羊肚菌（Morchella spp.）富含蛋白质、氨基酸、呈味核苷酸等重要味觉活性成分，在风味利用及产品加工方面具有较大潜力[1]。目前，羊肚菌仍以鲜销及干制为主，产品种类单一。随着羊肚菌人工栽培技术的日趋成熟、产量日益增大，羊肚菌深加工技术的研究迫在眉睫[2]。
近年来，国内外关于羊肚菌的报道主要集中于栽培技术和多糖等生物活性物质提取研究[3-4]，羊肚菌风味产品的研究鲜有报道。食用菌鲜味物质一般采取热水浸提，存在提取效率较低、能耗大等缺点[5]。卢琪等[6]研究发现未经超微粉碎的菌粉经超高压处理后具有高等鲜度值和抗氧化能力，适用于羊肚菌水提液的精深加工。生物酶解技术作为一种新型的鲜味物质提取工艺，具有条件温和、过程可控、呈味物质得率高等优势[7]，已成功应用于食用菌风味物质的提取，并广泛应用于食用菌的加工处理中。蛋白酶通过将食用菌中蛋白质降解成各种呈味的多肽或氨基酸，以增强食用菌的风味[8]。李琴等[9]研究发现蘑菇汤经过酶解预处理后蛋白质和氨基酸等含量显著增加；刘丽娜等[10]研究发现香菇经风味蛋白酶酶解，其水解度和营养成分提高，且整体风味更好。目前关于羊肚菌酶解的研究较少，而不同蛋白酶的作用位点和作用条件不同，对酶解液的营养和风味影响也不同，因此蛋白酶的选择对于羊肚菌鲜味物质提取至关重要。
本研究以水解液的游离氨基酸总量为指标，对中性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解处理效果进行对比研究，筛选最适宜羊肚菌酶解增鲜的蛋白酶，结合单因素及正交试验方法研究最佳蛋白酶的最优水解工艺，并利用全自动氨基酸分析仪和气质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术对酶解前后羊肚菌氨基酸组成和挥发性风味物质进行分析与评价，以期增强羊肚菌鲜甜风味，并为羊肚菌调味品的产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊肚菌：‘秦岭1 号’，酉阳县诺亚生物科技有限公司；中性蛋白酶（50 000 U/g）、风味蛋白酶（50 000 U/g）、复合蛋白酶（100 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；总氨基酸试剂盒（T-AA）：南京建成生物科技有限公司；纯碱（食品级）：天津渤化永利化工有限公司；柠檬酸（食品级）：河南万邦实业有限公司。
1.2 仪器与设备
气质谱联用仪（6890N-5975B）：美国Agilent 公司；手持pH 计（PH9190-0-00）：香港希玛仪器仪表有限公司；全自动氨基酸分析仪（L-8900）：日本日立公司；数显恒温水浴锅（HH-8）：常州易晨仪器制造有限公司；剪切乳化搅拌机（JRJ-300-I）：上海标本模型厂；高速离心机（TG16G）：湖南凯达科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 羊肚菌液的制备
羊肚菌→粉碎→筛分→加水混匀。
粉碎：挑选无霉变、个体饱满的羊肚菌干品，用粉碎机粉碎。筛分：用筛网进行筛分，截取80～100 目的羊肚菌粉，备用。加水混匀：取一定量的羊肚菌粉末，按照料液比1∶25（g/mL）添加去离子水，用剪切乳化搅拌机混匀，即得羊肚菌液，备用。
1.3.2 不同蛋白酶的酶解
取1.3.1 匀浆后的羊肚菌液，分别采用中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶对羊肚菌进行酶解处理，酶解结束后，沸水浴灭酶10 min，7 000 r/min 离心10 min，取上清液测定其游离氨基酸总量。各蛋白酶的酶解条件如表1 所示。
表1 3 种蛋白酶的酶解条件
Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of three proteases
种类对照（不加酶）中性蛋白酶风味蛋白酶复合蛋白酶pH 值7.0 6.5 6.5温度/℃45 45 45 45时间/h 2.5 2.5 2.5 2.5
表2 羊肚菌酶解正交试验设计
Table 2 Design of orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis of Morchella spp.
