米酒，又名醪糟，是我国的传统酿造酒之一[1]。米酒风味独特，醇香诱人，酒精度较低（3% vol～5% vol），适度饮用可以养胃、活血通脉、防病御寒[2]，深受广大消费者的喜爱。传统米酒多采用固态发酵，风味物质主要来源于微生物的相互作用[3]。米酒酒曲有多种微生物，而酒曲中的酵母菌是最重要的发酵菌种[4]。但固态发酵的生产效率低，产品品质难以控制。米酒液态发酵是近几年兴起的新型工艺，具有原材料利用率高、发酵条件容易控制、容易大规模生产等优点。但液态发酵由于其发酵过程中微生物体系单一，酶和代谢产物有所不同，会导致液态发酵米酒中酒体酸、酯类等物质的欠缺[5]，使其风味较差，品质往往低于固态发酵[6]。
针对液态发酵米酒微生物单一、难以产生香味物质的问题，将非酿酒酵母加入到液态米酒进行发酵，不仅可以通过与酿酒酵母混合发酵利用自然发酵的优势，还可以避免发酵过程中意外停滞[7]。杨子琳等[8]用高产香气物质的扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和酿酒酵母混合液态发酵米酒，发现混合发酵米酒的总酯、总酸及氨基酸态氮含量提高而有害醇含量降低。Englezos 等[9]利用杆状红星菌（Starmerella bacillaris）和酿酒酵母按不同接种方式酿造白葡萄酒，结果表明顺序接种对白葡萄酒化学性质和芳香特征方面有很大的提升。可见，非酿酒酵母在酒体芳香物质的提升方面作用显著。不同的非酿酒酵母可以产生不同的代谢产物，这些代谢物质是形成米酒感官特性的风味物质，影响米酒的香气、口感及酒体[10]。其中，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）作为“天然香气的生产工厂”引起众多学者的关注。马克斯克鲁维酵母来源极其广泛，具有较高的代谢多样性和种类多态性，其生长速度快、安全性好、加入米酒发酵中可以改善米酒的酒体、口感和香气，其原因与菌体高产乙酸乙酯能力和发酵过程中产生大量的胞外酶（β-葡萄糖苷酶、α-糖苷酶、酯酶、果胶酶、脂肪酶等）有关[11]。基于以上所述的优点，研究人员开始尝试将马克斯克鲁维酵母应用于酿酒生产中[12]。
本研究选用本课题组前期发现的高产β-葡萄糖苷酶的马克斯克鲁维酵母C21（Kluyveromyces marxianus C21）[13]与酿酒酵母，并将其应用于米酒液态发酵中，分析这两株酵母在米酒液态发酵中的相互作用，优化米酒混合发酵工艺，以期为进一步提高液态米酒的品质提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
马克斯克鲁维酵母C21（Kluyveromyces marxianus C21）由本课题组筛选，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC），保藏编号为13907；酿酒酵母1578（Saccharsaccharus cerevisiae 1578）由中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）提供，保藏编号为CICC 1578。
圆糯米：市售；α-淀粉酶（50 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；糖化酶（50 000 U/g）：江苏博立生物制品有限公司；氯化钾、葡萄糖、氢氧化钠（均为分析纯）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2 仪器和设备
WFB-HS0950 破壁料理机：江门市西屋厨房小家电有限公司；HBS-1096B 酶标仪：美国Molecular Devices 公司；MCV-131BNF（T）超净工作台：潍坊英轩实业有限公司；Ev201 旋转蒸发仪：日本东京理化器械株式会社；DHP120 电热恒温培养箱：上海实验仪器厂有限公司；YXQ-LS-50A 立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZHWY-1102 大容量恒温培养摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；3K15 高速冷冻离心机：美国Sigma 公司；DSY-2-4 水浴锅：北京国华世纪医疗器械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基的配制
YPD 培养基：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g（用于固体培养基），蒸馏水1 000 mL，121°C 灭菌20 min。
七叶苷固体培养基：七叶苷1 g，柠檬酸铁1 g，蛋白胨2.5 g，琼脂20 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1 000 mL，121°C 灭菌20 min。
孟加拉红固体培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，孟加拉红33.3 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
