生物胺（biogenic amines，BAs）是一类低分子质量有机碱性化合物，广泛存在于发酵和腐败食品中，主要通过氨基酸脱羧形成[1-3]。低浓度的生物胺是生物体内不可缺少的生物活性物质[4]，然而摄入高浓度的BAs可损害人体健康[5～7]。食源性摄入高水平的BAs 可能导致食物中毒症状，包括头痛、呕吐、心悸、胸闷，甚至哮喘。当BAs 的摄入量为8～40 mg 时，就会出现轻微的中毒症状；超过100 mg 时，则属于严重中毒，甚至危及生命。作为具有生物活性的小分子，生物胺可以作为食品腐败和污染的重要指标。因此，发酵食品中生物胺的监测对于有效控制食品质量安全起到重要作用。色谱技术是食品中生物胺含量测定的最常用方法。目前食品中生物胺的检测方法包括高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-10]、液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spe，LC-MS）法[11]、离子色谱（ion chromatography，IC）法[12]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[13]、薄层色谱（thinlayer chromatography，TLC）法等[14]。然而，这些方法需要对样品进行繁琐的前处理（如液相色谱需要进行化学衍生），试剂消耗量大、分析耗时，并对仪器设备以及操作人员的专业性要求高。因此，开发具有成本效益和准确的现场检测技术来监测食品安全是迫切及不可或缺的。
基于食品安全控制分析的光学传感器，由于其即时、低成本、操作简单，已被证明是监测食品安全的实用方法。对于生物胺的监测，主要有两个典型的光学传感器。一种是荧光传感器，例如基于荧光阳离子共轭聚合物荧光探针[15]，由不对称过甲基二酰亚胺分子组装的荧光纳米管[16]、甲基红@镧系金属-有机框架[17]和纤维素基比率荧光材料[18]，这些荧光传感器具有高灵敏度，但受到探针的光漂白，限制了长期监测的应用；另一个是比色传感器，比色传感主要包括金纳米粒子[19]、单壁碳纳米管/金属卟啉复合材料[20]、聚二乙炔纳米纤维[21]、功能性芳香族聚酰胺[22]等。上述传感器需要进行繁琐的探针合成过程，这使得方法的制备成本和时间成本提升。
本研究提出了一种简单、经济效益高和无损的传感策略，以评估发酵食品中的生物胺。受β-D-半乳糖五乙酸酯（β-D-galactose pentaacetate，β-D-GP）在碱性环境下被水解为β-D-半乳糖的启发[23]，将β-D-GP（作为还原剂前体）和氯金酸（作为比色物质）融合到琼脂糖凝胶中，研制一种便携式的功能性水凝胶。并通过红/绿/蓝（red/green/blue，RGB）分析手段和紫外可见分光光度法，对食品中的BAs 含量进行监测，以期为食品安全提供一种快速的现场分析手段。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
组胺（histamine，His）、酪胺（tyramine，Tyr）、色胺（tryptamine，Trp）、β-苯乙胺（phenylethylamine，Phe）、腐胺（putrescine，Put）、尸胺（cadaverine，Cad）、亚精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）（纯度≥98%）：上海麦克林生化科技有限公司；四氯金酸三水合物（HAuCl4·3H2O，纯度99.9%）、β-D-GP（纯度98%）：上海阿拉丁生化科技有限公司；琼脂糖：北京索莱宝科技有限公司；柠檬酸钠（Na3C6H5O7，分析纯）：西陇化工股份有限公司；试验用水为超纯水；酱油、米酒、腌菜样品：市售。
1.2 仪器与设备
TENsoR27 型傅立叶变换红外光谱仪：德国Bmker公司；Tecnai G2 TF30 场发射透射电子显微镜：荷兰FEI 公司；测试木盒（内部尺寸24 cm×19 cm×12 cm，内贴A4 白色纸，手机摄像头与比色皿距离为12 cm，LED 面光源固定在木箱顶部）：昆明理工大学生命科学与技术学院药物分析组实验室自制；UV-2600 紫外-可见分光光度计：日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 便携式功能水凝胶的制备