水平1 2 3 A 中性蛋白酶添加量/%0.10 0.15 0.20 B 酶解温度/℃35 40 45 C 酶解时间/h 2.0 2.5 3.0 D pH 值6.5 7.0 7.5
1.3.3 中性蛋白酶工艺优化
1.3.3.1 单因素试验
称取一定量的羊肚菌菌粉，按照1∶25（g/mL）的料液比添加去离子水混匀，分别控制中性蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH 值4 个因素，酶解结束后，沸水浴灭酶10 min，7 000 r/min 离心10 min，取上清液测定其游离氨基酸总量。
控制pH 值为7、酶解温度40 ℃以及酶解时间2.5 h，分别在不同中性蛋白酶添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）的条件下进行酶解，考察中性蛋白酶添加量对羊肚菌酶解液中游离氨基酸总量的影响；控制pH 值为7.0、中性蛋白酶添加量0.15%、酶解时间2.5 h，分别在不同酶解温度（30、35、40、45、50 ℃）的条件下进行酶解，考察酶解温度对羊肚菌酶解液中游离氨基酸总量的影响；控制pH 值为7、酶解温度40 ℃、中性蛋白酶添加量0.15%，分别在不同酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）的条件下进行酶解，考察酶解时间对羊肚菌酶解效果的影响；控制酶解温度40 ℃、中性蛋白酶添加量0.15%、酶解时间2.5 h，分别在不同pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的条件下进行酶解，考察pH 值对羊肚菌酶解液中游离氨基酸总量的影响。
1.3.3.2 正交试验
在单因素试验的基础上，确定中性蛋白酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH 值（D）为变量，以游离氨基酸总量为评价指标，进行四因素三水平正交试验。
1.3.4 游离氨基酸总量的测定
参照总氨基酸试剂盒说明书进行测定。
1.3.5 游离氨基酸组成的检测
将酶解处理后和未被酶解的羊肚菌，8 000 r/min离心10 min 取上清液，用0.02 mol/L HCl 溶液稀释，氨基酸样品浓度不得高于0.5 nmol/μL，过0.22 μm 滤膜，采用全自动氨基酸分析仪进行测定[11]。
1.3.6 挥发性风味物质的检测
挥发性风味物质的检测参照常诗洁等[12]的方法并略作修改。20 mL 萃取瓶中加入4 mL 酶解液，加2 g氯化钠至饱和状态，50 ℃恒温水浴20 min 达到平衡，采用2 cm 具有二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂层的固相微萃取萃取头吸附15 min。
将吸附好的萃取头插入气相的进样口，在230 ℃下进行解吸5 min。采用DB-5MS 色谱柱进行分离，然后分别进入质谱（mass spectrometry，MS）检测器中进行检测。柱温箱的温度设置程序：初始温度为35 ℃，保持3 min，然后以6 ℃/min 的速度上升到203 ℃，以10 ℃/min的速度上升到243 ℃，最后保持3 min。氦气为载气，流速为1.2 mL/min。吹扫流量为0.25 min。质谱设定：扫描范围35～450，碰撞电压70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃。每个样品重复3 次。采用MS 谱图和正构烷烃计算挥发性风味物质保留指数（linear retention index，LRI）。
1.4 数据分析
采用Excel 2016 软件进行数据处理、作图，使用IBM SPSS Statistics22 进行差异显著性分析。
2 结果与讨论
2.1 不同蛋白酶对羊肚菌水解效果的影响
食用菌细胞壁是由蛋白质、几丁质、葡聚糖等组成，可以形成较为致密的网状结构。羊肚菌经过物理粉碎可以一定程度破坏其细胞壁结构，增加胞内物质的溶出，而蛋白酶处理也能降解蛋白质，增加通透性，促进内容物的溶出[12]。游离氨基酸总量越高，说明越多的蛋白质被降解，酶解效果越好。羊肚菌经过3 种不同蛋白酶的酶解处理，其游离氨基酸总量的结果如图1 所示。
图1 不同蛋白酶对羊肚菌游离氨基酸含量的影响
Fig.1 Effects of different proteases on content of free amino acids in Morchella spp.
