植物蛋白肉因其与传统肉类的高相似度和丰富的蛋白质含量成为越来越多消费者的选择，其受欢迎程度取决于它们与真正肉类各种特征的相似程度。植物蛋白肉的感官特性越接近传统肉制品，消费者的认可度越高[1]。肉制品较重要的感官特性是味道和品质，其中包括肉的嫩度和多汁性[2]。油脂的添加对植物蛋白肉的口感和风味具有重要影响，油脂是影响肉类多汁、柔嫩程度和风味物质释放的主要属性[3]。添加油脂有利于改善产品的多汁性、嫩度和风味。如何将油脂加入到高水分挤压的植物蛋白肉中是一个值得研究的问题，因为直接添加液体油脂会使植物蛋白肉在挤压过程中物料受到剪切力的作用从而发生滑移现象，使得挤出物无法稳定成型[4]。Kendler 等[5]直接在挤压过程中添加油脂，结果表明加入4% 油脂的产品与面团相似，挤出物无任何质构特征。研究人员为改善这一状况提出了不同的方式将油脂添加到植物蛋白肉中，例如Martins 等[6]报道了通过凝胶将富含不饱和脂肪的植物油转化为类固体体系，Wang 等[7]报道了通过在高水分挤压过程中添加水包油乳剂，将玉米油加入到挤出物中，该方法得到的纤维状挤出物含油量可达8%。虽然这些方法可以将油脂添加到植物蛋白肉中，但添加少量油脂就会导致植物蛋白肉不成形或使植物蛋白肉口感变差。因此，探索新的油脂添加方式来改善植物蛋白肉的品质特性仍然是目前需要研究的问题。
传统肉制品中含有大量的饱和脂肪，摄入过多会对人体健康构成很大的威胁[8]。长期摄入饱和脂肪和反式脂肪会导致冠心病、心血管疾病、动脉粥样硬化和肥胖等疾病[9]。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种不饱和脂肪酸，它可以促进婴儿大脑和肝脏发育、降低心血管疾病、炎症性疾病和肿瘤的风险[10]。欧洲食品安全署确定了DHA 每日摄入量大约为每人每天0.25～0.50 g。因此，将DHA 藻油微胶囊粉加入到植物基肉类类似物中不仅可以提升植物基肉类类似物的品质特性，还可以替代传统肉类中的饱和脂肪来改善产品营养结构。通过微囊粉的形式将DHA藻油添加到植物蛋白肉中，可能是一种更安全、更健康、更绿色、更有营养的传统肉类替代方法。
通过喷雾干燥法将油脂微胶囊化是一种成熟技术，这种技术不仅可以把DHA 藻油转化为固体体系，还可以防止DHA 藻油的氧化，从而最大程度地保存油脂的营养成分。固体体系的DHA 微胶囊粉可以作为饱和脂肪和反式脂肪更健康的替代品加入到植物基肉类类似物中，还可能消除在高水分挤压过程中产品的滑移现象，而且不会降低消费者对产品功能和感官品质的期望。本研究旨在探索通过微囊粉的形式替代液态油脂将DHA 藻油添加至高水分肉类类似物的原料中，从而降低油脂对加工过程的负面影响，并进一步改善植物蛋白肉的营养结构和品质特性。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
大豆分离蛋白（soy protein isolates，SPI；纯度≥90%）：山东山松生物科技有限公司；小麦谷脘粉（wheat glutinous powde，WGP；纯度≥90%）：封丘华丰粉业有限公司；DHA 藻油微胶囊粉末（oil microcapsule powder，OMP；DHA≥11%；用DHA 藻油通过喷雾干燥制备）：青岛海之源生命科技有限公司；复合磷酸盐（composite phosphate，CP；纯度≥90%）；江苏燕科生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
实验双螺杆挤出机（AHT36）：山东真诺智能设备有限公司；真空冷冻干燥机（Scientz-18N）：宁波新芝生物科技股份有限公司；生物力学测试仪（EZ-Test）：日本岛津公司；低场核磁共振分析仪（NMI20-030V-I）；上海纽迈电子科技有限公司；流变仪（RH-20）：上海保圣实业发展有限公司；扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（TESCAN MIRA LMS）：泰思肯贸易（上海）有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）（DH108）：北京乐氏科技有限公司；色差仪（3nh）：深圳市三恩时科技有限公司；重量给料机（AHT36）：山东真诺智能设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 植物蛋白肉的制备