1.3.2 菌粉的制备
将保藏的K.marxianus C21 配制成菌液，并按照3% 的接种量接入配制好的YPD 培养基中活化，培养条件为30 ℃、120 r/min 恒温培养摇床中培养24 h。培养结束后，菌液在4 ℃、8 000 r/min 的高速冷冻离心机中离心10 min。将离心后的菌体用无菌水重新溶解再离心，反复3 次后冻干制得菌粉。S.cerevisiae 1578 菌粉的制备同上。K.marxianus C21 及S.cerevisiae 1578的活菌总数均为107 CFU/g。
1.3.3 混合液态发酵米酒工艺流程
糯米粉碎后过50 目筛，根据预试验结果，将糯米粉与水按料液比1∶6（g/mL）混合均匀，加入α-淀粉酶（15 U/g，以糯米粉计），90 ℃水浴锅中糊化90 min，冷却至室温后加入糖化酶（150 U/g，以糯米粉计），65 ℃水浴锅中液化30 min，期间需不断搅拌，最后121 ℃灭菌20 min 即为糯米酶解液[14]。将菌粉分别按推荐接种量0.1%（质量分数）接种于糯米酶解液中，摇匀后在28 ℃条件下恒温静置发酵，发酵结束后用4 层滤布过滤，滤液经巴氏杀菌[15]得到成品米酒。米酒的工艺流程见图1。
图1 米酒工艺流程
Fig.1 Process of rice wine
1.3.4 米酒发酵液理化指标及β-葡萄糖苷酶活性的测定
发酵液以8 000 r/min 离心8 min，上清液在-4 ℃下保存，备用。
酒精含量的测定采用GB/T 13662—2018《黄酒》中的蒸馏法；乙酸乙酯含量的测定采用皂化回滴法[16]；还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[17]。
β-葡萄糖苷酶活性的测定参考Hu 等[18]的方法。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside，PNPG）为显色底物，准确吸取0.2 mL适度稀释的酶液，于60 ℃恒温水浴预热10 min，再加入0.2 mL 已经预热10 min 的1.6 mmol/L 的PNPG 溶液，在60 ℃的水浴中孵育30 min，然后加入0.4 mL 的1 mol/L 的Na2CO3 溶液停止反应，在405 nm 波长下，用分光光度法测定对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）的释放量。在60 ℃条件下每分钟催化生成1 μmoL PNP所需的酶量为1 个酶活力单位。
1.3.5 K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 的鉴定
参考刘梦等[19]的方法，将活化后的K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 菌株梯度稀释至10-7 CFU/mL后，均匀涂布在孟加拉红固体培养基平板上，28 ℃恒温培养48 h 后，观察酵母菌落生长情况。
1.3.6 混合发酵米酒的单因素试验设计
将K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 顺序接种在糯米酶解液中进行液态发酵，分别考察发酵时间、发酵温度、液料比、混合酵母添加量对成品米酒感官评分和酒精度的影响。
1）发酵时间：料液比为1∶6（g/mL）的糯米培养基中添加0.2% 的混合酵母，于28 ℃电热恒温培养箱中分别培养60、72、84、96、108 h，发酵结束后巴氏杀菌即得成品米酒，测定其感官评分和酒精度。
2）发酵温度：料液比为1∶6（g/mL）的糯米培养基中添加0.2%的混合酵母，分别放入25、28、31、34、37 ℃的电热恒温培养箱中培养84 h，发酵结束后巴氏杀菌即得成品米酒，测定其感官评分和酒精度。
3）料液比：料液比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）的糯米培养基中添加0.2% 的混合酵母，于28 ℃的电热恒温培养箱中培养84 h，发酵结束后巴氏杀菌即得成品米酒，测定其感官评分和酒精度。
4）混合酵母添加量：料液比为1∶6（g/mL）的糯米培养基中分别添加混合酵母0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，于28 ℃的电热恒温培养箱中培养84 h，发酵结束后巴氏杀菌即得成品米酒，测定其感官评分和酒精度。
1.3.7 混合发酵米酒的响应面试验设计
在单因素试验的基础上选择料液比、发酵时间、发酵温度3 个主要因素，根据Box-Behnken 中心组合设计原理进行三因素三水平响应面优化分析试验。对K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 混合液态发酵米酒的工艺条件进一步优化，从而确定最佳发酵条件。试验因素水平见表1。
表1 Box-Behnken 试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test
