光定量PCR 引物及探针：生工生物工程（上海）股份有限公司；d PCR Supermix for Probes（No dUTP）：美国Bio-rad 公司；三氯甲烷、无水乙醇（均为分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；上海振兴化工一厂；异丙醇（色谱级，99.8%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
实时荧光定量PCR 仪（7500）：美国ABI 公司；数字PCR 仪（QX 200）、梯度PCR 仪（C1000 Touch）、核酸电泳仪（Power Pac/Mini-Sub Cell GT）：美国Bio-rad 公司；高速冷冻离心机（TGL-16.5M）：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；高移液器（2.5、10、200、1 000 μL）：德国Eppendorf 公司；超微量分光光度计（DEAOU-US 200）：广州迪澳生物科技有限公司；恒温干浴器（GC-100）、离心机（MINI-6K）：杭州佑宁仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA 提取
取代表性样品，粉碎、碾磨均匀后，按照海洋动物DNA 提取试剂盒说明书进行操作，整个过程应避免交叉污染。DNA 提取完成后，使用超微量分光光度计进行测定，确保A260/A280 在1.8～2.0。
1.3.2 常规PCR 反应
常规PCR 反应体系组成包括PCR 反应液12.5 μL、浓度为10 μmol/L 的上游引物1 μL、浓度为10 μmol的下游引物1 μL，加入模板DNA 2 μL，补充双蒸水至25 μL。PCR 反应参数为第一步：95 ℃变性10 min；第二步：95 ℃变性15 s，58 ℃退火，72 ℃延伸60 s，循环40 次；4 ℃保存。
1.3.3 核酸电泳
配制浓度4% 的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，上样量20 μL，恒压110 V，电泳时间100 min，使用4S Gel-Red 进行染色。
1.3.4 实时荧光定量PCR 检测
1.3.4.1 实时荧光定量PCR 反应体系
实时荧光定量PCR 反应体系组成包括荧光定量PCR 反应液12.5 μL、浓度为10 μmol/L 的上游引物各1 μL、浓度为10 μmol/L 的下游引物各1 μL、浓度为10 μmol/L 的探针各0.5 μL，加入模板DNA 2 μL，补充双蒸水至25 μL。
1.3.4.2 荧光定量PCR 反应参数
第一步：95 ℃变性10 min，第二步：95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s 并收集荧光信号，循环40 次。
1.3.4.3 特异性分析
提取白姑鱼、黄姑鱼、罗非鱼、油鱼等其他鱼类DNA 作为模板，利用所建立的荧光定量PCR 方法进行分析，验证本研究所设计的引物和探针的特异性。
1.3.4.4 灵敏度分析
提取大黄鱼、小黄鱼DNA，用超微量分光光度计进行定量，按比例混合后按10 倍梯度稀释，利用本研究建立的荧光定量PCR 方法检测体系进行检测，考察检测下限，根据循环阈值（cycle threshold，Ct）对方法的灵敏度进行评价。
1.3.4.5 重复性分析
将同一浓度的混合模板利用本研究所建立的多重荧光定量PCR 检测方法进行3 次分析，比较扩增结果。
1.3.5 数字PCR 检测方法
数字PCR 反应体系总量为20 μL，包括数字PCR反应液dd PCR Supermix for Probes（No dUTP）10 μL、浓度为20 μmol/L 的大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞色素b（Cyt b）两种上游引物各0.9 μL、浓度为20 μmol/L 的两种下游引物各0.9 μL、浓度为10 μmol/L 的两种探针各0.5 μL，加入模板DNA 2 μL，补充双蒸水至20 μL。
每反应体系使用70 μL 微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96 孔板密封后进行扩增。数字PCR 扩增参数为第一步：95 ℃变性5 min；第二步：94 ℃变性30 s，60 ℃退火/延伸60 s，循环40 次；第三步：98 ℃变性10 min，4 ℃保存。随后转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取。
2 结果与分析
2.1 引物设计
在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库筛选出大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞色素b（Cyt b）和真核生物18S rRNA 保守序列片段，见表1。分别针对目标片段设计引物和探针，其中18S rRNA 保守序列片段作为内参基因，引物及荧光探针具体信息见表2。
表1 目标扩增片段
Table 1 Target amplified fragments
目标基因大黄鱼Cyt b 基因长度/bp 107小黄鱼Cyt b 基因101真核生物18S rRNA基因137引物和探针序列GGC CTGAACTCGG ATATAGATAA GATCCCATTC CACCCCTACT TCACCTATAA AGACCTTCTA GGCTTTGCAA TCCTCATTAT CTGCCTTACC ACCCTAGCTC TCTT T CATCCGTTGC ACACATCTGC CGCGACGTAA ACTACGGATG ACTCATCCGA AACCTTCATG CCAACGGTGC CTCTTTCTTT TTTATCTGCC TCTACCTCCA TCTGCCCT ATCAACTTTC GATGGTACTG TCTGTGCCTA CCATGGTGAC CACGGGTAAC GGGGAATCAG GGTTCGATTC CGGAGAGGGA GCCTGAGAAA CGGCTACCAC ATCCAAGGAA GGCAGCAGGC GCGCAAATT