参照文献[24]的方法，采用微量离心管管帽制备便携式功能水凝胶，具体方法如下：15 mg 琼脂糖分散溶解在33 mL 超纯水中后，置于微波炉中，微波加热3 min，待琼脂糖完全溶解后，加入500 μL HAuCl4（50 mmol/L）和1 mL β-D-GP（浓度为30 mmol/L），混匀后，将混合液（200 μL）转移至1.5 mL 微量离心管（eppendorf，EP）管帽中，铺满，在室温下自然冷却，凝固形成功能水凝胶。
1.3.2 酪胺的检测
1.3.2.1 影响酪胺检测的因素考察
pH 值的影响：取100 μL 酪胺（1 mg/mL）、100 μL β-D-GP 分别于装有2.3 mL pH 值为4、5、6、7、8 缓冲溶液的5 支15 mL 试管中，常温反应5 min 后，加入10 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4 溶液，室温反应5 min 后，测定其546 nm 处的吸光值变化。
温度的影响：取100 μL 酪胺（1 mg/mL）、100 μL β-D-GP 分别于装有2.3 mL pH7 磷酸盐缓冲溶液的5 支15 mL 试管中，于不同温度（25、35、45、55、65 ℃）下孵育5 min，加入10 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4 溶液，继续反应5 min 后，测定其546 nm 处的吸光值变化。
β-D-GP 浓度的影响：取100 μL 酪胺（1 mg/mL）和100 μL 不同浓度的β-D-GP（0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mmol/L）于装有2.3 mL pH7 的磷酸盐缓冲溶液的5 支15 mL试管中，于65 ℃条件下孵育5 min，加入10 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4 溶液，继续反应5 min 后，测定其546 nm 处的吸光值变化。
氯金酸浓度的影响：取100 μL 酪胺（1 mg/mL）和2.4 mmol/L 的β-D-GP 到装有2.3 mL pH 值为7 的磷酸盐缓冲溶液的5 支15 mL 试管中，于65 ℃孵育5 min，分别加入5、10、15、20、25 μL 浓度为50 mmol/L的HAuCl4 溶液，继续反应5 min 后，测定其546 nm 处的吸光值变化。
1.3.2.2 酪胺的比色检测
取200 μL 浓度为30 mmol/L 的β-D-GP 于9 支15 mL 试管中，分别加入不同体积（1、5、10、20、50、100、200、300、400 μL）的酪胺（1 mg/mL），用pH7 的磷酸盐缓冲溶液补足到3.485 mL 后，在65 ℃条件下反应5 min，再加入15 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4溶液，室温反应5 min 后，测定其紫外光谱变化，并记录其在546 nm 处的吸光值变化。
1.3.2.3 酪胺的RGB 检测
功能水凝胶制备完毕后，将一系列不同浓度Tyr（200 μL）的水溶液放入离心管底部，在此操作中，确保Tyr 水溶液不会与功能水凝胶直接接触。然后，将整个离心管密封，在65 ℃水浴中加热1 h，使Tyr 蒸汽渗透到功能水凝胶中，引起Au3+和被水解的β-D-GP 之间的还原反应，并记录功能水凝胶的颜色变化，颜色稳定后对上述试验结果进行拍照。
在1.5 mL 含便携式水凝胶的EP 管中，分别加入不同体积（2、4、8、20、40、80、120、160、200 μL）的酪胺（1 mg/mL），用水补齐到1 mL 后，盖上管盖，于65 ℃的水浴中反应1 h 后，拿出EP 管盖，拍照取色；获得的图片用Photoshop CC 2017 采集绿色（green，G）通道数据。
1.3.2.4 方法选择性