水平-1因素0 1 A 料液比/（g/mL）1∶3 1∶4 1∶5 B 发酵时间/h 60 72 84 C 发酵温度/℃22 25 28
1.3.8 感官评价
感官评价参考王奇盛等[20]的方法，并稍作修改。采用观察和品尝的方法，挑选10 名经过相应培训的感官评价员参与品尝试验，并按照感官评价标准进行综合评分，以平均分作为最终的感官评分。混合发酵米酒的感官评价标准见表2。
表2 混合发酵米酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of mixed fermented rice wine
项目色泽和外观（25）评分1～＜10 10～＜20 20～25香气（25）口感（25）风格（25）评价标准具有应有色泽，包装容器底部有大量沉淀物，有外来杂质具有应有色泽，包装容器底部有明显沉淀物，无外来杂质具有应有色泽，包装容器底部有微量沉淀物，无外来杂质有轻微米酒特有香气具有米酒特有的醇香具有浓郁米酒特有的醇香，无异香口感较差，有异杂味口感较好，无异杂味醇甜，爽口，协调，无异杂味几乎无发酵型米酒风格有发酵型米酒风格有明显发酵型米酒风格1～＜10 10～＜20 20～25 1～＜10 10～＜20 20～25 1～＜10 10～＜20 20～25
1.4 数据处理
使用Microsoft Excel 2016 软件进行数据处理，使用SPSS 软件中的方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行显著性分析（P＜0.05），使用GraphPad Prism 8.0 软件进行绘图处理。结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单独发酵及同时接种混合发酵米酒产乙酸乙酯含量、酒精度变化
脂类化合物在米酒中主要呈现花香和果香，可以在不同程度上对米酒的风味起修饰作用[21]。图2 为单独发酵及混合发酵米酒过程中乙酸乙酯含量和酒精度随发酵时间的变化趋势图。
图2 K.marxianus C21 单独发酵及与S.cerevisiae 1578 混合发酵米酒对乙酸乙酯含量、酒精度的影响
Fig.2 Effect of rice wine fermented with K.marxianus C21 alone and mixed with S.cerevisiae 1578 on ethyl acetate production and alcoholic content
实线为乙酸乙酯含量；虚线为酒精度。
由图2 可知，在相同条件下，单独发酵和混合发酵产酯趋势随发酵时间的延长均呈先升高后下降的趋势，在60 h 时乙酸乙酯含量最高，分别为13.50 g/L 和10.42 g/L，原因是酯的合成和水解是同步双向进行的，在发酵前期，酯酶的能力大于水解酯酶的能力，而在发酵后期，水解酯酶的能力大于合成酯酶的能力[22]。K.marxianus C21 单独发酵的产酯能力略高于与S.cerevisiae 1578 混合发酵。而单独发酵的酒精度（2.63%vol）明显低于混合发酵（4.13% vol）。综上，混合发酵优于单菌发酵。
2.2 接种比例对同时接种混合发酵米酒的影响
接种比例对同时接种混合发酵米酒的影响见图3。
图3 K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 混合发酵米酒接种比例对发酵米酒的影响
Fig.3 Effect of inoculation ratio of K.marxianus C21 and S.cerevisiae 1578 on fermented rice wine
同一指标不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3 可知，K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578的不同接种比例对发酵米酒的乙酸乙酯含量和酒精度存在明显影响。随着接种比例的增加，酒精度不断减小，发酵液的乙酸乙酯含量先降低后增加。这可能是酿酒酵母发酵产生的酒精抑制K.marxianus C21 酵母菌生长，从而影响了乙酸乙酯的合成[23]。当接种比例继续增加至1 000∶1 时，发酵液中的乙酸乙酯含量增加，说明K.marxianus C21 酵母菌产生活性较高的β-葡萄糖苷酶，促进酯类香气成分生成。综上，接种比例为1∶1 时，乙酸乙酯含量达9.79 g/L、酒精度为4.42%vol，选用K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 接种比例1∶1（质量比）进行后续试验。
2.3 K.marxianus C21 单独发酵米酒过程中活菌数及β-葡萄糖苷酶活性变化
图4 为K.marxianus C21 单独发酵米酒过程中酵母种群动态和β-葡萄糖苷酶活性变化。
图4 K.marxianus C21 发酵米酒过程中的酵母活菌数和β-葡萄糖苷酶活性变化
Fig.4 Changes of viable count and β-glucosidase activity during K.marxianus C21 fermentation of rice wine
