虾青素（Astaxanthin）又称虾黄素、虾黄质，其化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素[1]，属于酮类胡萝卜素。雨生红球藻中虾青素的含量占干重的1.5%，虾青素结构中两端的六元环因含有活性强的羟基自由基使其具有独特的化学性质，具有抵御紫外线、改善视力、提升免疫力、抗氧化、抗炎等生物活性[2-4]，在食品、药品和水产品等方面具有广阔的市场前景[5]。
研究发现，羟基与虾青素中的不饱和脂肪酸酯结合形成虾青素单酯和虾青素双酯[6]，而藻细胞中的虾青素主要以虾青素双酯、虾青素单酯及游离虾青素的形式存在[7]。其中虾青素单酯和双酯含量较多，游离虾青素次之。因此，酯类虾青素需要经皂化反应或特定的酯类酶水解才能转化为游离虾青素[8]，虽然酶法所得产物杂质少，但是成本高、操作不易控制。而皂化反应虽然对皂化体系环境要求高，但是皂化反应可以破坏不饱和脂肪酸酯的酯键。此外，还有研究表明，游离虾青素在碱性环境下不易发生降解反应[9]，因此，得到高纯度的游离虾青素是当前研究最关键的一步。刘慧雯[10]利用薄层色谱法和高效液相色谱法对植物乳杆菌中的虾青素进行纯化，其纯度达89.21%；Wang 等[11]利用中性蛋白酶纯化虾壳中的虾青素，其纯度达87.34%；孙伟红等[12]利用高效液相色谱串联大气压化学电离源质谱法优化得到的虾青素纯度达95%左右。虽然这些方法均能制备得到游离虾青素，但是仍然存在局限性。
近年来，制备型高效液相色谱（preparative high performance liquid chromatography，pre-HPLC）以其分辨率高、检测方便、收集产物准确、能快速分离获得高纯度的化合物等特点，在天然产物的提取分离与生产研究中应用日益广泛[13]。本试验以雨生红球藻中的虾青素为原料，采用皂化法将虾青素提取物中的酯型虾青素转化为游离虾青素，系统研究不同皂化时间、皂化温度、碱液浓度对皂化程度的影响，进一步利用pre-HPLC 分离纯化制备得到高纯度的虾青素，以期为雨生红球藻中虾青素综合应用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三氯甲烷（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇（色谱级）：美国Sigma-Aldrich 有限公司；虾青素标准品（99.8%）：上海源叶生物科技有限公司；雨生红球藻：中科院武汉水生生物研究所。
1.2 仪器与设备
101A-1E 电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；BSA224S-CW 电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；IKA-RV10 旋转蒸发仪、C-MAG HS10 恒温水浴锅：德国IKA 仪器设备有限公司；LC-10A 高效液相色谱：日本岛津公司；NS4210 制备型高效液相色谱：江苏汉邦科技有限公司；H1850 高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Nicoletis50 傅里叶变换红外光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司；VFD2000 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Bruker AVANCE 400M 核磁共振波谱仪：德国Bruker 公司；超高压微射流：永联生物科技（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 虾青素的提取
将雨生红球藻粉与水按固液比为1∶650（g/mL）置于烧杯中，在960 MPa 超高压微射流条件下进行110 s，后将经超高压微射流处理的样品用三氯甲烷萃取，直至水相层变无色，合并有机相层。经真空旋转蒸发仪浓缩有机层，直至三氯甲烷蒸干，制备得到虾青素粗提液，-20 ℃保存备用。
1.3.2 虾青素皂化处理