取200 μL 浓度为30 mmol/L 的β-D-GP 于9 支15 mL 试管中，分别加入200 μL 组胺、酪胺、色胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺（1 mg/mL），用pH7 的磷酸盐缓冲溶液补足到2.485 mL 后在65 ℃下反应5 min，再加入15 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4 溶液，室温反应5 min 后，测定其紫外光谱变化，并记录其在546 nm 处的吸光值变化。
1.3.3 发酵食品中酪胺的测定
样品制备：分别在1 g 的酱油、米酒和腌菜汁等样品中加入5 mg 和100 mg 的酪胺，分别加995 mg 和900 mg 的水混匀后备用。
比色法：取200 μL 浓度为30 mmol/L 的β-D-GP于9 支15 mL 试管中，分别加入100 μL 样品，用pH7的磷酸盐缓冲溶液补足到2.185 mL 后65 ℃反应5 min，再加入15 μL 浓度为50 mmol/L 的HAuCl4 溶液，室温反应5 min 后，测定其紫外光谱变化，并记录其在546 nm 处最大吸收峰的吸光值变化。
RGB 法：与线性试验一致，在1.5 mL 的EP 管中，分别加入100 μL 样品，用水补齐到1 mL 后，盖上EP管盖，于65 ℃的水浴中反应1 h 后，拿出EP 管盖。同时记录功能性水凝胶的颜色变化，并通过RGB 进行量化分析。
1.4 数据处理
数据经过Excle 整理，Chemdraw19.0 进行结构式绘图，华为Mate 30 Pro 进行图像采集，Power Point 2016进行示意图绘图，Originpro 2021 进行数据作图，Photo-Shop 2024 对图像的RGB 值分析。
2 结果与分析
2.1 传感原理
便携式检测生物胺（酪胺）的原理如图1 所示。
图1 便携式检测酪胺的原理
Fig.1 Principle of portable detection of tyramine
首先，将HAuCl4（显色底物）和β-D-GP（还原剂前体）固化在琼脂糖凝胶中，制备便携式功能水凝胶；当发酵食品中BAs（酪胺）被释放到功能水凝胶存在的环境时，催化β-D-GP 水解生成还原产物β-D-半乳糖，可使金离子（Au3+）随颜色变化还原生成金纳米粒子（Au nanoparticles，AuNPs），颜色变化保持了足够的颜色分辨率，容易被肉眼分辨，此外，颜色信息可以通过智能手机记录并通过RGB 分析进行数字化。RGB 通道G 的值与酪胺的浓度有关，可以用来检测发酵食品的酪胺。通过一系列的控制试验，证实了便携式功能水凝胶测定发酵食品BAs（Tyr）的可行性，结果如图2 所示。
图2 紫外-可见吸收光谱法检测酪胺
Fig.2 Detection of tyramine by ultraviolet-visible absorption spectroscopy
（1）水；（2）HAuCl4；（3）β-D-GP；（4）Tyr；（5）HAuCl4+Tyr；（6）HAuCl4+β-D-GP；（7）HAuCl4+β-D-GP+Tyr。
由图2 可知，纯琼脂糖水凝胶在300～600 nm 处无明显紫外吸收。通过分别滴加1 或2 种底物（如将HAuCl4、β-D-GP 和Tyr），水凝胶仍无颜色变化和明显吸收峰出现；只有当所有的底物（包括HAuCl4、β-D-GP和Tyr）同时加入时，才在约546 nm 处观察到一个新的紫外吸收峰，伴随着水凝胶由透明到紫色的颜色变化。新峰与AuNPs 的吸收一致，这些结果进一步证实了在Tyr 的催化水解作用下，β-D-GP 可能被转化为还原产物β-D-半乳糖，进而使Au3+还原为Au 纳米粒子。
2.2 便携式功能水凝胶测定酪胺的条件优化
pH 值、β-D-GP 用量、HAuCl4 用量和温度都会对反应造成影响，为了获得最适反应条件，测定上述条件变化下546 nm 处吸光值变化，结果如图3 所示。
图3 不同反应条件对试验体系的影响
Fig.3 Influence of different reaction conditions on test system
a.溶液pH 值；b.β-D-GP 浓度；c.HAuCl4 浓度；d.反应温度。
由图3a 可知，反应体系对酸较敏感，酸性条件下，催化活性下降，546 nm 处吸光值较弱，pH7 时，吸光值最大，随着碱性增强，吸光值反而降低。证明中性环境为最适反应条件。因此，研究选用pH 值为7 的磷酸盐缓冲溶液进行下一步试验。
