植物发酵酒是用水果、蔬菜等或其汁液为原料，通过酵母菌发酵、具有一定酒精度的特殊酒。植物发酵酒具有发酵植物所特有的风味，酒精度较低，一般为7～18%vol[1]。近年来，随着年轻人饮酒习惯的改变，人们对于低度数、口感绵的植物发酵酒越来越喜爱，因此植物发酵酒在各国的酒类市场中均占据重要地位。
桑葚是桑科桑属植物成熟果穗的统称，又可称为桑果、桑椹、桑枣等，在世界多地均有广泛分布[2]。桑葚是首批通过卫生部批准的药食同源农产品之一，它含有丰富的营养物质，包括多种维生素、氨基酸、矿物质、类黄酮和花青素等，还含有多种微量元素[3]。研究表明，桑葚具有抗氧化[4-5]、保肝[6]、抗肿瘤[7]、降血糖[8]等功效。桑葚含有的果汁较多，果香十足，容易破碎，色素含量高，是一款酿酒的优质原料。
玫瑰属蔷薇科蔷薇目，原产于中国、日本、朝鲜等地，现在在中国各省市均有分布，具有较高的药用价值和观赏价值[9]。玫瑰气味芳香，性温、味甘，富含多种蛋白质、矿质元素、氨基酸、多糖、多酚、黄酮、花青素和花色苷等[10]。玫瑰生理活性高，具有排毒、养颜、清除自由基、抗氧化[11-12]、调节免疫[13]、降低血糖[14]、治疗痛经、抗炎[15]、美白[16]等功效。
市场中的桑葚主要以鲜果进行出售，部分做成桑葚干、桑葚果汁，桑葚因含水量高，组织柔软易破，导致其极易腐烂变质[17]，而将桑葚和玫瑰花结合酿造果酒可有效解决桑葚易变质、腐烂的问题。同时，二者复配发酵，利于二者风味物质、营养物质的融合，提高果酒的感官品质和营养价值。本研究以玫瑰花和桑葚为主要原料，通过单因素试验和响应面分析法优化玫瑰桑葚复合果酒的酿造工艺，得到具有玫瑰花和桑葚独特风味的新型果酒，旨为推动桑葚与玫瑰的产业发展、增加农民的收入、丰富果酒的市场种类、开发植物发酵酒提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚、玫瑰花、蜂蜜、白砂糖：市售；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：上海展云化工有限公司；柠檬酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MC 型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；UV-721型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；XPX-9052MBE 电热恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；JD-5 型酒精计：重庆康华仪器仪表设备有限公司；GMK-703 糖度仪：北京友仪四方科技发展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
原料选择：选择无虫害的玫瑰花瓣；选择成熟度适中、无虫害的桑葚果实，剔除霉烂果、病虫果、未熟果和杂质，防止霉果、烂果混入而影响果酒口感。
原料预处理：桑葚去掉梗部，放入榨汁机里进行榨汁，在榨汁过程中，快速加入浓度为12～20 g/100 L 的偏重亚硫酸钾，防止果汁氧化，加入0.04%的果胶酶，搅拌均匀，静置60 min。然后对混合汁进行杀菌处理并过滤。将洗净的玫瑰花瓣加入蜂蜜中，浸泡1 d 后进行分离待用。
混合：将浸泡后的玫瑰花瓣与桑葚汁按不同料液比混合后加入偏重亚硫酸钾，调节SO2 的浓度；加入白砂糖调整初始含糖量为22%，保证发酵后的酒达到一定的酒精度；再加入柠檬酸调节pH 值，放置9～11 h。
添加活性干酵母：首先进行活性干酵母的活化，将1 g 的活性干酵母与10 mL 2%的葡萄糖溶液混合，搅拌均匀，并在恒温水浴锅为35 ℃的条件下，搅拌40 min。添加0.05%活化后的酵母到发酵液中。
主发酵：将含菌种的发酵液密封在发酵罐中，装液量不超过容器体积的2/3，控制初始pH 值、发酵温度和发酵时间。
过滤、陈酿：将发酵后的果酒用纱布进行过滤，分离果渣和果酒。将发酵好的玫瑰桑葚发酵液在室温下进行陈酿3 个月。
灭菌、冷却、下胶：将得到的原酒在60 ℃的恒温水浴锅中加热30 min 进行灭菌，待冷却到室温后向果酒中加蛋清进行下胶处理，获得酒体澄清的玫瑰桑葚复合果酒。
1.3.3 单因素试验
以料液比[1∶10、1∶5、3∶10、2∶5、1∶2（g/mL）]、发酵时间（3、5、7、9、11 d）、发酵温度（20、22、24、26、28 ℃）、初始pH 值（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）为考察因素，以酒精度和感官评分为评价指标，进行单因素试验，确定最优的单因素发酵条件。
1.3.4 响应面试验
