花生是世界上最重要的油料作物之一。花生主要用于生产油脂产品，而榨油后的花生粕大多被用于加工动物饲料，其中花生蛋白含量很高，造成了蛋白质资源的极大浪费。花生蛋白因其中含有大量的必需氨基酸和较高的营养价值而受到消费者和生产商的青睐。然而，与其他植物蛋白相比，花生蛋白的功能性（如溶解性和乳化性）较差，极大地限制了花生蛋白的应用。
为了增加花生蛋白在食品工业中的应用，目前研究大多集中在蛋白质改性上，以改善其功能特性，获得相对稳定的食品。物理、化学和酶修饰已被用于改善花生蛋白的功能特性[1-3]。其中通过限制性酶解改性蛋白质可以断开蛋白分子中的肽键，打开蛋白质的折叠结构，使疏水基团暴露出来，既能有效提高其界面吸附性能，也能使其两亲性能得到显著增强[4]，从而改善蛋白质的功能性。而糖基化是以美拉德反应为基础，蛋白质的氨基与多糖分子的还原羰基发生缩合反应形成席夫碱，然后生成糖胺的重排产物[5]。经水解的蛋白质会暴露其赖氨酸残基，可与多糖的还原末端羰基发生高度反应，空间位阻增加，进而提高蛋白质的功能性质。有研究发现通过将有限的水解和糖基化相结合可以有效提高大米蛋白的乳化活性和稳定性[6]。Zhang等[7]研究发现通过美拉德反应将分离乳清蛋白水解物与半乳糖共价偶联可以提高其抗氧化活性。由于目前有关水解和糖基化复合改性花生蛋白的研究鲜见，因此，本文将探究酶解和糖基化复合改性对花生分离蛋白的结构和功能特性的影响。
本文以花生粕为原料，利用碱溶酸沉法提取花生分离蛋白，通过木瓜蛋白酶限制性酶解制备花生分离蛋白酶解物，并与葡聚糖进行糖基化反应，系统分析花生分离蛋白（peanut protein isolate，PPI）改性产物的结构特性和功能特性，以期制备出功能特性良好的花生分离蛋白，为花生蛋白改性及其在食品工业中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
低温花生粕：河南工业大学蛋白质化学与应用实验室自制；葡聚糖：河南东顺化工产品有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、邻苯二甲醛、考马斯亮蓝G250：上海源叶生物科技有限公司；L-赖氨酸：天津市光复精细化工研究所；四硼酸钠：洛阳昊华化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠、溴化钾、95% 磷酸、重硫酸钾、氯化铁、三氯乙酸、无水乙醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海麦克林生化科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1901 紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；F-7000 荧光分光光度计：日立高新技术公司；WQF-510 傅里叶变换红外光谱：北京瑞丽分析仪器有限公司；HSHZ-B 水浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械有限公司；LGJ-10C 型冷冻干燥机：北京四环科技开发有限公司；FM200 高速剪切机：上海弗鲁克科技发展有限公司；FJS-6 搅拌水浴锅：上海维诚仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 花生分离蛋白的提取
将低温花生粕与蒸馏水以1∶10（g/mL）的料液比进行溶解并调节pH 值至9.0，随后用搅拌水浴锅50 ℃搅拌2 h，5 000 r/min 离心10 min，将上清液pH 值调至4.5，5 000 r/min 离心10 min，收集沉淀并进行冷冻干燥即可得到花生分离蛋白，用凯式定氮法测得PPI 的蛋白含量为86.42%。
1.3.2 花生分离蛋白酶解物的制备
用蒸馏水配制浓度为4% 的花生分离蛋白溶液，室温下磁力搅拌1 h，调节pH 值为6.5，按底物浓度的2% 添加木瓜蛋白酶进行酶解30 min（水解度为2.35%），酶解过程中维持pH 值恒定，酶解完成后，酶解液于沸水浴中灭酶10 min，以5 000 r/min 离心20 min，上清液冷冻干燥后即得花生分离蛋白酶解物（peanut protein isolate hydrolysate，HPPI），用凯式定氮法测得HPPI 的蛋白含量为80.09%。
1.3.3 糖基化产物的制备
将花生分离蛋白酶解物与葡聚糖进行1∶3（质量比）混合溶于蒸馏水中，搅拌均匀，将其在80 ℃水浴中加热反应2～6 h，反应结束后立即冰水浴冷却至室温，4 ℃下透析48 h，冷冻干燥得到花生分离蛋白酶解物糖基化产物（glycosylation of peanut protein isolate hydrolysate，G-HPPI）。