参考Yuan 等[14]的方法并适当修改，将上述1.3.1提取得到的虾青素粗提液10 mL 加入5 mL NaOH-甲醇溶液，在设定温度下，避光反应一定时间。待反应结束后，加入适量的蒸馏水终止皂化反应，用蒸馏水清洗多次，直至上层水相白色悬浮物消失，随后2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集下层有机相溶液，将下层有机溶液旋转蒸发浓缩得到皂化产物，冷冻干燥24 h，-20 ℃保存备用。
1.3.3 色谱条件
虾青素含量检测液相色谱HPLC 色谱条件为色谱柱：Hedera ODS-2 柱（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流动相：甲醇（A）∶水（B）=95∶5；超声脱气30 min；检测波长：478 nm；进样量：20 μL；流速为0.8 mL/min；柱温为40 ℃；检测器为光电二极管阵列检测器；采用二元高压梯度模式。
虾青素纯化pre-HPLC 色谱条件：Hedera ODS-2柱（20 mm×250 mm，10 μm）；流动相为纯甲醇；流速10 mL/min；进样量5 mL[15]。
1.3.4 虾青素标准曲线绘制
准确称取虾青素标准品1.000 mg，甲醇溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶中，配成0.01 mg/mL 虾青素标准储备液，摇匀，避光保存。分别取适量该储备液用甲醇稀释成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL 的虾青素标准溶液。按照1.3.3 中的HPLC 色谱条件在高效液相色谱仪上进行测定，得到线性回归方程y=83 308x+4 027.5，R2=0.998 8。
1.3.5 游离虾青素浓度的计算
参考贾喆等[16]的计算方法，在1.3.3 色谱条件下测定游离虾青素的浓度。提取物中游离虾青素浓度按照下列公式计算。
式中：C 为游离虾青素浓度，μg/mL；S 为游离虾青素总峰面积，mAU·s；S 标准为虾青素标准品总峰面积，mAU·s；C 标准为虾青素标准品浓度，μg/mL。
1.3.6 单因素试验
1.3.6.1 NaOH-甲醇溶液浓度对皂化效果的影响
配制质量浓度为1%、2%、3%、4%、5% 的NaOH-甲醇溶液，将不同浓度的皂化液恒温水浴35 ℃进行10 h，待反应结束后，加入适量的蒸馏水终止皂化反应，用蒸馏水清洗多次，直至上层水相中的白色悬浮物清洗干净，随后2 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，收集下层有机相溶液，将下层有机溶剂蒸发得到皂化产物，然后用甲醇复溶，该溶液先用0.22 μm 的膜过滤后进行HPLC 检测，采用面积归一法计算游离虾青素的浓度。
1.3.6.2 皂化时间对皂化效果的影响
用2% NaOH-甲醇溶液浓度在35 ℃水浴中进行皂化反应，设置皂化时间为2、4、6、8、10、12、14、16 h，待反应结束后，加入适量的蒸馏水终止皂化反应，剩余步骤同1.3.6.1。
1.3.6.3 皂化温度对皂化效果的影响
用2% NaOH-甲醇溶液浓度在不同的皂化温度下进行反应10 h，设置皂化温度为5、15、25、35、45 ℃，待反应结束后，加入适量的蒸馏水终止皂化反应，剩余步骤同1.3.6.1。
1.3.7 响应面优化试验设计
在单因素试验结果基础上，采用响应面中心组合试验设计法，以NaOH-甲醇溶液浓度、皂化时间和皂化温度为考察因素，以游离虾青素浓度为指标，设计三因素三水平的响应面优化试验，利用Design-Expert 软件对数据进行拟合，优化得出最佳工艺条件。响应面因素水平设计见表1。
表1 响应面因素水平设计
Table 1 Response surface factors and levels design
水平-1因素NaOH-甲醇溶液浓度/%0 1 1 2 3皂化时间/h 8 10 12皂化温度/℃25 35 45
1.3.8 虾青素结构表征
在制备型液相色谱色谱条件下，对皂化得到的虾青素进行分离收集浓缩。将分离得到的游离虾青素进行HPLC 纯度测定，进一步利用低温冷冻干燥法制备得到游离虾青素。利用红外光谱、核磁共振对其结构进行表征。
1.3.8.1 红外光谱分析
采用KBr 压片法，分别将适量制备得到的虾青素样品与虾青素标品和KBr 混合研磨，随后用傅里叶变换红外光谱仪作全波段（4 000～400 cm-1）扫描。
1.3.8.2 核磁共振分析