在单因素试验结果的基础上，以料液比（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）以及初始pH 值（D）4 个因素为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行响应面优化试验设计，以确定玫瑰桑葚酒的最佳酿造工艺条件。具体的试验设计因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
因素水平B 发酵时间/d-1 0 1 A 料液比/（g/mL）1∶5 3∶10 2∶5 5 7 9 C 发酵温度/℃22 24 26 D 初始pH 值3.6 3.8 4.0
1.3.5 分析检测
酒精度参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法进行测定。
沙门氏菌参照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行测定；金黄色葡萄球菌参照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》和进行测定。
感官评价：邀请20 名经过培训的食品专业人员对玫瑰桑葚酒进行感官评价。依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，从外观、香气、滋味和典型性进行评分，评分标准如表2 所示。
表2 玫瑰桑葚酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of rose-mulberry wine
项目外观（25）香气（25）评分20～25 15～＜20 10～＜15 0～＜10 23～25 19～＜23 15～＜19 11～＜15滋味（35）典型性（15）评价标准酒体呈紫红色，光泽均匀酒体呈紫黑色，澄清透明，无杂物酒体呈暗紫色，液体较浑浊，无光泽酒体呈红褐色，液体浑浊，有明显的杂质酒香醇厚，风味独特，具有典型的桑葚香和淡淡的玫瑰花香酒香良好，风味较独特，有较好的桑葚香，玫瑰花香不明显酒香较少，风味不明显，桑葚果香不足，无玫瑰花香酒香不足，桑葚果香味不足，无玫瑰花香，无异香无酒香，无桑葚果香，无玫瑰花香或有异香酒体丰满，口感柔和，酸甜适当，回味无穷酒质柔和爽口，酸甜适宜口感略涩，酒体协调，有一定风味口感酸涩，风味不足口感酸涩，带有苦味，不协调风格明确，典型性完美风格良好，典型性较强具有一定的风格，典型性一般典型性弱0～＜11 31～35 26～＜31 21～＜26 16～＜21 0～＜16 13～15 10～＜13 7～＜10 0～＜7
1.4 数据处理
采用GraphPad Prism 8.0.2 进行数据处理以及绘图，采用Design-Expert 10.0.3 进行响应面设计及试验分析。
2 结果与分析
2.1 玫瑰桑葚酒发酵的单因素试验
2.1.1 料液比对玫瑰桑葚酒酒精度和感官评分的影响
复合果酒对于原料复配的比例有很高的要求，比例不恰当将对果酒的色泽、香味、滋味产生较大的影响。料液比对酒精度和感官评分的影响见图1。
图1 料液比对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
Fig.1 Effects of rose to mulberry juice ratio on the sensory score and alcohol content of rose-mulberry wine
由图1 可知，酒精度受料液比变化影响较小，而感官评分随桑葚汁体积的减小呈现先升高后下降的趋势。可能是酒精度与发酵液的含糖量和含糖种类关系密切，桑葚汁体积的变化导致含糖量变化较小，酒精度变化不大。而当桑葚汁体积较大时，酒体中桑葚汁的味道较突出，玫瑰花风味不足，酒的颜色较深，影响整体感官。随着桑葚汁体积的减小，酒的风味逐渐平衡，色泽清亮，呈现出桑葚和玫瑰花的独特风味，在料液比为3∶10（g/mL）时，感官评分为87；桑椹汁体积减小，玫瑰花含量增大，发酵酒出现涩味，感官评分下降。因此选择料液比为1∶5、3∶10、2∶5 g/mL 进行后续试验。
2.1.2 发酵时间对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
发酵时间对玫瑰花葚酒感官评分和酒精度的影响见图2。
图2 发酵时间对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
Fig.2 Effects of fermentation time on the sensory score and alcohol content of rose-mulberry wine