研究发现，酵母菌株对米酒最终风味特征的影响在很大程度上取决于发酵过程中酵母细胞的生物量[24]，非酿酒酵母在生物量达到106～107 CFU/mL 时，能够改善酒的风味特征[25]。由图4 可知，K.marxianus C21 初始活菌数为2×106 CFU/mL，在第48 小时达到最大活菌数为3×107 CFU/mL，然后随发酵时间延长而下降。同时β-葡萄糖苷酶活性与其活菌数变化趋势相似，在第48小时达到最大值0.848 U/mL。这表明K.marxianus C21的生物量可能与其β-葡萄糖苷酶活性密切相关[26]。根据菌株种群和酶活性的变化，选择K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 的连续接种时间为48 h。
2.4 接种方式对混合发酵米酒的影响
图5～图7 为4 种不同接种方式发酵米酒的乙酸乙酯含量、酒精度和还原糖含量随发酵时间的变化趋势图。
图5 4 种不同接种方式发酵对米酒乙酸乙酯含量的影响
Fig.5 Effect of four different inoculation methods on ethyl acetate content of fermented rice wine
图6 4 种不同接种方式发酵对米酒酒精度的影响
Fig.6 Effect of four different inoculation methods on alcoholic content of fermented rice wine
图7 4 种不同接种方式发酵对米酒还原糖含量的影响
Fig.7 Effect of four different inoculation methods on reducing sugar content of fermented rice wine
由图5～图7 可知，4 种接种方式的产酯能力随发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势。K.marxianus C21 单独发酵米酒的产酯量最高，其次是混合顺序接种。产酒精能力随发酵时间的延长呈现先升高后基本稳定的现象，S.cerevisiae 1578 单独发酵高于混合顺序发酵。糖是酒精发酵的重要底物[27]。与S.cerevisiae 1578 单独发酵的米酒相比，K.marxianus C21 单独发酵的米酒在一定程度上延迟了发酵过程，这反映了其相对较弱的发酵能力[28]。此外，混合同时接种发酵比混合顺序接种发酵时糖的消耗更快。综上所述，混合顺序发酵是米酒最优的接种方式。
2.5 K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 在孟加拉红培养基上的鉴定结果
图8～图10 为K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 在孟加拉红培养基上的鉴定结果。
图8 K.marxianus C21 在孟加拉红培养基上的鉴定结果
Fig.8 Identification of K.marxianus C21 on Rose bengal medium
图9 S.cerevisiae 1578 在孟加拉红培养基上的鉴定结果
Fig.9 Identification of S.cerevisiae 1578 on Rose bengal medium
图10 K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 在孟加拉红培养基上的鉴定结果
Fig.10 Identification of K.marxianus C21 and S.cerevisiae 1578 on Rose bengal medium
由图8～图10 可知，K.marxianus C21 在孟加拉红培养基上无酵母菌落生长，S.cerevisiae 1578 在孟加拉红培养基上有酵母菌落生长且显色，K.marxianus C21与S.cerevisiae 1578 混合酵母在孟加拉红培养基上有酵母菌落生长且酵母菌落数少于S.cerevisiae 1578。因此可根据酵母菌落是否生长来区分2 种酵母。
2.6 混合顺序接种发酵米酒过程中活菌数及β-葡萄糖苷酶活性变化
图11 为混合顺序接种发酵米酒在连续接种发酵过程中酵母菌活菌数及β-葡萄糖苷酶活性变化。
图11 混合发酵米酒过程中K.marxianus C21 与S.cerevisiae 1578 酵母菌活菌数及β-葡萄糖苷酶活性变化
Fig.11 Changes of viable count and β-glucosidase activity of K.marxianus C21 and S.cerevisiae 1578 during mixed fermentation of rice wine
由图11 可知，K.marxianus C21 初始活菌数为2×106 CFU/mL，在第48 小时达到最大活菌数，为3×107 CFU/mL。连续接种酿酒酵母后，K.marxianus C21的活菌数受到明显影响，发酵72 h 开始明显低于酿酒酵母菌株。导致K.marxianus C21 的活菌数迅速下降，在发酵120 h 时，K.marxianus C21 酵母菌未检出。研究表明，微生物间的相互作用和乙醇浓度的变化是影响酵母演代的潜在重要因素[29]。