挤出试验通过同向旋转和啮合双螺杆挤出机进行。挤出机筒包含7 个区域，尺寸为70 mm×100 mm×1 800 mm（宽×高×长）的长冷却模连接到挤出机筒的末端。将SPI 和WGP 以7∶3（质量比）的比例混合，其中添加1% 的磷酸盐络合物作为初始成分，并将初始成分与DHA 藻油微胶囊粉末（0%、2%、5%、10%、15%和25%）以不同添加量混合。使用重量给料机将干燥成分以10 kg/h 的速率进料到实验双螺杆挤出机中。通过入口以15 kg/h 的恒定流量将水注入挤出机中，以获得最终产品中约60%（湿基）的水分含量。螺杆速度为800 r/min，从进料到模具的7 个区域中的筒体温度设定为40、60、80、120、140、160 ℃和150 ℃。使用循环水进行冷却，并将冷却温度设置为40 ℃。从冷却模的末端收集挤出物。然后，将挤出物冷却至室温，使用真空密封器真空包装在塑料袋中，并在-80 ℃下储存，直到进一步分析，以防止保存期间质量恶化。为了进行分析，样品4 ℃下保存。工艺流程见图1。
图1 植物蛋白肉的制备工艺流程
Fig.1 Preparation flow diagram of vegetable protein meat
1.3.2 色度分析
使用色差仪测量生产的植物蛋白肉的颜色。在测量之前，使用白色校准瓦片进行校准。参数表示为L*（亮度）、a*（红色或绿色）和b*（黄色或蓝色）的值。在随机选择的位置对每个样品进行3 次测量。
1.3.3 沃-布氏（Warner-Bratzler）剪切试验
Warner-Bratzler 试验测量了最大剪切力，该剪切力是刀具在肉制品中切割运动的函数。采用生物力学测试仪对植物蛋白肉制品样品的剪切强度进行分析。根据Novaković 等[11]和Chiang 等[12]的改进方法评估织构化程度。将挤出物切成150 mm×70 mm×500 mm 的长方体。使用沃氏切割器沿挤出机方向以1 mm/s 的速率垂直（FL）和水平（FV）切割样品（Warner-Bratzler 测试的探针由带有V 形切口的单个刀片组成）。产品嫩度用FL 表示，纹理化度按以下公式计算。产品的咀嚼性用剪切能（剪切过程中剪切力的积分）表示。每次分析重复30 次，以测量每个样品的FL 和FV（n=30）。
X=FL/FV×100
式中：X 为纹理化度，%；FL 为垂直方向切割力大小，N；FV 为水平方向切割力大小，N。
1.3.4 硬度分析
将样品切割成方形（30 mm×70 mm× 300 mm），采用疲劳弹性测试的球形探头以0.5 mm/s 的速度下压样品，压缩至样品厚度的50%，维持下压状态60 s，让球形探头感受产品的回弹力，取下压至样品厚度40%时探头感受到的力为样品的硬度。
1.3.5 扫描电子显微镜分析
通过扫描电子显微镜观察具有不同比例DHA 的高水分肉类类似物的横截面。将样品直接黏合在导电黏合剂上，并使用溅射涂布机在10 mA 下用金喷涂45 s。然后在扫描电子显微镜下以100 倍和1 000 倍放大率观察样品，加速电压为3 kV 用于轮廓分析，15 kV 用于能谱图绘制。检测器为SE2 二次电子检测器。
1.3.6 傅里叶变换红外光谱
取5 mg 冻干样品，将其研磨成粉末并过120 目筛，通过将1～2 mg 样品与100 mg 溴化钾混合并在研钵中研磨混合物来制备溴化钾圆盘。将100 mg 的混合物压圆盘中，记录红外光谱。扫描次数为64，分辨率为4 cm-1，每个样品测试3 次，取平均值。使用OMNIC 9.2.86 软件对红外图谱进行基线校正、归一化和去卷积化处理，使用peakfit V4.12 软件对1 700 ～1 600 cm-1（酰胺I 区）进行拟合分析[13]。
1.3.7 流变特性分析
在使用流变仪前，将挤出物样品冷冻干燥，研磨至小于500 μm 的颗粒尺寸，并再以20%添加量分散在蒸馏水中，搅拌1 h。在流变学测试之前，将再水合样品真空包装，并在4 ℃冰箱下储存12 h 以上，以确保水分分布均匀。将分散液装入流变仪平行板（直径50 mm）正下方，在25 ℃下进行剪切测试。剪切速率范围为1～100 s-1。
1.4 统计分析
使用方差分析和皮尔逊相关系数（r）对所有数据进行分析，挤压响应参数和挤压物的质地间的皮尔逊相关系数值使用统计产品SPSS Statistics 23.0 进行分析。显著性差异水平P＜0.05 为差异显著。使用origin 2021 软件制作数据图片。
2 结果与分析
2.1 色度分析
肉类类似物的色泽影响消费者对产品的接受程度[14]。表1 为不同添加量的DHA 藻油微胶囊粉代表性样品的颜色参数。
表1 不同添加量OMP 对高水分肉类类似物颜色的影响
Table 1 Effects of different addition amounts of oil microcapsule powder（OMP）on the color of high-moisture meat analogue
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
?