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，3 种蛋白酶对羊肚菌的降解程度具有显著差异，酶解效果从高到低依次为中性蛋白酶＞风味蛋白酶＞复合蛋白酶，与对照（不加酶）组相比，复合蛋白酶的酶解作用微乎其微；风味蛋白酶与对照组相比，游离氨基酸总量有显著增加，但远低于中性蛋白酶处理组，后续试验均采用中性蛋白酶进行研究。
2.2 酶解条件对羊肚菌水解效果的影响
2.2.1 单因素试验结果
中性蛋白酶添加量对羊肚菌游离氨基酸总量的影响如图2 所示。
图2 中性蛋白酶添加量对羊肚菌游离氨基酸总量的影响
Fig.2 Effect of neutral protease dosage on total amount of free amino acids in Morchella spp.
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图2 可看出，随着中性蛋白酶添加量的升高，游离氨基酸总量呈现先上升后趋于平稳的趋势。中性蛋白酶添加量从0.05% 增加到0.15%，酶解液的游离氨基酸总量显著上升，水解程度逐渐增加，当蛋白酶添加量超过0.15%时，酶解液的游离氨基酸总量变化不显著，说明蛋白酶添加已经过量，而反应底物有限，再增加蛋白酶添加量也不会增加酶解液的水解程度。因此，确定最佳的中性蛋白酶添加量为0.10%～0.20%。
不同蛋白酶具有不同的最适温度，酶解温度对酶解效率有一定影响，温度过高或者过低都会影响蛋白酶的催化效率。不同酶解温度下对酶解羊肚菌游离氨基酸总量的影响如图3 所示。
图3 不同酶解温度对羊肚菌游离氨基酸总量的影响
Fig.3 Effects of different enzymatic hydrolysis temperatures on total amount of free amino acids in Morchella spp.
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图3 可看出，酶解温度从30 ℃上升到40 ℃，游离氨基酸总量升高，说明水解程度增加，酶解温度大于40 ℃，游离氨基酸总量降低，说明此时酶的活力已经开始受到抑制。因此，确定最佳酶解温度为35～45 ℃。
不同酶解时间对羊肚菌游离氨基酸总量的影响如图4 所示。
图4 不同酶解时间对羊肚菌游离氨基酸总量的影响
Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on total amount of free amino acids in Morchella spp.
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，随着酶解时间的延长，游离氨基酸含量呈现先上升后趋于平稳的趋势。酶解时间从1.0 h延长至2.5 h，羊肚菌酶解液中游离氨基酸总量逐渐上升，说明水解程度逐渐增加，当酶解时间超过2.5 h，酶解液中的游离氨基酸总量趋于稳定，水解程度不再增加，工业上长时间的酶解会造成极大的能耗浪费。因此，确定最佳酶解时间为2.0～3.0 h。
不同酶解pH 值因素对羊肚菌酶解效果的影响如图5 所示。
图5 不同酶解pH 值对羊肚菌酶解效果的影响
Fig.5 Effects of different pH values on enzymatic hydrolysis of Morchella spp.
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，中性蛋白酶的最适pH 值是7，在此条件下进行酶解中性蛋白酶活力最强，水解程度最高，酶解液中游离氨基酸含量最高。pH 值小于7 或者pH值大于7，酶解液中游离氨基酸总量都呈现减少趋势。因此，确定中性蛋白酶最佳的pH 值为6.5～7.5。
2.2.2 正交试验结果
蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间以及pH 值对酶解液的氨基酸含量有重要影响，通过正交试验优化工艺参数，可以获得水解程度更高的羊肚菌水解液，水解程度的提高，更利于羊肚菌风味、滋味的释放。本研究选用L9（34）正交表，羊肚菌酶解工艺优化正交试验设计及结果见表3。
表3 羊肚菌酶解工艺优化正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal experimental design and result for enzymatic hydrolysis optimization of Morchella spp.
