芦笋，百合科天门冬属，世界十大名菜之一，富含多种氨基酸、糖类、黄酮等功能成分[1-2]。芦笋目前大多停留在初加工阶段，即直接食用芦笋嫩茎，但芦笋可食用部分仅占其总长的二分之一，其余部分则为废弃的芦笋下脚料[3-4]。近年来，我国芦笋种植面积不断扩大，种植面积和产量均达到世界第一[5]。随之产生的大量芦笋下脚料目前还未有合理的处理方式，仅依靠田间堆肥或者焚烧的方式处理[6-7]，这些处理方式存在时间长、费用高、污染环境等问题，而芦笋下脚料的有效处理对该行业的可持续发展至关重要，因此芦笋下脚料的综合利用成为研究热点[8-9]。
芦笋下脚料中含有大量的活性物质，其中包括芦笋多糖[10-11]。目前国内外对于芦笋多糖的综合利用研究较多[12]。芦笋多糖具有抗肿瘤、提高免疫力等生理作用。Cheng 等[13]证实芦笋多糖在有氧条件下能够有效抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭。而对于芦笋多糖的提取，目前主要有水提法、酶提法等。Viera-Alcaide等[14]采用热水提取芦笋根中的果聚糖，测得果聚糖含量高达12.5%（以芦笋根鲜重计）。Siccama 等[15]利用酶催化的方法将富含纤维素的白芦笋废料转化为纤维素二糖和纤维素寡糖。窦勇博[16]采用蒸汽爆破预处理方法，超声辅助提取多糖，有效提高了白芦笋下脚料中的多糖得率，达到8.86%。李惠等[17]采用超声波辅助法，添加2.7%果胶酶提取芦笋多糖，得率可达4.12%。蒋波等[18]添加3.0% 纤维素酶及pH6.5 的柠檬酸缓冲溶液，在45 ℃下浸提芦笋多糖，提取率达到6.66%。芦笋中富含的多糖活性成分，是值得深入研究的方向。因此，本试验选择新鲜芦笋修整后产生的老根茎部分下脚料作为研究对象，采用水浴浸提-超声波辅助法提取芦笋下脚料多糖，研究液料比、超声时间、超声功率、浸提温度、浸提时间、醇沉浓度对芦笋下脚料中多糖提取率的影响，确定芦笋下脚料多糖的最佳提取工艺，以期为芦笋高值化利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
芦笋下脚料：采自四川巴中恩阳芦笋基地，新鲜芦笋修整后产生的老根茎部分；无水乙醇、葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸：成都市华力科析仪器有限责任公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
高速粉碎机（FW100）：天津市泰斯特仪器有限公司；超纯水机（UPTC 20L/H）、电子天平（YP50001B）、台式低速离心机（LC-LX-L50C）、循环水式多用真空泵（SHZ（Ⅲ））、低温冷却液循环泵（LC-LTC-5/30）、旋片式真空泵（2ZX-Z 型）、真空冷冻干燥机（LC-10N-50C）、电热鼓风干燥箱（101-0S）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；电子分析天平（ES220）：天津市德安特传感技术有限公司；水浴锅（LKTC-L）：常州鸿泽实验科技有限公司；电热恒温培养箱（303-3B）：上海尚普仪器设备有限公司；冰箱（BCD-456WPUCX）：长虹美菱股份有限公司；数控超声波清洗器（KM-600DE）：昆山美美超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计（754PC）：上海菁华科技仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 芦笋下脚料中多糖提取工艺流程
芦笋下脚料→预处理干粉→超声辅助提取→水浴浸提→抽滤→二次浸提→二次抽滤→合并抽滤液→醇沉→离心→冷冻干燥→芦笋多糖。
预处理干粉：以芦笋下脚料为原料，经除杂、洗净后置于干燥箱中，60 ℃干燥48 h（烘24 h 后查看干燥程度，随后每隔6 h 翻动查看1 次，防止烘糊）。用剪刀将芦笋干剪切为小块，利用高速粉碎机将芦笋干粉碎为细小颗粒，过60 目筛，去掉大颗粒的芦笋干杂质，即为芦笋干粉。将芦笋干粉置于干燥密封袋中密封保存，4 ℃冷藏待用。