由表1 可知，随着OMP 添加量从0% 到25%，样品的L*值显著下降（P＜0.05），这表明OMP 添加量越大，样品颜色越深，OMP 添加量影响了样品的颜色参数，发生这一现象的原因一方面是美拉德反应引起的[15]，用于制备OMP 的原材料中含有葡萄糖浆，还原糖可以和蛋白质中游离氨基发生美拉德反应使样品颜色加深，从而导致L*值的降低。另一方面，葡萄糖浆在挤压过程中由于高温会发生焦糖化反应也会导致颜色加深，深色的产品色度与传统肉类相似度更高，也更容易被消费者接受。另外挤压过程中的热化学处理可能引起与样品颜色相关的其他反应[16]。
相反，样品的a*值和b*值随着OMP 添加量增加而升高，a*值和b*值的增加是由于OMP 原料本身的浅黄色导致。
2.2 质构分析
肉类类似物的质地特性和纤维化度与消费者对其接受度密切相关[17]。表2 展示了不同添加量的OMP样品的结构性质。
表2 不同添加量OMP 对高水分肉类类似物质构的影响
Table 2 Effects of different addition amounts of oil microcapsule powder（OMP）on the texture of high-moisture meat analogue
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
OMP 添加量/%纹理化度/%1.66±0.04cd 1.82±0.13ab 1.84±0.08ab 1.98±0.04a 1.76±0.03bc 1.55±0.10d 0 2 5 10 15 25硬度/N 10.51±0.52a 9.75±0.31a 8.18±0.13b 6.68±0.52c 6.16±0.28c 4.91±0.84d嫩度/N 38.03±0.89a 36.17±1.67ab 34.99±0.27b 31.31±0.96c 26.18±1.17d 20.42±1.48e咀嚼性/J 0.34±0.01a 0.33±0.01b 0.32±0.01b 0.30±0.01c 0.27±0.01d 0.24±0.01e
由表2 可知，OMP 的添加对样品的硬度、嫩度、咀嚼性和纤维化度都存在明显影响。没有添加OMP 的样品比添加了2%～25% OMP 的样品质地更坚硬也更有嚼劲。OMP 添加量为25%时，硬度从（10.51±0.52）N 降低到了（4.91±0.84）N，这说明过量添加OMP 会导致产品变软，这类食品更适合老年人。OMP 的添加会导致样品的孔隙率增大，从而导致样品更软和咀嚼性更低。Lin 等[18]研究发现挤压过程中蛋白质含量越高，蛋白质形成纤维结构的可能性越大，产品的硬度也越大。本研究中随着原料中OMP 添加量不断增多，原料中大豆分离蛋白和小麦谷脘粉所占比例减少，也会导致硬度和咀嚼性的减小。
本试验中使用Warner-Bratzler 测试来测量样品的嫩度和纹理化度。Warner-Bratzler 测试测量了最大剪切力作为刀具通过肉类产品切割运动的函数[19]。使用Warner-Bratzler 测试了样品的嫩度和纤维化度，在纤维化存在情况下（纹理化度＞1），嫩度值越小说明产品越嫩，口感越好。由表2 可知，随OMP 添加量的不断增加，样品的嫩度和咀嚼性显著降低（P＜0.05），表明了油脂可以增加肉类类似物的嫩度。当OMP 添加量为25%时，样品孔隙率和细胞尺寸增大，堆积密度和抗剪切能力降低，导致布氏切刀的剪切力减少从而直观反应了嫩度值的减小。这一检测结果和Wang 等[7]的报告中利用水包油策略添加油脂使产品的硬度值和嫩度值降低的结果一致。
纹理化度是表征样品纹理结构或纤维结构的一个指标。它以FL 和FV 的比值来表示，当纹理化度为1时，样品呈各向同性，不含有纹理纤维化结构。纹理化度值越高表示样品呈现的纹理化结构越好。由表2 可知，不同OMP 添加量样品的纹理化度均＞1，这说明了添加了OMP 的样品都含有纹理化结构。随着OMP 添加量的不断增多（0%～25%），样品的纹理化度呈现先增加后减少的趋势，在OMP 添加量为10%时，样品表现出了最大的纹理化度为1.98，添加10% 的OMP 表现出比不添加OMP 的产品更高的纹理化度，说明添加适量的OMP 可以增加产品的纹理化结构。当OMP 添加为25%时样品仍保持着1.55 的纹理化度，这说明了通过微囊粉的形式添加油脂是可行的方法。
2.3 视觉图像和宏观结构分析