1.3.4 接枝度的测定
参考Yi 等[8]报道的邻苯二甲醛法测定糖基化产物的接枝度并稍作修改。接枝度（G，%）的计算公式如下。
式中：C0、Ct 分别为反应前和反应后蛋白质溶液中游离氨基含量，μg/mL。
1.3.5 褐变程度和中间产物含量的测定
参考Li 等[6]方法并略作修改。以蒸馏水为样品稀释液，分别测定420 nm 和294 nm 处的吸光度，分别表示褐变程度和中间产物含量的变化。
1.3.6 紫外光谱测定
参考张廷奕等[9]方法并略作修改。用蒸馏水将糖基化产物稀释为蛋白浓度0.2 mg/mL，在190～400 nm处进行紫外光谱扫描。
1.3.7 内源荧光光谱测定
参考Zhang 等[7]方法并略作修改。用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7）将糖基化产物稀释为蛋白浓度0.2 mg/mL，在激发波长280 nm、发射波长300～500 nm条件下测定其荧光强度。
1.3.8 傅里叶变换红外光谱测定
将样品和溴化钾以1∶100 的质量比混合，并研磨加工成薄片，置于傅里叶变换红外光谱仪中进行全波长（4 000～400 cm-1）扫描，扫描32 次，分辨率为4 cm-1。
1.3.9 溶解度的测定
采用考马斯亮蓝G250 染色法。参考Xu 等[10]的方法并稍作修改，将样品配制成5 mg/mL 的蛋白溶液，5 000 r/min 离心10 min，收集上清液。将5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液加入1 mL 上述样品液中，于595 nm处测定其吸光度，根据牛血清蛋白标准曲线，计算蛋白浓度。蛋白质溶解度（S，%）的计算公式如下。
式中：W0 为上清液蛋白含量，mg/mL；W 为蛋白总含量，mg/mL。
1.3.10 乳化活性及乳化稳定性的测定
参考贾润红[11]的方法并稍作修改，测定乳化活性和乳化稳定性。乳化活性（A，m2/g）及乳化稳定性（S，min）的计算公式如下。
式中：N 为稀释倍数；A0 为0 min 时500 nm 处的吸光度；c 为蛋白浓度，g/mL；θ 为油相体积，20% ；A10为10 min 时500 nm 处的吸光度；t 为放置时间，10 min。
1.3.11 表面疏水性的测定
利用ANS 测定样品的表面疏水性（H0）[12]。将不同反应时间的糖基化产物用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）配制成0.1～0.6 mg/mL 的蛋白溶液，加入ANS 溶液静置15 min，在激发波长390 nm、发射波长470 nm处，采用荧光分光光度计测定荧光强度。
1.3.12 抗氧化性的测定
1）还原力的测定
采用Dong 等[13]的方法来测定样品的还原力并略作修改。将2 mL 样品（2.0 mg/mL）加入2.5 mL 磷酸盐缓冲液（2.0 mol/L，pH6.6）和2.5 mL 1% 铁氰化钾溶液中。在50 ℃条件下孵育20 min，加入10% 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）2.5 mL，在4 000 r/min 条件下离心10 min。取4 mL 上清液，加入0.5 mL 0.1%氯化铁溶液混合，静置10 min，采用用紫外分光光度计在700 nm 处测定吸光度。
2）DPPH 自由基清除率的测定
采用Roy 等[14]的方法测定DPPH 自由基清除活性并略作修改。将2 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmoL/L）与2 mL 糖基化产物溶液（2 mg/mL）混合均匀，避光反应30 min，于517 nm 处测定吸光度，DPPH 自由基清除率（R，%）计算公式如下。
式中：A0 为2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL 蒸馏水在517 nm 处的吸光度；A1 为2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL样品液在517 nm 处的吸光度；A2 为2 mL 样品液+2 mL无水乙醇在517 nm 处的吸光度。
3）ABTS+自由基清除率的测定
将ABTS 溶液（7 mmol/L）和重硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）按1∶1（体积比）混合，取4 mL ABTS 溶液加入100 μL 糖基化样品上清液，振荡30 s，静置10 min后，于734 nm 波长处测定吸光度[15]。ABTS+自由基清除率（T，%）计算公式如下。