提取工艺：采用水浴浸提-超声波辅助法提取芦笋下脚料多糖。准确称取5 g 芦笋干粉，按照一定液料比加入蒸馏水[19]，在一定的超声功率下超声预处理一段时间后，取出置于水浴锅内浸提，趁热抽滤，沉淀进行二次浸提和抽滤；将两次抽滤后的上清液合并，旋转蒸发浓缩至40 mL 左右，浓缩液中加入大约3 倍体积的乙醇，置于4 ℃冰箱过夜，离心（4 000 r/min，20 min）除去水溶性杂质[20-21]。取沉淀，冷冻干燥，得到芦笋下脚料多糖[22]。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 液料比对芦笋下脚料多糖提取率的影响
提取条件设定为超声时间20 min、超声功率420 W、浸提温度75 ℃、浸提时间100 min、醇沉浓度75%，考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.2.2 超声时间对芦笋下脚料多糖提取率的影响
根据液料比得出的最优结果，设定超声功率420 W、浸提温度75 ℃、浸提时间100 min、醇沉浓度75%，分别考察超声时间10、15、20、25、30 min 对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.2.3 超声功率对芦笋下脚料多糖提取率的影响
根据液料比、超声时间得出的最优结果，设定浸提温度75 ℃、浸提时间100 min、醇沉浓度75%，分别考察超声功率300、360、420、480、540 W 对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.2.4 浸提温度对芦笋下脚料多糖提取率的影响
根据液料比、超声时间、超声功率得出的最优结果，设定浸提时间100 min、醇沉浓度75%，分别考察浸提温度55、65、75、85、95 ℃对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.2.5 浸提时间对芦笋下脚料多糖提取率的影响
根据液料比、超声时间、超声功率、浸提温度得出的最优结果，设定醇沉浓度75%，分别考察浸提时间60、80、100、120、140 min 对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.2.6 醇沉浓度对芦笋下脚料多糖提取率的影响
根据液料比、超声时间、超声功率、浸提温度、浸提时间得出的最优结果，分别考察醇沉浓度55%、65%、75%、85%、95%对芦笋下脚料多糖提取率的影响。
1.3.3 响应面优化试验
基于单因素试验结果，以液料比（A）、超声时间（B）、浸提温度（C）、浸提时间（D）为考察因素，利用Design-Expert 8.0.6 软件以芦笋下脚料多糖提取率为响应值，进行Box-Behnken 响应面试验设计，对试验所得的结果进行分析，获得最佳预测提取工艺参数，并进行验证试验。响应面试验因素水平见表1。
表1 Box-Behnken 设计试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
因素水平-1 0 1 A 液料比/（mL/g）20∶1 30∶1 40∶1 B 超声时间/min 15 25 35 C 浸提温度/℃75 85 95 D 浸提时间/min 80 100 120
1.3.4 多糖提取率计算
1.3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制
根据关曼缇[23]的方法进行改进，采用苯酚-硫酸法测定芦笋多糖含量，称取干燥的葡萄糖标准品20 mg，蒸馏水溶解后，转移至500 mL 容量瓶定容至刻度，此时葡萄糖标准液浓度为40 μg/mL，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的标准溶液于10 mL具塞试管中，分别补足蒸馏水至2 mL，配制成不同浓度梯度的标准溶液。加入1 mL 6%苯酚和5 mL 浓硫酸，盖上试管塞，充分摇匀后冷却15 min，100 ℃水浴显色20 min，再次冷却到室温。以葡萄糖标准液添加0 mL作为空白对照，用紫外可见分光光度计在波长490 nm 处测定各管的吸光值OD490，绘制葡萄糖浓度（μg/mL）和OD490 关系的葡萄糖标准曲线。获取回归方程：y=0.008 2x-0.006 92，R2=0.996 1，根据回归方程确定芦笋多糖浓度。
1.3.4.2 样品多糖测定及计算
称取干燥的样品2.0 mg，用蒸馏水溶解，转移至50 mL 容量瓶定容至刻度，取1.0 mL，溶液稀释100倍，取200 μL 稀释后的样品代替葡萄糖标准液，按1.3.4.1 步骤进行操作，根据标准曲线的回归方程计算芦笋多糖的含量[24]。多糖提取率（X，%）计算公式如下。