在挤压结束后立即观察，直观地评估了样品的组织化度和各向异性结构的形成，图2 为不添加OMP 和分别添加2%、5%、10%、15%、25% 的OMP 挤压样品的表面、横切向和纵切向的视觉结构图片。
图2 不同OMP 添加量的样品视觉表面图、横切面图和纵切面图
Fig.2 Surface，cross-sectional，and longitudinal views of samples added with different amounts of oil microcapsule powder（OMP）
A.表面图；B.横切面图；C.纵切面图。
如图2 所示，对于样品的表面，添加25% OMP 的样品明显比没有添加OMP 的样品颜色深（图2A），这与色差仪分析结果一致。没有添加OMP 的样品表面光滑，添加OMP 的样品表面出现了挤压痕迹和裂纹，随着OMP 添加量增多，样品表面的痕迹逐渐增多，在添加了15% 和25% 的样品表面可以明显看到OMP导致的痕迹以及沿流动方向的各向异性结构分布，且分布均匀。
通过沿挤出方向和垂直挤出方向的撕裂来观察样品的内部结构，比较不同OMP 添加量的样品，在沿挤出方向切割图（图1B）可以发现所有的样品均表现出明显的纤维结构，OMP 添加量为0%和2%时，样品的横纵切面图几乎没有任何差异，在OMP 添加量为10%时，样品表现出最佳的纹理化结构，即使添加25% 的OMP，样品仍然呈现较好的纹理纤维结构和各向异性结构，此观察结果和表1 中Warner-Bratzler 测试得到的纹理化数据一致，这也说明了通过微囊粉的形式向产品中添加油脂是一个成功的方法。在沿垂直挤出方向的切面图中（图1C）可以看到所有样品均呈现分层状结构，但添加了25% OMP 的样品层状结构减少，但仍然呈现了肉眼可见的分层结构。Kendler 等[5]将油脂分别从挤压区的第二和第七区间加入，发现在不同添加点添加油脂的样品没有明显差异，但是比较不同含油量时，发现添加4%的样品看起来更像是面团，纤维化结构差。本研究添加25%的微囊粉的产品中，部分纤维结构出现了小部分断裂的现象，该研究结构和Wang 等[7]的研究利用油/水乳状液策略添加8% 油脂到产品中的结果一致，其原因可能是由于油脂起到了润滑作用，降低了冷却模具中的剪切应力导致的[20]。
研究表明直接在挤压过程中直接添加液态油无法使纤维结构形成，挤出物样品的纤维结构破裂，在生产过程中出现滑移现象，油在表面分离，当直接添加更多的油时，挤压产品无法成型[16]。直接添加油脂的结果表明这种方法无法获得和传统肉类结构相似的纤维和纹理化结构。与直接加油法相比，本试验通过微胶囊粉的形式添加油脂的肉类类似物均表现出明显的纤维结构，说明该策略可用于研究油对高水分肉类类似物结构性能的影响。
2.4 最佳肉类类似物样品扫描电镜分析
扫描电子显微镜可以直观地观察样品的纤维化程度以及OMP 在样品中的分布情况[21]。图3 为分别添加2%、5%、10%、15% OMP 的样品在放大100 倍和1 000 倍下的电镜照片。
图3 不同OMP 添加量的样品纵切面SEM 图
Fig.3 SEM images of longitudinal sections of samples added with different amounts of oil microcapsule powder（OMP）
A 为放大100 倍，B 为放大1 000 倍。
由图3 可知，每个样品的SEM 图均表现出小孔结构，随着OMP 添加量的逐渐增加，样品的孔隙率逐渐增加，这种结构导致样品硬度和咀嚼性减小，这与质构结果一致。图3A 显示了产品的层状结构，这是由于挤出过程中的高温和高压使蛋白质被重新交联，从而形成各向异性纤维结构和层状结构。在图3B 中可以看出，样品内油脂均匀分布。
2.5 傅里叶变换红外光谱分析
图4 为不同OMP 添加量样品的傅里叶变换红外光谱图。
图4 不同OMP 添加量的样品傅里叶变换红外光谱图
Fig.4 FTIR spectra of samples added with different amounts of oil microcapsule powder（OMP）