将适量虾青素样品溶于氘代甲醇中，用核磁共振波谱仪进行400 MHz 核磁共振氢谱（1H NMR）和101 MHz 核磁共振碳谱（13C NMR）分析。
1.4 数据处理
所有试验至少重复3 次，数据以平均值±标准差表示。响应面分析软件（Design-Expert）分析各组均值之间的差异（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 NaOH-甲醇溶液浓度对皂化效果的影响
NaOH-甲醇溶液浓度对皂化效果的影响见图1。
图1 NaOH-甲醇溶液浓度对皂化效果的影响
Fig.1 Influence of NaOH-methanol solution concentration on saponification
研究表明，碱性体系是发生皂化反应的最好体系[17]。因此，NaOH-甲醇溶液能更充分、彻底地使虾青素酯转化为游离虾青素。然而，碱液浓度的大小会直接影响虾青素酯的转化速率。由图1 可知，在本试验碱液浓度范围内，游离虾青素浓度先上升后下降，当NaOH-甲醇溶液浓度为2% 时，游离虾青素浓度最大为18.087 μg/mL，此时的碱液体系最有利于虾青素酯的转化。但当NaOH-甲醇溶液浓度继续增大时，游离虾青素的浓度反而下降，可能是因为强碱环境致使游离虾青素发生降解，导致其浓度含量降低[18]。因此，选择NaOH-甲醇溶液浓度1%、2%、3% 进行后续响应面试验。
2.1.2 皂化时间对皂化效果的影响
皂化时间对皂化效果的影响见图2。
图2 皂化时间对皂化效果的影响
Fig.2 Influence of saponification time on saponification
由图2 可知，皂化时间大于10 h 时，随着皂化时间的延长，游离虾青素浓度趋于稳定状态。主要原因是虾青素酯有足够的时间发生皂化反应，但是，当皂化时间过长时，游离虾青素会发生降解，导致粗提液中游离虾青素浓度降低。皂化时间为10～14 h 时，游离虾青素浓度基本保持不变，此时可能达到了皂化-降解动态平衡，表明该时间段内虾青素酯参与皂化反应最充分[19-20]。因此，选择皂化时间8、10、12 h 进行后续响应面试验。
2.1.3 皂化温度对皂化效果的影响
皂化温度对皂化效果的影响见图3。
图3 皂化温度对皂化效果的影响
Fig.3 Influence of saponification temperature on saponification
从能量角度考虑，皂化反应是一个吸热反应，虽然低温能更好地保证虾青素不被降解，但是不利于虾青素酯的皂化，因为温度太低会致使分子的运动速率减慢，降低碰撞概率[21]，从而使得皂化速率减小。因此，合适的皂化温度不仅为皂化反应提供足够的能量，还提高了脂质转化动力，使游离虾青素不被发生降解[22]。此外，虾青素是一种热敏性物质，在较高温度下容易发生氧化分解。由图3 可知，35 ℃时游离虾青素浓度最大，而且该温度也不会使虾青素发生严重降解[23]。因此，选择皂化温度25、35、45 ℃进行后续响应面试验。
2.2 响应面试验结果分析
2.2.1 响应面试验设计及结果分析
响应面设计及结果见表2。
表2 响应面设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test
序号NaOH-甲醇溶液浓度/%皂化时间/h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 8 10 11 12 13 14 15 16 17 1 3 2 1 2 2 2 1 2 3 2 2 3 2 3 2 1 10 10 12 8 10 10 10 12 10 12 8 10 10 12皂化温度/℃35 35 35 45 35 25 45 25 35 45 45 35 35 25 25 35 35游离虾青素浓度/（μg/mL）16.51 14.47 18.68 14.32 20.31 17.67 16.21 18.03 20.91 14.38 15.37 21.09 16.62 17.85 15.97 20.26 15.56
2.2.2 回归模型的建立与检验