从图2 中可以看出，酒精度和感官评分都随着发酵时间的延长而逐渐上升，在第7 天达到最大值后开始下降。当发酵时间较短时，发酵不完全，酒精度偏低，残糖量较高，口感较甜；随着发酵时间的延长，酒体中的残糖量逐渐降低，这些环境变化不利于酵母菌的生长繁殖，酵母菌代谢不良，甚至可能出现自溶的现象，导致果酒的风味不佳，感官评分有所下降[18]。综合考虑，7 d 为玫瑰桑葚酒最适的发酵时间。
2.1.3 发酵温度对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
发酵温度对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响见图3。
图3 发酵温度对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
Fig.3 Effects of fermentation temperature on the sensory score and alcohol content of rose-mulberry wine
由图3 可以看出，发酵温度为20～24 ℃时，随着发酵温度的升高酒精度逐渐升高。发酵温度的升高提高了微生物的发酵速度，酒精度迅速提高，在24 ℃时达到最大值，此时发酵充分，发酵酒风味浓郁，回味绵长，颜色呈现紫红色，感官评分为85；随着发酵温度的继续上升，大量的糖分供微生物生长繁殖，反而影响了发酵产醇量[19]，而过高的发酵温度也会影响酵母菌的活力，导致发酵不彻底，酒精度下降，酒甜度较高，酒中的风味物质较少，感官评分下降。所以，选择发酵温度为22、24、26 ℃进行后续试验。
2.1.4 初始pH 值对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
初始pH 值对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响见图4。
图4 初始pH 值对玫瑰桑葚酒感官评分和酒精度的影响
Fig.4 Effects of initial pH on the sensory score and alcohol content of rose-mulberry wine
由图4 可以看出，在玫瑰桑葚酒发酵过程中，酒精度和感官评分均随着初始pH 值的升高呈现先升高再降低的趋势。当初始pH 值为3.8 时，酒精度最高，达到了10.6% vol，感官评分为84，此时发酵较为充分。初始pH 值过高或过低都会影响果酒的品质[20-21]，不合适的pH 值会影响酵母菌的生长繁殖，使发酵不充分，从而使酒精度较低，而且会使果酒的酸度或甜度过大，缺少玫瑰花和桑葚的特殊风味，品质较差，感官评分较低。所以，选择初始pH 值为3.6、3.8、4.0 进行后续试验。
2.2 玫瑰桑葚酒发酵工艺的响应面优化
2.2.1 回归模型的建立及方差分析
基于单因素试验结果，采用Design-Expert 10.0.3进行多元回归分析。以料液比（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）、初始pH 值（D）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行响应面试验设计，结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface test design and results
试验号A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1-1-1-1 B1-D0 0 1 0 1 0-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 0 0 1 0 0 0-1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0-1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0-1 0 1 0 0-1-1 1 0 1 1 0-C0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1-1-1-1 0 0 1 0 0-1 0 0 1 0-1 1 0 0 0-1 0-1 0 0 0 1-1 0 0-1 0-1 0 1 0 1-1 0 0 1 1 0 0-1 0感官评分84 78 82 83 79 87 82 80 84 86 87 81 84 81 80 81 84 85 81 79 87 80 83 83 80 81 81 79 86
对表3 的数据拟合得到二次多元回归方程如下。
Y=86.60-0.75A+1.92B+0.58C-0.083D-1.25AB-0.25AC-0.75AD-0.50BD+CD-3.63A2-2.63B2-1.63C2-2.38D2