傅里叶红外光谱是表征蛋白质结构和构象常用的方法[22]。它是基于测量分子由于化学官能团内的键吸收红外辐射而产生的振动运动[23]。由图4 可知，添加OMP 样品傅里叶红外图在2 928（C—H 拉伸）、1 745 cm-1（C—O 拉伸）和1 148 cm-1（CH2 和C—O—C对称拉伸）出现3 种特征吸收峰。在1 745 cm-1 处观察到和酯官能团相关的强带，这表明样品中存在脂质，随着OMP 添加量不断增多，在1 745 cm-1 的峰吸收强度明显不断增大，这也证明DHA 藻油成功地以微囊粉的形式添加到高水分肉类类似物中。
所有的分离蛋白在3 278 cm-1（酰胺A）、2 923 cm-1、2 855 cm-1（酰胺B）、1 633 cm-1（酰胺I）、1 516 cm-1（酰胺II）和1 233 cm-1（酰胺III）区域均表现出与蛋白质结构相对应的特征带。分离蛋白的主要酰胺I 峰出现在1 634～1 638 cm-1。随着OMP 添加量的不断增多，酰胺I 峰不断增大，酰胺I 区是对蛋白质二级结构敏感的区域，因此，该区域被用来估计分离蛋白在干燥状态下的二级结构。
表3 为不同OMP 添加量的样品蛋白质的二级结构所占比例。
表3 不同OMP 添加量的样品蛋白质二级结构
Table 3 Protein secondary structure of samples added with different amounts of oil microcapsule powder（OMP）
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
OMP 添加量/%0 2 5 10 15 25 α-螺旋/%13.33±0.02f 16.36±0.05e 19.34±0.02c 19.60±0.02b 19.79±0.01a 17.54±0.01d β-折叠/%29.89±0.30c 38.95±0.15a 29.16±0.35d 29.74±0.19c 29.16±0.04d 38.19±0.48b β-转角/%36.88±0.12a 26.68±0.52d 31.51±0.03b 30.5±0.27c 31.21±0.31bc 26.15±0.72d无规则卷曲/%19.70±0.05d 18.31±0.01f 19.76±0.12c 19.88±0.02b 20.03±0.01a 18.87±0.12e
由表3 可知，在二级结构中α-螺旋结构占13%～20%，β-折叠占29%～39%，β-转角占26%～37%，无规则卷曲占18%～21%。β-折叠和β-转角是主要的二级结构，其次是α-螺旋和无规则卷曲，这表明添加了OMP 的肉类类似物主要以β 结构存在。
2.7 流变分析
图5 为不同OMP 添加量对样品流变特性的影响。
图5 不同OMP 添加量对样品流变特性的影响
Fig.5 Effects of different addition amounts of oil microcapsule powder（OMP）on the rheological properties of samples
由图5 可知，所有样品均随剪切速率的增加，溶液的黏度呈逐渐降低的趋势，在剪切速率10～30 s-1，表观黏度急速下降，但随着剪切速率升高，表观黏度的下降速率变慢并趋于平缓，这是典型的剪切稀化行为，这是由于高浓度生物聚合物具有典型的剪切减薄行为。从图5 可以看出，产品的表观黏度随着OMP 添加量的增加而降低，该结果和Kendler 等[5]直接添加油脂到小麦面筋蛋白挤出物中的结果一致。不仅通过简单的稀释来导致黏度的降低，还可能通过增加小麦谷脘粉的分子流动性来起到增塑剂的作用从而导致黏度降低。
3 结论
本研究以SPI 和WGP 为原料，通过双螺杆挤出机湿法挤压研究不同添加量（0%、2%、5%、10%、15% 和25%）的OMP 对植物基高水分肉类类似物品质特性的影响。结果发现所有样品均成型性较好且的纤维化度均大于1，在OMP 添加量为10%时样品表现出了最大的纹理化度（1.98），这表明与直接加油法相比，微囊粉加油法更有利于样品纤维结构的生成。随着OMP 添加量不断增加，植物基肉类类似物的嫩度值减小，表明嫩度增加。通过样品外观和扫描电镜观察到DHA 藻油以微胶囊粉的形式成功加入到高水分肉类类似物中，傅里叶红外光谱图也证明了这一点。本研究提供了一种新的保证高水分挤出物纤维结构的加油技术，结果表明DHA 藻油以微囊粉的形式加入到高水分肉类类似物中改善了产品的营养结构和品质特性。
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