对表2 进行多元线性回归拟合后，得到回归方程并对此方程进行方差分析，方差分析结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型A NaOH-甲醇浓度B 皂化时间C 皂化温度AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差平方和79.72 1.11自由度均方8.86 1.11 F 值13.52 1.69 P 值0.001 2 0.234 3 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4显著性**4.050×10-3 10.67 2.40 1.12 0.11 32.54 11.88 13.57 4.59 0.98 3.61 4.050×10-3 10.67 2.40 1.12 0.11 32.54 11.88 13.57 0.66 0.33 0.90 6.180×10-3 16.29 3.67 1.71 0.17 49.66 18.13 20.70 0.939 5 0.005 0 0.097 1 0.231 7 0.695 7 0.000 2 0.003 8 0.002 6*********0.36 0.785 6不显著
由表3 可知，该模型F=13.52，P＜0.01 说明该模型达到极显著水平，模拟失拟项P＞0.05，不显著，表明建模成功。试验结果可用该模型描述，模型的调整决定系数R2=0.945 6，校正决定系数R2Adj 为0.875 6，表明该模型拟合度高；变异系数为4.68%＜5%，表明模型具有较高的信度和较好的重现性。对表3 回归模型系数的显著性分析可见，AB 为影响显著（P＜0.05），C、A2、B2、C2、均为影响极显著（P＜0.01）。由F 值可知，各因素对游离虾青素浓度的影响大小顺序为C（皂化温度）＞A（NaOH-甲醇溶液浓度）＞B（皂化时间）。
2.2.3 响应面分析及最佳工艺条件确定
各试验因素交互作用的响应面见图4。
图4 各因素交互作用的响应面
Fig.4 Response surface diagram of the interaction of experimental factors
响应面图越陡峭，表明两因素之间的影响越显著[24]。由图4 可知，皂化时间和碱液浓度之间的显著性最强。经过响应面分析及回归模型预测，得到最佳工艺条件为NaOH-甲醇溶液浓度2.53%、皂化时间11.67 h、皂化温度32.18 ℃。在此最优工艺参数下，得到虾青素的预测含量为（18.605±1.273）μg/mL。为验证模型的可靠性，从实际情况出发，对最佳条件进行调整为NaOH-甲醇溶液浓度2.5%、皂化时间12 h、皂化温度32 ℃。在此条件下进行3 次平行试验，最后取其平均值，得到虾青素的含量为（19.423±0.186）μg/mL，表明结果可行，该模型可靠。
2.3 分析型高效液相色谱分析
液相色谱图见图5。
图5 液相色谱图
Fig.5 HPLC chromatograms
由图5 可知，游离虾青素的保留时间约为12.59 min。预处理前虾青素的保留时间约为12.13 min，同时含有其他杂质峰。查阅文献[25-27]得知，20～35 min 之间的峰是虾青素单酯和虾青素双酯的吸收峰。对处理前的供试品溶液中各物质的峰面积进行计算，可以计算出游离虾青素占虾青素粗提取液的30.87%，虾青素单酯和虾青素双酯为61.08%，其他成分为8.05%。处理后的供试品中游离虾青素的占比增大，说明碱液处理可以很大程度地使供试品中的虾青素酯转化为游离虾青素。由图5 可知，35 min 处的虾青素酯的吸收峰消失，游离虾青素的峰面积增大。根据峰面积计算可知游离虾青素的含量为82.98%，其游离虾青素含量比未处理的样品提高了62.79%。
2.4 制备型高效液相色谱图分析
虾青素标准品和皂化后虾青素样品的pre-HPLC图见图6。
图6 虾青素标准品和皂化后虾青素样品的pre-HPLC 图
Fig.6 Preparative HPLC diagram of standard substance and astaxanthin sample after saponification
由图6 可知，制备型液相色谱可以快速分离获得高纯度的化合物，将上述预处理后的供试品进一步分离纯化。虾青素标准品a 的保留时间约为10.51 min，收集供试品在10.35～11.05 min 的样品，收集的样品经真空旋转蒸发仪浓缩并用HPLC 测定其纯度，通过面积归一法计算制备得到的虾青素纯度达94%以上。
2.5 虾青素的结构表征
2.5.1 傅里叶变换红外光谱分析
虾青素标准品与虾青素样品的傅里叶变换红外光谱图见图7。