式中：X 为多糖提取率，%；c 为回归方程计算获取的芦笋多糖浓度，μg/mL；V 为定容的体积，mL；N 为稀释的倍数；M 为芦笋干粉质量，g。
1.4 数据处理与分析
每组数据均平行测定3 次，利用Excel 进行数据统计分析，结果以平均值±标准差表示；利用GraphPad Prism 7 软件绘图；利用Design-Expert 8.0.6 进行响应面试验结果分析。
2 结果与分析
2.1 芦笋下脚料中多糖提取工艺单因素试验结果
2.1.1 液料比对多糖提取率的影响
不同液料比对多糖提取率的影响见图1。
图1 不同液料比对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异非常显著，P＜0.01；***表示差异极显著，P＜0.001。
由图1 可知，随着溶剂用量增多，多糖提取率整体呈先升高后下降趋势；在液料比10∶1（mL/g）时提取率最低，为（3.69±0.33）%。可能是因为溶液较少，状态黏稠，此时细胞空化不完全，芦笋多糖未完全提取；溶剂用量持续增加，芦笋干粉与溶剂接触逐渐充分，分子运动速度加快，在液料比30∶1（mL/g）时提取率达到最大值，为（5.93±0.29）%，此后当溶剂继续增多时，溶剂过度吸收超声波能量，细胞破碎有限，芦笋多糖溶出效果不准，提取率随之下降[17]。与液料比10∶1（mL/g）相比，液料比30∶1（mL/g）的多糖提取率极显著增加（P＜0.001），液料比20∶1（mL/g）和液料比40∶1、50∶1（mL/g）的多糖提取率分别达到显著（P＜0.05）和非常显著（P＜0.01）水平。因此，选择液料比20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）进行后续响应面优化试验。
2.1.2 超声时间对多糖提取率的影响
超声时间对多糖提取率的影响见图2。
图2 不同超声时间对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异非常显著，P＜0.01。
由图2 可知，超声时间10 min 时，多糖提取率最低，为（3.46±0.18）%，可能是因为超声辅助提取处理前期，超声时间过短，芦笋干粉中成分溶出不完全。超声时间在25 min 时达到最大值（6.24±0.26）%，此时细胞破碎程度大，细胞内的芦笋多糖溶出增多，多糖提取率不断增大。随着超声时间延长，超声时间30 min 提取率减至（5.16±0.54）%，超声波对多糖具有一定的剪切作用，超声时间过长会破坏多糖结构，最终导致多糖提取率下降[25]。与超声时间10 min 相比，超声15 min 多糖提取率呈现显著增加（P＜0.05），且超声时间20、25、30 min 的多糖提取率差异达到非常显著水平（P＜0.01）。随着超声时间延长，多糖提取率整体呈先升高后降低的趋势，因此选择超声时间15、25、35 min 进行后续响应面优化试验。
2.1.3 超声功率对多糖提取率的影响
超声功率对多糖提取率影响见图3。
图3 不同超声功率对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
由图3 可知，超声功率不断增大，多糖提取率整体趋势变化不大，在5.19%～5.45%。与超声功率300 W相比，在超声功率分别达到360、420、480、540 W 时的多糖提取率均未达到显著性增加或减少水平（P＞0.05）。因此综合考虑提取率和能耗等方面，选择超声功率300 W 作为最佳超声功率。
2.1.4 浸提温度对多糖提取率的影响
不同浸提温度对多糖提取率的影响见图4。
图4 不同浸提温度对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
**表示差异非常显著，P＜0.01。
由图4 可知，随着浸提温度不断的升高，多糖提取率整体表现出先升高后下降的趋势；提取率在85 ℃达到最大值（6.32±0.24）%。可能是因为随着浸提温度升高，多糖在水中的溶解加快，因此在55～85 ℃时，多糖提取率不断增大。在85～95 ℃时，高温可能导致多糖活性降低或结构被破坏，同时出现细胞内蛋白质变性的情况，从而导致多糖提取率下降[26]。与浸提温度55 ℃相比，仅浸提温度85 ℃的多糖提取率非常显著增加（P＜0.01）。因此选择浸提温度75、85、95 ℃进行后续响应面优化试验。
2.1.5 浸提时间对多糖提取率的影响
浸提时间对多糖提取率的影响见图5。