式中：B0 为4 mL ABTS 溶液+100 μL 无水乙醇在734 nm 处的吸光度；B1 为4 mL ABTS 溶液+100 μL 样品溶液在734 nm 处的吸光度。
1.4 数据处理
试验数据重复测定3 次，结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0 软件对数据进行处理和显著性分析，采用Origin 2023 绘图。
2 结果与分析
2.1 反应时间对接枝度的影响
图1 为HPPI 与葡聚糖在不同反应时间下的接枝度。
图1 反应时间对糖基化产物接枝度的影响
Fig.1 Effect of reaction time on the grafting degree of glycosylated products
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，接枝度随反应时间的延长而逐渐升高，在6 h 时接枝度达到74.34%，反应时间的延长促进了蛋白质的部分展开，从而导致内部ε-氨基暴露，并与葡聚糖分子的还原基团进行糖基化反应[16]。与Chen等[17]的研究结果相似。
2.2 反应时间对褐变程度和中间产物含量的影响
褐变程度和中间产物含量也是评价美拉德反应进程的常用指标，反应时间对褐变程度和中间产物含量的影响见图2。
图2 反应时间对褐变程度和中间产物的影响
Fig.2 Effects of reaction time on browning degree and intermediate products
（a）褐变程度；（b）中间产物含量。
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2（a）可知，褐变程度随反应时间的延长而逐渐加深，原因是随着反应时间的延长，蛋白质结构更加舒展，有利于蛋白质和葡聚糖之间发生羰氨反应，因此褐变程度加深。由图2（b）可知，中间产物含量整体呈现先增加后降低的趋势，原因可能是在反应过程中，糖基化产物发生裂解，产生醛、酮等物质[18]。
2.3 反应时间对紫外光谱的影响
反应时间对紫外光谱的影响见图3。
图3 反应时间对紫外光谱的影响
Fig.3 Effect of reaction time on ultraviolet spectra
由图3 可知，HPPI 在290 nm 左右有最大吸收峰，而花生分离蛋白酶解物的糖基化产物吸收峰并未发生明显的红移或蓝移，但是紫外吸收强度均高于HPPI和PPI。随着反应时间的延长，糖基化产物最大吸收峰的紫光吸收强度逐渐增强，说明随着反应时间的延长，蛋白质肽链逐渐展开，空间结构发生改变，使得内部的芳香族氨基酸充分暴露出来[19]。
2.4 反应时间对荧光光谱的影响
荧光强度主要反映蛋白质色氨酸的变化，是反应蛋白质构象变化和氨基酸损失的重要指标[20]。反应时间对荧光光谱的影响见图4。
图4 反应时间对荧光强度的影响
Fig.4 Effect of reaction time on fluorescence intensity
由图4 可知，与PPI 相比，HPPI 及其糖基化产物的最大发射波长总体呈现红移现象，表明经有限酶解后蛋白质中疏水性氨基酸暴露于更加亲水的环境中[10]。花生分离蛋白经酶解和糖基化复合改性后其荧光强度随反应时间的延长而降低，可能是由于蛋白质三级结构的改变使暴露出来的疏水性氨基酸与多糖发生接枝反应，随着反应时间的延长，接枝度越来越高，表现出越来越大的空间位阻作用，屏蔽了荧光发色基团的信号，从而使荧光强度逐渐降低[21]。
2.5 反应时间对傅里叶变换红外光谱的影响
傅里叶变换红外光谱可以用于研究蛋白质-碳水化合物的相互作用，还可用来表征蛋白质的结构变化。反应时间对傅里叶变换红外光谱的影响见图5。
图5 反应时间对傅里叶变换红外光谱的影响
Fig.5 Effect of reaction time on Fourier infrared spectra
由图5 可知，PPI 经过适度酶解后，在3 200～3 700 cm-1 间的吸收峰变强，这是因为酶解过程中肽键断裂，引起—OH 的伸缩振动和—NH 的振动[22]。与HPPI 相比，G-HPPI 糖基化产物的吸收峰在3 200～3 700 cm-1 范围内面积增大，表明HPPI 与葡聚糖共价结合后得到的糖基化产物羟基数量增加，引起C—OH的伸缩振动[23]。在1 654 cm-1 处的吸收峰代表酰胺Ⅰ带，经酶解和糖基化复合改性后发生轻微偏移，表明PPI 二级结构发生了改变。在1 531 cm-1处的吸收峰代表酰胺Ⅱ带，经复合改性后其吸收峰偏移到1 544 cm-1，表明改性后蛋白分子结构中酰胺基团增加，引起N—H弯曲振动[24]。此外，在1 000～1 100 cm-1范围内G-HPPI糖偶联物出现一个新的吸收峰，表明HPPI 和葡聚糖进行了共价接枝，从而导致了C—N、C—H 和C O 键的伸缩振动增加[5]。因此，以上结果表明HPPI 与葡聚糖形成共价键，酶解及糖基化改性后分子间相互作用力和化学键都发生了变化，蛋白质空间结构也随之变化。