2.7 混合发酵米酒的单因素试验分析
发酵时间（60、72、84、96、108 h）对混合发酵米酒感官评分及酒精度的影响见图12。
图12 不同发酵时间对米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.12 Effect of different fermentation times on sensory score and alcohol content of rice wine
同一指标不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图12 可知，酒精度随发酵时间的延长呈先升高再下降后基本稳定的趋势，酒精度在发酵72 h 时达到最高，为3.57%vol；而感官评分由于发酵时间较短，酵母未完全发酵，香味虽浓但口感平淡，因而呈现先升高而后下降的趋势，当发酵时间为84 h 时感官评分最高，为83，此时的米酒口感爽口、酒味醇香。因此，综合考虑选择发酵时间为60、72、84 h 进行后续响应面试验。
发酵温度（25、28、31、34、37 ℃）对混合发酵米酒感官评分及酒精度的影响见图13。
图13 不同发酵温度对米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.13 Effect of different fermentation temperatures on sensory score and alcohol content of rice wine
同一指标不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图13 可知，感官评分和酒精度随着温度的增加呈现先下降后升高的趋势。发酵温度为25 ℃时，酒精度达到最高值为，3.16%vol，而感官评分在25 ℃和37 ℃条件下无显著差异。因此，综合考虑选择发酵温度为22、25、28 ℃进行后续响应面试验。
混合酵母添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）对混合发酵米酒感官评分及酒精度的影响见图14。
图14 不同混合酵母添加量对米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.14 Effect of different yeast inoculums on sensory score and alcohol content of rice wine
同一指标不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图14 可知，酒精度随混合酵母添加量的增加呈先升高后下降的趋势，在混合酵母添加量为0.5%时，酒精度最高，为4.63% vol；而感官评分随混合酵母添加量的增加呈下降的趋势，在混合酵母添加量为0.2%时，感官评分最高，为86，此时的酒精度为3.15% vol。因此，综合考虑选择最适混合酵母添加量为0.2%。
料液比[1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）]对混合发酵米酒感官评分及酒精度的影响见图15。
图15 不同料液比对米酒感官评分和酒精度的影响
Fig.15 Effect of different solid-to-liquid ratio on sensory score and alcohol content of rice wine
同一指标不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图15 可知，酒精度随着料液比的增加呈现下降的趋势，在料液比为1∶3（g/mL）时，酒精度最高，为4.93% vol；感官评分呈波动变化趋势，在料液比为1∶4、1∶6（g/mL）时，感官评分最高，为82。因此，综合考虑选择料液比为1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）进行后续响应面试验。
2.8 混合发酵米酒的响应面优化试验结果分析
2.8.1 响应面分析方案及结果
在单因素试验基础上，最终选择料液比、发酵时间和发酵温度3 个因素为自变量，以感官评分为响应值，设计三因素三水平响应面分析试验，试验设计及结果见表3。
表3 Box-Behnken 试验结果
Table 3 Result of Box-Behnken test
编号A 料液比C 发酵温度1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 1-B 发酵时间0-1 1 1 0 0-1 0 0 0 0-1 0 1 1 1-1 0--1-1 1 0 0-11 12 13 14 15 16 17 0 0 0 0 1 1 0-1 1 1 0 1 0-1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0-1感官评分99 80 81 77 84 98 83 79 82 87 98 84 98 83 86 99 80