图7 虾青素标准品与虾青素样品的傅里叶变换红外光谱图
Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy diagram of standard substance and astaxanthin sample
如图7 所示，虾青素样品的特征峰与虾青素标准品的特征峰基本一致。主要有3 460 cm-1 处较宽吸收峰，该峰可能是虾青素六元环上—OH 的伸缩振动吸收峰；2 970 cm-1 处的弱吸收峰是六元环上C—H 的伸缩振动吸收峰[28]；2 970 cm-1 和2 840 cm-1 左右的强吸收峰可能是虾青素中的-CH2 吸收峰；1 670 cm-1 左右处的强吸收峰是虾青素中的C O 伸缩振动的吸收峰；1 320 cm-1 处中等强度的吸收峰是—CH3 弯曲振动吸收峰；1 080 cm-1处的弱吸收峰是虾青素六元环上C—O拉伸振动的吸收峰[29]。通过红外光谱分析，表明制备得到的虾青素纯度较高，且在制备过程中虾青素结构未发生破坏。
2.5.2 核磁共振氢谱分析
虾青素样品的1H NMR 图见图8。
图8 虾青素样品的1H NMR 图
Fig.81H NMR spectroscopy of astaxanthin sample
1～21 为虾青素结构式中不同位置的碳。
如图8 所示，经制备型液相色谱纯化后的虾青素进行氢谱分析，采用MestReNova 软件进行数据处理，经基线校正和相位处理。谱线清晰可辨，裂分也较为清楚，表明制备得到的纯度较高。对其进行标峰、积分以及裂分分析，结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 6.71～6.62（m，2H）、6.49～6.38（m，2H）、6.34～6.28（m，2H）、6.22（d，J=16.1 Hz，1H）、4.33（ddd，J=13.8，5.7，1.8 Hz，1H）、3.71（d，J = 1.8 Hz，1H）、2.16（dd，J =12.6，5.7 Hz，1H）、2.00（s，3H）、1.99（s，3H）、1.95（s，3H）、1.82（t，J=13.2 Hz，1H）、1.32（s，3H）、1.21（s，3H）。
2.5.3 核磁共振碳谱分析
虾青素样品的碳谱13C NMR 图见图9。
图9 虾青素样品的13C NMR 图
Fig.913C NMR spectroscopy of astaxanthin sample
1～21 为虾青素结构式中不同位置的碳。
如图9 所示，用同样的处理方法对虾青素样品进行碳谱分析，结果如下13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 200.43、162.29、142.40、139.72、136.73、135.21、134.58、133.84、130.68、126.75、124.62、123.28、69.19、45.35、36.79、30.73、26.14、14.04、12.83、12.59 处虾青素分子中的峰都能在上述图谱中呈现，该图谱分析与参考文献[27]中的报道一致，表明该法可以用于制备高纯度的虾青素。
3 结论
本试验在单因素试验的基础上，采用响应面法优化虾青素的皂化条件，最终确定最佳的皂化工艺条件为皂化时间为12 h、皂化温度32 ℃、NaOH-甲醇溶液浓度2.5%，得到游离虾青素的浓度为（19.423±0.186）μg/mL。进一步利用制备型液相色谱分离纯化预处理后的虾青素液。在最佳制备色谱分离条件下，虾青素的保留时间为10.51 min，随后通过面积归一化法计算得出制备得到的虾青素纯度达94%以上，进一步通过红外光谱法及碳谱、氢谱对制备得到的虾青素样品进行定性和定量分析，结果表明该制备方法可靠稳定，为虾青素资源的开发利用及其相关制品的质量监控提供了基础。
[1] YU X L, YE X, HU C Y, et al.Sodium acetate can promote the growth and astaxanthin accumulation in the unicellular green alga Haematococcus pluvialis as revealed by a proteomics approach[J].Journal of Oceanology and Limnology,2022,40(5):2052-2067.