由图3b 可知，随着β-D-GP 浓度升高，体系吸光值增加，当浓度达到2.4 mmol/L 后吸光值变化不大，考虑成本因素，后续选2.4 mmol/L 的β-D-GP 浓度进行试验；如图3c 所示，随着HAuCl4 的浓度升高，体系吸光值先升高后降低，浓度为0.3 mmol/L 时，吸光值达到最大，因此，后续最佳试验条件为β-D-GP 和HAuCl4浓度分别是2.4 mmol/L 和0.3 mmol/L。
如图3d 所示，随着反应温度的升高，凝胶的颜色逐渐加深，同时吸光值也逐渐增大。当温度达到65 ℃时，体系吸光值达到最大，后续温度可能会使其颜色加深，但考虑到采色和能耗问题，因此本试验选择65 ℃作为反应最适温度。
2.3 便携式功能水凝胶检测生物胺
在优化后的试验条件下，按1.3.2.2 中方法进行试验，加入不同浓度Tyr 标准溶液。考察Tyr 浓度和564 nm 处吸光值以及和G 值之间的关系，结果如图4所示。
图4 酪胺的定量曲线
Fig.4 Quantitative curve of tyramine
a.不同浓度酪胺的吸收光谱；b.不同浓度酪胺与吸光度的线性关系；c.RGB 检测示意图；d.不同浓度酪胺与G 值的线性关系
由图4b 可知，随着Tyr 浓度增加，溶液颜色逐渐变深，测定其紫外吸收光谱如图4a 所示，吸光值呈现增强趋势。继而选取λ=546 nm 处的吸光值为纵坐标，以Tyr 浓度为横坐标，绘制标准曲线如图4b。Tyr 浓度在0.25～160 μg/mL 范围内546 nm 处吸光值和浓度之间呈现较好的线性关系，相关系数（R2）为0.997，检出限（limit of detection，LOD）为0.1 μg/mL。
按1.3.2.3 中方法用手机进行凝胶信号采集，随着Tyr 溶液浓度的增加（图4c 和图4d），肉眼可以很容易地观察到功能水凝胶由透明到紫色的颜色变化。响应信号定义为功能水凝胶图像中G 值，可用于定量Tyr的浓度，由图4d 可知，响应信号值与Tyr 浓度在2～200 μg/mL 浓度范围内呈现较好的线性关系，相关系数（R2）为0.995，LOD 为0.32 μg/mL。
2.4 便携式功能水凝胶检测酪胺的选择性
由于发酵食品中包括多种不同BAs，考察不同BAs 对水解诱导还原反应的反应响应，结果如图5所示。
图5 共存生物胺对水凝胶检测体系的影响
Fig.5 Influence of coexisting BAs on hydrogel detection system
图5 可以明显看出只有Tyr 才能让水凝胶中氯金酸还原为金纳米变色。这可能是因为酪胺的碱性使得β-D-GP 水解产生的半乳糖具有还原性以及芳环结构中的酚羟基的协同作用。故方法具有选择性，其他生物胺对其干扰可忽略不计。
2.5 发酵食品中酪胺测定
按1.3.3 部分样品处理，在最优条件下，对腌菜汁、米酒和酱油3 种液体样品进行加标试验，所测得样品中生物胺含量如表1 所示。
表1 发酵食品样品中Tyr 含量的测定结果（n=6）
Table 1 Determination of Tyr content in fermented food samples（n=6）
样品腌菜汁加标量（比色法）/（μg/mg）测定值/（μg/g）0 5 100 RGB 5.9 101.2回收率/%比色法100.0 96.1 RGB 118.0 101.2米酒0 5 100酱油0 5 100比色法1.1 6.1 97.2 1.5 6.3 103.5 10.5 15.9 116.1 6.0 100.4 8.7 14.9 109.7 96.0 102.0 108.0 105.6 120.0 100.4 124.0 101.0
由表1 可知，RGB 和比色法的检测结果较为一致，且样品的加标回收率在96.0%～124.0%范围内，表明本方法可以用于测定发酵食品中酪胺检测，具有一定的可靠性。
3 结论
本研究成功制备了一种便携式功能水凝胶，并将其用于传感器构建，实现了发酵食品中生物胺的快速检测。方法利用琼脂糖凝胶中的金离子和水解β-DGP 之间的相互作用，制备了便携式功能水凝胶，发酵食品中生物胺引起相对应的功能水凝胶颜色变化使吸光值产生变化，且容易被肉眼区分，并通过智能手机结合RGB 分析进行定量测定。建立比色和RGB 双方法进行相互验证，对测定结果进行互检验证，使得方法具有简单、低成本、灵敏的特点，研究的功能水凝胶对保证食品安全具有重要意义，对消费者和生产厂家具有巨大的潜在实际应用价值，避免了检测生物胺时，用大型仪器及复杂的操作过程。