图5 不同浸提时间对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异非常显著，P＜0.01。
由图5 可知，在60～100 min 时，多糖提取率不断升高，在100 min 达到最大值，为（6.02±0.33）%，此时芦笋多糖提取效果最好。多糖提取率在60 min 为最小值（4.03±0.26）%，可能是浸提时间过短，芦笋多糖在溶剂里溶解不完全。在100～140 min 时，随着浸提时间延长，多糖提取率反而有所降低，可能是因为此时浸提时间过长导致多糖部分降解[27]。与浸提时间为60 min 相比，浸提时间80 min 的多糖提取率显著增加（P＜0.05），浸提时间100、120 min 的多糖提取率非常显著增加（P＜0.01）。多糖提取率整体随着浸提时间延长呈现出先升高后下降的趋势，因此选择浸提时间80、100、120 min 进行后续响应面优化试验。
2.1.6 醇沉浓度对多糖提取率的影响
醇沉浓度对多糖提取率的影响见图6。
图6 不同醇沉浓度对芦笋下脚料多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of alcohol concentration on the extraction rate of polysaccharides from asparagus scraps
***表示差异极显著，P＜0.001。
由图6 可知，随着醇沉浓度增加，多糖提取率整体呈升高趋势。醇沉浓度升高，多糖聚合度增加，沉淀析出越多[23]，在醇沉浓度95% 时达到最大值（4.29±0.32）%。与醇沉浓度55% 相比，当醇沉浓度为75%、85%、95% 时，多糖提取率极显著增加（P＜0.001）。因此选择95%作为最佳醇沉浓度。
2.2 芦笋下脚料中芦笋多糖提取工艺响应面试验结果
2.2.1 Box-Behnken 响应面试验结果
利用Box-Behnken 中心组合设计原理，通过单因素试验结果结合响应面试验，建立29 组芦笋多糖提取工艺试验，试验结果见表2。
表2 Box-Behnken 试验设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken test design and results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A 液料比/（mL/g）30∶1 30∶1 40∶1 20∶1 40∶1 20∶1 30∶1 20∶1 20∶1 30∶1 20∶1 30∶1 30∶1 30∶1 B 超声时间/min 25 35 25 25 25 35 25 25 25 15 25 25 25 25 C 浸提温度/℃85 85 85 95 85 85 75 75 85 75 85 85 95 85 D 浸提时间/min 100 120 120 100 80 100 120 100 80 100 120 100 120 100提取率/%6.0 5.6 5.3 5.0 5.1 5.2 5.0 4.2 4.3 4.4 5.2 6.3 5.6 6.2
续表2 Box-Behnken 试验设计方案及结果
Continue table 2 Box-Behnken test design and results
试验号15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A 液料比/（mL/g）30∶1 30∶1 30∶1 40∶1 30∶1 30∶1 30∶1 20∶1 30∶1 40∶1 40∶1 30∶1 30∶1 40∶1 30∶1 B 超声时间/min 35 15 15 35 25 35 15 15 25 25 25 35 25 15 25 C 浸提温度/℃95 95 85 85 85 75 85 85 75 75 95 85 85 85 95 D 浸提时间/min 100 100 80 100 100 100 120 100 80 100 100 80 100 100 80提取率/%5.3 5.2 4.8 5.6 6.2 5.0 5.0 4.4 4.8 5.1 5.4 5.2 6.2 5.4 4.9
2.2.2 响应面试验方差分析
响应面试验方差分析结果见表3。
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface test results
注：**为影响非常显著，P＜0.01；*为影响显著，P＜0.05。