通过Design-Expert 软件对数据进行回归分析，以A 料液比、B 发酵时间、C 发酵温度3 个因素为自变量并以混合发酵米酒的感官评分（Y）为响应值，拟合所得多元二次回归方程为Y=98.4+2.00A+1.75B-1.50C-9.45A2-6.45B2-8.45C2。
回归模型方差分析见表4。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of the regression model
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差的来源模型A 料液比B 发酵时间C 发酵温度AB AC BC总和1 023.24 32.00 24.50自由度均方113.69 32.00 24.50 F 值468.15 131.76 100.38 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1显著性********A2 B2******C2 74.12 0.00 0.00 0.00 1 548.28 721.28 1 237.94残差失拟项纯误差总误差18.00 0.00 0.00 0.00 376.01 175.17 300.64 1.70 0.50 1.20 1 024.94 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16 18.00 0.00 0.00 0.00 376.01 175.17 300.64 0.24 0.17 0.30****0.56＜0.000 1 0.000 1 0.000 1 0.000 1 0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.671 6
由表4 可知，模型P＜0.000 1，表明该模型达到极显著水平，而失拟项P＞0.05，不显著，表明试验的误差较小；相关系数R2=0.998 3，Radj2=0.996 2，表明99.62%的响应值变化来自于所选的变量，该模型的拟合度较好，可用于确定混合发酵米酒的最佳工艺条件。
各因素交互作用对感官评分影响的响应面见图16～图18。
图16 发酵时间与发酵温度交互作用对感官评分影响的响应面
Fig.16 Response surface of interactive effect of fermentation times and fermentation temperatures on sensory scores
图17 发酵时间与料液比交互作用对感官评分影响的响应面
Fig.17 Response surface of interactive effect of fermentation times and solid-to-liquid ratios on sensory scores
图18 发酵温度与料液比交互作用对感官评分影响的响应面
Fig.18 Response surface of interactive effect of fermentation temperatures and solid-to-liquid ratios on sensory scores
由图16～图18 可知，各因素之间均有交互作用。从响应面的陡峭程度来看，图16～图18 响应曲面变化坡度均较陡峭，说明料液比、发酵时间和发酵温度3 个指标对感官评分影响显著。
2.8.2 验证试验
经过响应面试验优化后，米酒的最优发酵条件为料液比1∶4.105（g/mL）、发酵时间73.620 h、发酵温度24.733 ℃，此发酵条件下米酒的感官评分为98.69。考虑到试验的可操作性，将工艺调整为料液比1∶4（g/mL）、发酵时间74 h、发酵温度25 ℃。在此条件下进行3 次平行试验，米酒的感官评分为98，与响应面预测值相符，表明此模型可用于优化米酒生产工艺。
3 结论
通过考察酵母活菌数和β-葡萄糖苷酶活性变化，明确K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 的连续接种时间为48 h。研究发现，K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 的不同接种比例及不同接种方式对发酵米酒的乙酸乙酯含量和酒精度有明显影响，确定K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 接种比例为1∶1（质量比），接种方式为混合顺序接种。通过单因素试验及响应面试验，确定最佳发酵条件为料液比1∶4（g/mL）、发酵时间74 h、发酵温度25 ℃、混合酵母添加量0.2%。综上，K.marxianus C21 和S.cerevisiae 1578 混合顺序发酵能够改善米酒的风味及口感，为进一步提高米酒的品质提供参考。
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