[1] SILLA SANTOS M H.Biogenic amines:Their importance in foods[J].International Journal of Food Microbiology,1996,29(2/3):213-231.
[2] 吴玉婷,谢超,周卓颖,等.不同温度贮藏过程中鮸鱼品质及生物胺的变化研究[J].食品研究与开发,2022,43(19):96-102.WU Yuting, XIE Chao, ZHOU Zhuoying, et al.Change in quality and biogenic amines of Miichthys miiuy at different storage temperature[J].Food Research and Development,2022,43(19):96-102.
[3] 才让卓玛,曾诗雨,张效平,等.发酵剂对鲟鱼糜中生物胺的影响[J].中国调味品,2022,47(11):75-79.CAI Rangzhuoma, ZENG Shiyu, ZHANG Xiaoping, et al.Effect of starter on biogenic amines in sturgeon surimi[J].China Condiment,2022,47(11):75-79.
[4] TETI D A, VISALLI M, MCNAIR H.Analysis of polyamines as markers of(patho)physiological conditions[J].Journal of Chromatography B,2002,781(1/2):107-149.
[5] 李恒,王泽亮,邓维琴,等.甜瓣子中生物胺产生菌株和降解菌株的筛选[J].中国食品学报,2022,22(10):190-198.LI Heng, WANG Zeliang, DENG Weiqin, et al.Screening of biogenic amines producing and degrading strains in broad bean pastmeju[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2022,22(10):190-198.
[6] 周凌聿,林倩妃,王鸿霖,等.水产品中生物胺的检测技术研究进展[J].肉类研究,2022,36(8):57-65.ZHOU Lingyu,LIN Qianfei,WANG Honglin,et al.Progress in analytical techniques for the detection of biological amines in aquatic products[J].Meat Research,2022,36(8):57-65.
[7] MOHAMMED G I, BASHAMMAKH A S, ALSIBAAI A A, et al.A critical overview on the chemistry,clean-up and recent advances in analysis of biogenic amines in foodstuffs[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry,2016,78:84-94.
[8] 郭晓丽, 李二虎, 宋雅东, 等.两种柱前衍生RP-HPLC 法测定酱腌菜中生物胺的比较[J].现代食品科技, 2018, 34(9): 215-221,276.GUO Xiaoli,LI Erhu,SONG Yadong,et al.Comparison on two precolumn derivatization methods for RP-HPLC determination of biogenic amines in pickled vegetable[J].Modern Food Science and Technology,2018,34(9):215-221,276.