[2] 张莉莉,温淑媚,高静.超声辅助双连续型离子液体微乳液提取南极磷虾壳中的虾青素[J].中国食品学报, 2021, 21(9): 130-141.ZHANG Lili,WEN Shumei,GAO Jing.Extraction of astaxanthin in Antarctic krill shell by ultrasonic-assisted bicontinuous ionic-liquidbased microemulsion[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2021,21(9):130-141.
[3] 潘雪珊.外源添加物调控红发夫酵母合成虾青素的机制研究[D].厦门:厦门大学,2020.PAN Xueshan.Study on the regulation mechanism of exogenous additives on astaxanthin synthesis by xanthophyllomyces dendrorhous[D].Xiamen:Xiamen University,2020.
[4] DESAI R K,STREEFLAND M,WIJFFELS R H,et al.Novel astaxanthin extraction from Haematococcus pluvialis using cell permeabilising ionic liquids[J].Green Chemistry,2016,18(5):1261-1267.
[5] 钱飞.克氏原螯虾头制备风味料和提取虾青素的研究[D].无锡:江南大学,2009.QIAN Fei.Study on flavoring preparation and astaxanthin extraction of crayfish head[D].Wuxi:Jiangnan University,2009.
[6] HOLTIN K, KUEHNLE M, REHBEIN J, et al.Determination of astaxanthin and astaxanthin esters in the microalgae Haematococcus pluvialis by LC-(APCI)MS and characterization of predominant carotenoid isomers by NMR spectroscopy[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,395(6):1613-1622.
[7] LORENZ R T, CYSEWSKI G R.Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J].Trends in Biotechnology,2000,18(4):160-167.
[8] 杜春影,乔乐克,李先玉,等.生物酶法制备游离虾青素的工艺研究[J].食品工业,2018,39(4):184-188.DU Chunying,QIAO Leke,LI Xianyu,et al.Study on the optimization of enzymatic preparation for the free astaxanthin[J].The Food Industry,2018,39(4):184-188.
[9] 刘春芬,慕金超.三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素工艺条件的优化[J].江苏农业科学,2020,48(20):214-218.LIU Chunfen, MU Jinchao.Optimization of fermentation conditions for lycopene production by Blakeslea trispora[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2020,48(20):214-218.
[10] 刘慧雯.植物乳杆菌CHU-R 虾青素提纯工艺优化[D].广州:华南农业大学,2018.LIU Huiwen.Optimization of purification process of astaxanthin from Lactobacillus plantarum CHU-R[D].Guangzhou: South China Agricultural University,2018.
[11] WANG L T, HU J X, LV W J, et al.Optimized extraction of astaxanthin from shrimp shells treated by biological enzyme and its separation and purification using macroporous resin[J].Food Chemistry,2021,363:130369.
[12] 孙伟红,肖荣辉,冷凯良,等.雨生红球藻中虾青素的C30-反相高效液相色谱法测定[J].分析测试学报,2010,29(8):841-845.SUN Weihong, XIAO Ronghui, LENG Kailiang, et al.Determination of astaxanthin in Haematococcus plwuialis by C30 reversedphase high performance liquid chromatographic method[J].Journal of Instrumental Analysis,2010,29(8):841-845.
[13] ZHANG J, FENG C R, GE P, et al.High purity separation of hypericin from Hypericum perforatum L.extract with macroporous resin column coupling preparative liquid chromatography[J].Process Biochemistry,2021,103:107-113.
[14] YUAN J P, CHEN F.Purification of trans-astaxanthin from a highyielding astaxanthin ester-producing strain of the microalga Haematococcus pluvialis[J].Food Chemistry,2000,68(4):443-448.
[15] 丛心缘.南极磷虾中虾青素的分离、鉴定及抗氧化活性研究[D].青岛:青岛大学,2020.Cong Xinyuan.Isolation, identification and antioxidant activity of astaxanthin in Antarctic krill[D].Qingdao:Qingdao University,2020.