编号因素A 中性蛋白酶添加量B 酶解温度C 酶解时间D pH 值1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1游离氨基酸总量/（mg/g）184.85±2.33 183.53±1.46 196.43±1.93 197.85±0.67 172.63±2.06 198.32±2.78 182.90±2.11 176.88±0.98 220.54±1.12 k2 k3 R 188.27 189.60 193.44 5.17 188.53 177.68 205.10 27.42 186.68 200.64 183.99 16.65 192.67 188.25 190.38 4.42
由表3 可知，影响羊肚菌酶解液水解程度的因素从大到小依次为酶解温度＞酶解时间＞蛋白酶添加量＞pH 值。根据k 值可知，A3B3C2D1 为羊肚菌酶解的最佳工艺参数，即中性蛋白酶添加量0.20%、发酵温度45 ℃、发酵时间2.5 h、pH6.5。
2.3 氨基酸组成
不同氨基酸赋予食品鲜、甜、苦等味道，共同组成羊肚菌独特滋味。Glu 和Asp 是鲜味氨基酸中的特征氨基酸，其组成和含量决定了羊肚菌口味的鲜美和可口程度[13]。酶解处理对羊肚菌水提液中游离氨基酸含量的影响如表4 所示。
表4 酶解处理对羊肚菌水提液中游离氨基酸含量的影响
Table 4 Effect of enzymatic hydrolysis on content of free amino acids of Morchella spp.hydrolysate mg/100 g
注：鲜味氨基酸包括Asp+Glu；甜味氨基酸包括Ala+Gly+Ser+Thr+Pro；苦味氨基酸包括Arg+His+Ile+Leu+Met+Phe+Trp+Val；无味氨基酸包括Lys+Tyr+Cys；*代表必需氨基酸。
酶解样品71.16±0.87 154.11±3.76 103.95±2.44 274.89±5.67 44.63±0.36 468.59±7.25 24.20±0.11 198.90±1.69 0 134.93±3.14 237.66±4.61 129.42±2.06 119.63±3.65 29.20±0.34 0 218.37±4.17 420.90±6.32 1192.17±16.44 346.05±5.34 938.68±14.09 153.62±2.05 2630.51±37.92氨基酸天冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr*）丝氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）半胱氨酸（Cys）缬氨酸（Val*）异亮氨酸（Ile*）亮氨酸（Leu*）蛋氨酸（Met*）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe*）赖氨酸（Lys*）组氨酸（His）精氨酸（Arg）脯氨酸（Pro）甜味氨基酸鲜味氨基酸苦味氨基酸无味氨基酸总氨基酸空白样品37.91±1.32 96.09±3.45 55.13±4.87 168.68±6.96 28.50±1.04 370.69±7.32 37.51±0.78 142.74±4.12 0 92.36±4.08 184.39±5.09 138.01±3.67 122.93±3.34 34.68±0.56 0 149.21±3.76 212.46±4.11 762.87±16.97 206.59±6.76 726.29±16.65 175.52±4.09 1871.26±44.47
从表4 可以看出，复合酶酶解后羊肚菌水提液中氨基酸总量相较于常温浸提原液增加40.57%，其中鲜味氨基酸含量增加最多，为67.51%，甜味氨基酸含量增加56.27%，苦味氨基酸含量增加35.72%，而无味氨基酸含量减少13.03%。说明中性蛋白酶促进蛋白质水解，可以增加羊肚菌的鲜甜风味。水提液中未检测到异亮氨酸（Ile）和组氨酸（His），而卢琪等[6]在羊肚菌水提液中检测到上述成分，推测产生上述差异的原因可能与羊肚菌的检测部位、提取方式、种植手段和种植环境有关。
2.4 GC-MS 分析结果
根据1.3.6 的方法对空白样品（羊肚菌中蛋白酶添加量为0%）、酶解样品（羊肚菌中蛋白酶添加量为0.2%）进行GC-MS 检测。羊肚菌空白样品挥发性风味成分的GC-MS 总离子流色谱图如图6 所示，羊肚菌酶解液挥发性风味成分的GC-MS 总离子流色谱图如图7所示，羊肚菌中挥发性成分GC-MS 检测结果见表5。
图6 羊肚菌空白样品挥发性风味成分的GC-MS 总离子流色谱图
Fig.6 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in blank sample of Morchella spp.by GC-MS
图7 羊肚菌酶解液挥发性风味成分的GC-MS 总离子流色谱图
Fig.7 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in enzymatic hydrolysate of Morchella spp.by GC-MS
表5 羊肚菌中挥发性成分GC-MS 检测结果
Table 5 GC-MS results of volatile substances in Morchella spp.