对该二次回归方程进行方差分析，结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for the regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型自由度14 A B C D AB显著性**********AC AD BC BD CD平方和194.52 6.75 44.08 4.08 0.083 6.25 0.25 2.25均方13.89 6.75 44.08 4.08 0.083 6.25 0.25 2.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14**0 1 4 0 1 4*A2 B2 C2 D2 F 值95.66 46.48 303.52 28.11 0.57 43.03 1.72 15.49 0 6.89 27.54 589.58 309.70 119.15 253.69 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1 0.461 3＜0.000 1 0.210 6 0.001 5 1.000 0 0.020 0 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1**********误差失拟项净误差总离差10 4 28 85.63 44.98 17.30 36.85 2.03 0.83 1.20 196.55 85.63 44.98 17.30 36.85 0.15 0.083 0.3 0.28 0.954 3
由表4 可知，玫瑰桑葚酒感官评分变化的回归模型变量关系极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明此模型的拟合程度良好。试验模型的决定系数R2=0.989 7，校正决定系数R2 Adj=0.979 3，表明该回归方程相关性较好。由P 值可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2、D2 ，交互项AB、AD、CD 对结果影响极显著（P＜0.01），交互项BD 对结果影响显著（P＜0.05）。由F 值可知，影响玫瑰桑葚酒品质因素的先后排序为发酵时间（B）＞料液比（A）＞发酵温度（C）＞初始pH值（D）。
2.2.2 响应面交互作用分析
各因素交互作用对玫瑰桑葚酒感官评分影响的响应面见图5。
图5 各因素交互作用对玫瑰桑葚酒感官评分影响的响应面
Fig.5 Influences of factor interactions on the sensory score of rosemulberry wine
由图5 可知，料液比与发酵时间、料液比与初始pH 值、发酵温度与初始pH 值、发酵时间与初始pH 值交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，说明这几组因素的交互作用对玫瑰桑葚酒的感官评分影响较大，该结论与方差分析结果一致。
2.2.3 验证试验
通过统计软件Design-Expert 10.0.3 对模型进行优化，得到玫瑰桑葚酒发酵的最佳工艺条件：料液比为7∶25（g/mL）、发酵时间为8.2 d、发酵温度为24.4 ℃、初始pH 值为3.8。基于以上发酵条件得到的玫瑰桑葚酒的感官评分最高，达到87。为了便于试验操作，将最佳发酵条件调整为料液比为3∶10（g/mL），发酵时间为8 d，发酵温度为24 ℃，初始pH 值为3.8。为验证响应面模型优化的试验结果，在上述条件下重复3 次试验，进行玫瑰桑葚酒的发酵，得到玫瑰桑葚酒的感官评分为90，与理论数值基本一致，与理论数值相对误差为3.3%。因此，此模型准确可靠，可用于玫瑰桑葚酒的酿造。
2.3 理化指标及微生物指标测定
以最佳试验条件酿造玫瑰桑葚酒，并测定其酒精度和微生物指标。结果显示，玫瑰桑葚酒的酒精度为10.9% vol；未检测出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，微生物指标符合GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》要求。
3 结论
通过响应面法确定了玫瑰桑葚酒酿造的最佳工艺条件为料液比3∶10（g/mL）、发酵时间8 d、发酵温度24 ℃、发酵初始pH3.8。在此条件下酿造出的玫瑰桑葚酒颜色呈紫红色，酒体澄清透明，有光泽，酒香浓厚，口感柔和，感官评分为90，酒精度为10.9%vol，未检测出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，指标满足果酒相关标准。
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