[9] 李宏,史巧,王馨蕊,等.柱前荧光衍生-离子液体微萃取-高效液相色谱法测定发酵食品中生物胺[J].分析科学学报,2022,38(6):751-756.LI Hong,SHI Qiao,WANG Xinrui,et al.Determination of biogenic amines in fermented foods by pre-column fluorescence derivatization high performance liquid chromatography combined with ionic liquid microextraction[J].Journal of Analytical Science, 2022, 38(6):751-756.
[10] KELLY M T, BLAISE A, LARROQUE M.Rapid automated high performance liquid chromatography method for simultaneous determination of amino acids and biogenic amines in wine, fruit and honey[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(47):7385-7392.
[11] DONG H, XIAO K J.Modified QuEChERS combined with ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry to determine seven biogenic amines in Chinese traditional condiment soy sauce[J].Food Chemistry,2017,229:502-508.
[12] PARCHAMI R, KAMALABADI M, ALIZADEH N.Determination of biogenic amines in canned fish samples using head-space solid phase microextraction based on nanostructured polypyrrole fiber coupled to modified ionization region ion mobility spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2017,1481:37-43.
[13] 虞太六.超高效液相色谱-质谱联用法测定发酵肉和发酵蔬菜中5 种生物胺[J].食品安全导刊,2022(17):68-70,77.YU Tailiu.Determination of five biogenic amines in fermented meat and fermented vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].China Food Safety Magazine,2022(17):68-70,77.
[14] ROMANO A, KLEBANOWSKI H, LA GUERCHE S, et al.Determination of biogenic amines in wine by thin-layer chromatography/densitometry[J].Food Chemistry,2012,135(3):1392-1396.
[15] ROCHAT S, SWAGER T M.Fluorescence sensing of amine vapors using a cationic conjugated polymer combined with various anions[J].Angewandte Chemie (International Ed in English), 2014, 53(37):9792-9796.
[16] HU Y Y,MA X J,ZHANG Y B,et al.Detection of amines with fluorescent nanotubes: Applications in the assessment of meat spoilage[J].ACS Sensors,2016,1(1):22-25.
[17] XU X Y, LIAN X, HAO J N, et al.A double-stimuli-responsive fluorescent center for monitoring of food spoilage based on dye covalently modified EuMOFs: From sensory hydrogels to logic devices[J].Advanced Materials,2017,29(37):1702298.
[18] JIA R N, TIAN W G, BAI H T, et al.Amine-responsive cellulosebased ratiometric fluorescent materials for real-time and visual detection of shrimp and crab freshness[J].Nature Communications,2019,10:795.
[19] CHOW C F.Biogenic amines-and sulfides-responsive gold nanoparticles for real-time visual detection of raw meat, fish, crustaceans,and preserved meat[J].Food Chemistry,2020,311:125908.
[20] LIU S F, PETTY A R, SAZAMA G T, et al.Single-walled carbon nanotube/metalloporphyrin composites for the chemiresistive detection of amines and meat spoilage[J].Angewandte Chemie (International Ed in English),2015,54(22):6554-6557.
[21] VALDEZ M, GUPTA S K, LOZANO K, et al.ForceSpun polydiacetylene nanofibers as colorimetric sensor for food spoilage detection[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2019,297:126734.
[22] GONZÁLEZ-CEBALLOS L, MELERO B, TRIGO-LÓPEZ M, et al.Functional aromatic polyamides for the preparation of coated fibres as smart labels for the visual detection of biogenic amine vapours and fish spoilage[J].Sensors and Actuators B: Chemical, 2020,304:127249.
[23] LUO Q, ZHANG Y Q, ZHOU Y, et al.Portable functional hydrogels based on silver metallization for visual monitoring of fish freshness[J].Food Control,2021,123:107824.
[24] ZHANG Y Q, DONG S Y, CHEN J X, et al.Amines-mediated βglucose pentaacetate to generate photoluminescent polymer-carbon nanodots for visual monitoring the freshness of shrimp[J].Talanta,2022,249:123706.