[16] 贾喆,张肖瑕,刘欣妍,等.皂化处理对中华管鞭虾虾青素提取物的虾青素组成和体外抗氧化性的影响[J].食品工业科技,2021,42(13):80-87.JIA Zhe, ZHANG Xiaoxia, LIU Xinyan, et al.Effects of saponification on astaxanthin composition and in vitro antioxidant activity of astaxanthin extract from Penaeus sinensis(Solenocera crassicornis)[J].Science and Technology of Food Industry,2021,42(13):80-87.
[17] 李莉.夏侧金盏花中虾青素酯类化合物皂化及其它化合物的分离鉴定研究[D].青岛:青岛大学,2019.LI Li.Study on saponification of astaxanthin esters and separation and identification of other compounds in marigold in summer[D].Qingdao:Qingdao University,2019.
[18] 宋素梅.南极磷虾壳中虾青素的提取与分离纯化[D].无锡:江南大学,2013.SONG Sumei.Extraction and puirifcation of astaxanthin from Antarctic krill shells[D].Wuxi:Jiangnan University,2013.
[19] 姜启兴,宋素梅,夏文水,等.南极磷虾壳中虾青素酯的皂化工艺研究[J].食品工业科技,2014,35(8):233-236.JIANG Qixing, SONG Sumei, XIA Wenshui, et al.Study on the saponification technique of astaxanthin esters from Antarctic krill shells[J].Science and Technology of Food Industry, 2014, 35(8):233-236.
[20] SU F,XU H R,YANG N,et al.Hydrolytic efficiency and isomerization during de-esterification of natural astaxanthin esters by saponification and enzymolysis[J].Electronic Journal of Biotechnology,2018,34:37-42.
[21] 顾洪玲.雨生红球藻的高效培养及其虾青素的提取与纯化[D].青岛:中国海洋大学,2014.GU Hongling.High-efficient culture of Haematococcus pluvialis and extraction and purification of astaxanthin[D].Qingdao: Ocean University of China,2014.
[22] DERRIEN M,BADR A,GOSSELIN A,et al.Optimization of a sustainable purification protocol for lutein and chlorophyll from spinach by-products by a saponification procedure using Box Behnken design and desirability function[J].Food and Bioproducts Processing,2019,116:54-62.
[23] 孙伟红.不同来源虾青素的分离制备及其构效关系研究[D].青岛:中国海洋大学,2015.SUN Weihong.Isolation and preparation of astaxanthin from different sources and the structure-activity relationship[D].Qingdao:Ocean University of China,2015.
[24] 康嘉伟,孙鹏程,张宇哲,等.响应面分析法优化棉籽加工废液的脱色工艺[J].食品研究与开发,2023,44(2):132-137.KANG Jiawei,SUN Pengcheng,ZHANG Yuzhe,et al.Optimization of decolorization process of cottonseed processing wastewater by response surface methodology[J].Food Research and Development,2023,44(2):132-137.
[25] TANG Q F, YANG C H, YE W C, et al.Preparative isolation and purification of bioactive constituents from Aconitum coreanum by high-speed counter-current chromatography coupled with evaporative light scattering detection[J].Journal of Chromatography A,2007,1144(2):203-207.
[26] MIAO F P, LU D Y, LI Y G, et al.Characterization of astaxanthin esters in Haematococcus pluvialis by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J].Analytical Biochemistry,2006,352(2):176-181.
[27] 雷凤爱.雨生红球藻中虾青素的分离纯化及异构体的分析研究[D].呼和浩特:内蒙古工业大学,2009.LEI Feng′ai.A Study on the Separation and purification of astaxantion from Haematococcus Pluvialis and the analysis of its isomers[D].Hohhot:Inner Mongolia University of Tehchnology,2009.
[28] ROHMAN A, Sismindari, ERWANTO Y, et al.Analysis of pork adulteration in beef meatball using Fourier transform infrared(FTIR)spectroscopy[J].Meat Science,2011,88(1):91-95.
[29] ROHMAN A, CHE MAN Y B.Fourier transform infrared (FTIR)spectroscopy for analysis of extra virgin olive oil adulterated with palm oil[J].Food Research International,2009,43(3):886-892.