注：-表示未检出。
分类醇类保留时间/min 化合物名称9.827 15.122 17.905 18.036 18.354 19.193麸醇3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇5-甲基-2-（1-甲基乙基）环己醇4-萜烯醇α-松油醇橙花醇醛类4.241 4.413 7.661 10.743 12.291 14.653 15.269 17.518 24.942 25.772 3-甲基丁醛2-甲基丁醛己醛3-甲硫基丙醛苯甲醛苯乙醛壬醛2-苯基丙烯醛2-苯基-5-甲基-2-己烯醛5-甲基-2-苯基-2-己烯醛酮类11.100 11.353 17.249相对含量/%空白样品3.81-0.75 0.59 1.26 1.21-74.54 11.00 6.44 2.04 4.87 9.27 38.75 1.42-0.74-3.93 3.48-0.26酶解样品4.00 0.28 0.59 0.46 0.77 0.79 1.10 76.85 9.42 19.53 0.57 4.26 7.64 28.76 0.27 0.66 5.57 0.17 7.91 2.89 0.54 4.22烯类呋喃类20.665 12.738 14.980 23.583 23.827 25.292 13.141 19.083 2（5H）-呋喃酮1，2-环戊烷二酮2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮甲基壬基甲酮β-蒎烯γ-松油烯丁香烯α-香柠檬烯β-红没药烯2-正戊基呋喃3-苯基呋喃其他类9.944 10.294 14.068 18.449 20.273 25.082 35.212 2-甲基丁酸二乙烯苯p-伞花烃水杨酸甲酯大茴香醚佛术烷9，12-十八碳二烯酸0.20 7.67 2.40 4.65 0.16 0.20 0.26 3.41 3.41-6.64 2.38 1.03 2.15 0.36 0.12 0.61-0.26 2.69 0.36 1.77 0.14 0.23 0.19 1.98 1.51 0.47 6.56 0.68 0.77 0.59 0.43 3.31 0.62 0.16
由图6、图7 和表5 可知，羊肚菌酶解样品和空白样品分别检测到34、27 种挥发性风味成分，新增挥发性风味成分7 种。其中醇类物质分别检测出6 种和4 种，分别占总挥发性物质的4.00% 和3.81%。醇类物质为羊肚菌提供了铃兰香、花果香、丁香花香等风味，但其阈值较高，对风味的贡献不大[14]。
羊肚菌酶解样品和空白样品中醛类物质分别检测出10 种和8 种，分别占总挥发性物质的76.85% 和74.54%。与羊肚菌中的其他挥发物质相比，醛类是最丰富的风味化合物，这与高娟[15]的研究结果一致。通常，醛类具有坚果味、果味和焦糖样风味[16]。其中，3-甲基丁醛、2-甲基丁醛含量极为丰富，被认为是酱油和其他增味剂中重要增香剂[17]。苯乙醛和苯甲醛表现出香甜、果味和杏仁样气味，被证明是由苯丙氨酸的斯却克尔（Strecker）降解反应降解产生的，是重要的食物香气增强剂[18]。由于醛类物质阈值大多较低，即使在低浓度下也可对香气表达产生显著影响，因而被广泛用作增香剂[19]。
羊肚菌酶解样品和空白样品中酮类物质分别占总挥发性物质的3.93%和7.91%，相对含量增加1.01 倍。2（5H）-呋喃酮和2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮是羊肚菌中主要的酮类物质。酮类挥发性物质赋予羊肚菌可口的香气，包括蘑菇香、花果香、坚果味、奶油和焦糖味等[20]。
3 结论
本文以游离氨基酸总量为指标，研究不同蛋白酶对羊肚菌的酶解效果，筛选羊肚菌酶解增鲜工艺最适蛋白酶，并采用单因素试验以及正交试验，优化最适蛋白酶的水解工艺，在此基础上采用氨基酸分析仪及GCMS 对羊肚菌酶解前后氨基酸组成与挥发性风味物质进行分析评价。结果表明：中性蛋白酶酶解后游离氨基酸总量显著高于其他处理组，因此选择中性蛋白酶对羊肚菌进行酶解处理。中性蛋白酶最佳酶解工艺条件为pH6.5、酶解温度45 ℃、中性蛋白酶添加量0.20%、酶解时间2.5 h。相较于未经酶解处理样品，该工艺条件下所得水解液（游离氨基酸总量220.54 mg/g）鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸浓度增加；醇类、酮类、醛类等挥发性风味物质相对含量增加。研究表明，生物酶解可增加羊肚菌的滋味与风味，可为羊肚菌调味品的生产提供试验参考。
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