参数模型A 液料比B 超声时间C 浸提温度D 浸提时间AB AC AD BC BD CD自由度14显著性**********A2 B2****C2 D2 F 值38.06 65.13 36.63 42.26 33.97 5.43 3.77 7.39 3.77 0.60 3.77 143.96 95.52 162.31 110.56 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.035 3 0.072 6 0.016 7 0.072 6 0.45 4 0.072 6＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1******残差失拟项误差项总和平方和8.84 1.08 0.61 0.70 0.56 0.090 0.063 0.12 0.063 0.010 0.063 2.39 1.58 2.69 1.83 0.23 0.18 0.048 9.07 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28均方0.63 1.08 0.61 0.70 0.56 0.090 0.063 0.12 0.063 0.010 0.063 2.39 1.58 2.69 1.83 0.017 0.018 0.012 1.53 0.361 2
通过回归分析，以芦笋多糖提取率（Y）为响应值，以液料比（A）、超声时间（B）、浸提温度（C）、浸提时间（D）为自变量建立二次多项回归方程：Y=6.18+0.30A+0.22B+0.24C+0.22D-0.15AB-00.12AC-0.18AD-0.12BC+0.050BD+0.12CD0.61A2-0.49B2-0.64C2-0.53D2。
由表3 可知，相关系数分别为R2=0.974 4、R2adj=0.948 8，模型P＜0.01，模型非常显著，失拟项P 值为0.361 2＞0.05（失拟项不显著），该结果说明回归模型方程拟合度较好、误差小、准确且可行性高，可用于本试验芦笋多糖的最佳提取率预测分析。A、B、C、D 项影响极显著（P＜0.01），AB、AD 项影响显著（P＜0.05），AC、BC、BD、CD 项不显著（P＞0.05），A2、B2、C2、D2 影响非常显著（P＜0.01）。由F 值可知，4 个因素对多糖提取率影响的大小顺序为A＞C＞B＞D。
2.2.3 交互作用分析
交互作用的响应面图和等高线图见图7。
图7 各因素交互作用的响应面和等高线
Fig.7 Response surface diagrams and contour plots of the interactions between factors
由图7 可知，液料比和超声时间（AB）、液料比和浸提时间（AD）的响应面图的坡度均趋势陡峭，且等高线较密集，表明两因素之间的交互作用对芦笋多糖提取率影响较大，交互作用显著，与方差分析结果一致。
2.3 芦笋多糖提取工艺验证试验
通过Design-Expert 8.0.6 软件对响应试验结果进行计算分析，得到最佳的提取工艺参数：液料比31.8∶1（mL/g）、超声时间26.90 min、浸提温度86.71 ℃、浸提时间104.08 min，此时预测提取率为6.3%。根据最佳的提取工艺参数，综合考虑材料称量和设备参数设置等因素，确定最佳提取工艺参数：液料比32∶1（mL/g）、超声时间27 min、超声功率300 W、浸提温度87 ℃、浸提时间104 min、醇沉浓度95%，进行3 次验证试验，实际测得芦笋下脚料多糖提取率为（6.26±0.06）%，与预测值接近，该参数准确可靠。
3 结论
近年来，中国芦笋种植市场快速发展，传统的芦笋下脚料处理方式既产生大量浪费又带来环境污染等一系列问题。利用芦笋下脚料为原材料提取芦笋多糖具有成本低、提取简单、收益高等优势。本试验采用水浴浸提-超声波辅助法提取芦笋多糖，以芦笋多糖提取率为考察指标，单因素试验确定超声功率300 W、醇沉浓度95%的提取工艺，通过响应面试验优化确定最佳的提取工艺参数为液料比32∶1（mL/g）、超声时间27 min、浸提温度87 ℃、浸提时间104 min。根据此提取工艺参数进行验证试验，实际测得提取率（6.26±0.06）%，与预测值接近。该提取工艺的研究为芦笋下脚料的回收再利用奠定了一定的理论基础，项目的完成具有一定的经济效益和社会效益。
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