表2 引物和探针信息
Table 2 Primer and probe information
目标基因大黄鱼Cyt b 基因小黄鱼Cyt b 基因真核生物18S rRNA 基因引物和探针序列上游引物5′-GGCCTGAACTCGGATATAGA-3′下游引物5′-AAGAGAGCTAGGGTGGTAAG-3′探针5′-FAM-AGACCTTCTAGGCTTTGCAATCCTCA-BHQ1-3′上游引物5′-TCATCCGTTGCACACATC-3′下游引物5′-TGGAGGTAGAGGCAGATAAA-3′探针5′-VIC-TGACTCATCCGAAACCTTCATGCCAA-BHQ1-3′上游引物5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′下游引物5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′探针5′-Cy5-TTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1-3′
2.2 核酸电泳
利用上下游引物对大黄鱼、小黄鱼DNA 提取液进行扩增，利用4%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1 所示。
图1 核酸电泳结果图
Fig.1 Results of nucleic acid electrophoresis
M.DNA 分子量标记；1.真核生物18S rRNA 扩增片段基因；2.大黄鱼Cyt b 基因扩增片段；3.小黄鱼Cyt b 基因扩增片段。
由图1 可知，内参基因、大、小黄鱼样品DNA 扩增条带单一，根据迁移位置与标样对比，可以看出分子量分布与所扩增的片段长度大小基本保持一致，说明引物特异性较好。
2.3 多重荧光定量PCR 分析检测
大黄鱼、小黄鱼混合DNA 模板样本多重实时荧光定量PCR 扩增结果如图2 所示。
图2 大黄鱼、小黄鱼混合DNA 模板样本多重实时荧光定量PCR扩增结果
Fig.2 Multiplex real-time fluorescent quantitative PCR amplification results of mixed DNA template samples of L.crocea and L.polyactis
由图2 可知，多重荧光定量PCR 结果出现3 条S型典型扩增曲线，分别代表大黄鱼Cyt b 基因、小黄鱼Cyt b 基因和内参基因扩增结果。
特异性试验荧光定量PCR 结果见图3。
图3 各类鱼样本多重实时荧光定量PCR 扩增结果
Fig.3 Multiplex real-time fluorescence quantitative PCR amplification results of various fish samples
A.大黄鱼样本；B.小黄鱼样本；C.白姑鱼样本；D.黄姑鱼样本；E.罗非鱼样本；F.油鱼样。
由图3A 可知，大黄鱼样本中大黄鱼Cyt b 基因、内参基因出现S 型典型扩增曲线，表明两种基因检出；由图3B 可知，小黄鱼样本中小黄鱼Cyt b 基因、内参基因出现S 型典型扩增曲线，表明两种基因检出。由图3C～图3F 可知，白姑鱼、黄姑鱼、罗非鱼、油鱼仅有内参基因扩增出现典型扩增曲线，这表明本研究所设计的引物和探针在所选择物种测试范围内具有特异性。
灵敏度分析结果显示，样品质量分数相当于0.1%多重荧光定量PCR 值仍小于35，表明检出限可达0.1% 质量分数。重复性分析结果显示，Ct 值偏差在5%以内，表明方法重复性良好。
2.4 数字PCR 分析结果
以黄姑鱼DNA 为阴性对照，利用数字PCR 对大、小黄鱼随意稀释混合DNA 进行分析，结果见图4。
图4 数字PCR 结果
Fig.4 Results of digital PCR
A、B 分别代表大黄鱼、小黄鱼阴性对照结果；C、D 分别代表样本中大黄鱼、小黄鱼一维微滴散点图；E 代表二维微滴散点图。
由图4A、图4B 可知，阴性扩增体系两个荧光通道终点荧光值仅有一条区带且信号较低；而图4C、图4D样本扩增体系中两个荧光通道各有两条区带，其中荧光信号低的区带为阴性微滴，荧光信号低的区带为阳性微滴，表明两通道结果均为检出，即检出大黄鱼和小黄鱼成分，根据样本微滴数分析，在10 255 个微滴中，大黄鱼微滴数为7 128、小黄鱼微滴数为3 816；图4E二维散点图中，则进一步显示样本微滴分布即微滴中包含两种信号的微滴个数为2 687，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为4 441，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为1 129，不含有荧光信号的微滴个数为1 998。表明数字PCR 能够有效区分目标成分，适用于鱼类掺假鉴别，同时，数字PCR 可以直接给出各组分的具体微滴拷贝数，对于各组分含量给出准确、直观的结果。当然这不仅需要样本中各组分相对均匀并具有相似的DNA 提取效率，还需要以单拷贝基因目标为前提[23]。
3 讨论与结论
本研究首次以大、小黄鱼细胞色素b（Cyt b）基因为目标，设计了特异性引物和Taqman 探针，分别建立了实时荧光定量PCR 和数字PCR 两种黄鱼成分鉴别方法，两种方法均能有效识别大小黄鱼鱼源性成分，结果准确可靠，可以用作黄鱼掺假识别的依据。其中，所建立的多重荧光定量PCR 包含了内参基因目标分析，有利于对核酸提取效果进行监控，判断DNA 提取的有效性；另外，由于本研究所采用的数字PCR 系统为两个通道，故仅以大、小黄鱼两个扩增目标为例，探索其在鱼源性成分识别应用的可能性，结果可以看出，数字PCR 具有绝对定量功能，在给出定性结论的同时，能够直接获得样本各类型微滴拷贝数。因此，可以进一步计算出各组分的比例关系，从而可以有效避免将食品污染误判为掺假的发生。
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