2.6 反应时间、pH 值对溶解度的影响
由于蛋白质的溶解度与其他功能特性紧密相关，因此有必要探索改性花生蛋白的溶解度。PPI、HPPI和不同G-HPPI 接枝物在不同pH 值、不同反应时间下的溶解度如图6 所示。
图6 pH 值对溶解度的影响
Fig.6 Effect of pH on solubility
同一pH 值不同小写字母表示各样品差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，与PPI 相比，HPPI 在pH3～7 范围内样品的溶解度显著增加。相比未水解蛋白，蛋白质水解产物中的多肽极性更强，因此它们可以与水形成更强的氢键，从而更易溶于水溶液。G-HPPI 接枝物的溶解度均高于HPPI，这可能是由于葡聚糖的添加，增加了亲水性基团，从而提高了其溶解度，这与Ding 等[25]研究结果一致。其中，反应4 h 的G-HPPI 在pH7 时溶解度达到最高，为91.56%，较相同pH 值下的PPI 提高1.77 倍。此外，接枝物在5 h 以后溶解度在pH6～7内有所降低，可能是由于糖基化程度较高，生成了大分子聚合物导致溶解度降低。
2.7 反应时间对乳化活性和乳化稳定性的影响
反应时间对乳化活性和乳化稳定性的影响见图7。
图7 反应时间对乳化活性和乳化稳定性的影响
Fig.7 Effects of reaction time on emulsifying activity and emulsifying stability
不同小写字母表示样品乳化活性差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示样品乳化稳定性差异显著（P＜0.05）。
由图7 可知，HPPI 的乳化活性和乳化稳定性显著高于PPI，原因是酶解后蛋白质疏水基团的暴露。GHPPI 接枝物的乳化活性和乳化稳定性显著高于HPPI，乳化活性先增加后降低，在4 h 时乳化活性达到最高，为61.08 m2/g，较PPI 提高了5.28 倍。这可能是因为HPPI 和葡聚糖之间的共价交联改变了蛋白质结构，适量加入多糖可提供更大的位阻，防止油滴聚集，从而提高接枝物的乳化性能[26-27]。在反应时间5～6 h，接枝物的乳化活性降低，原因可能是随着反应时间的延长，接枝度进一步增强导致蛋白中疏水性基团减少，从而使其界面活性降低。有研究表明接枝度较高可能会降低G-HPPI 偶联物的乳化活性和乳化稳定性[6]。
2.8 反应时间对表面疏水性的影响
蛋白质表面疏水性是用来表征蛋白质表面疏水性基团数量的指标[10]。PPI、HPPI 和不同反应时间的GHPPI 接枝物的表面疏水性如图8 所示。
图8 反应时间对表面疏水性的影响
Fig.8 Effect of reaction time on surface hydrophobicity
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图8 可知，酶解后PPI 的表面疏水性显著低于天然PPI，可能是由于酶解破环了蛋白质中的疏水基团，从而导致HPPI 的表面疏水性降低。与HPPI 相比，随着反应时间的延长，接枝物的表面疏水性明显降低，这与糖基化程度有关，随着接枝度的增加，表面疏水性逐渐降低。原因可能是一方面通过接枝反应的时间延长，大量亲水性羟基引入体系中，提高了体系的亲水性[28]；另一方面，随着反应时间的延长，分子内部的极性基团暴露，从而降低了其疏水性[23]。Achouri 等[29]也发现大豆蛋白的表面疏水性随着糖基化程度的增加而显著降低。
2.9 反应时间对抗氧化性的影响
2.9.1 反应时间对还原力的影响
在还原力测定中，被测样品中还原剂的存在可以抑制或减少Fe3+/铁氰化物向亚铁形式（Fe2+）的转化。不同样品的还原力见图9。
图9 反应时间对还原力的影响
Fig.9 Effect of reaction time on reducing ability
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图9 可知，HPPI 和G-HPPI 的还原力均高于PPI，糖基化产物的还原能力随着反应时间的延长整体呈先增加后下降的趋势，在4 h 达到最高，为0.284，说明糖基化反应能够提高HPPI 的还原能力。美拉德反应产物的抗氧化活性部分依赖于类黑素，这些类黑素是在反应后期偶联物降解而产生的。后期还原能力略有下降，可能与糖基化产物中类黑素的部分分解有关，这与Xiao 等[30]研究结果一致。
2.9.2 反应时间对DPPH 自由基清除能力的影响
不同反应时间对DPPH 自由基清除能力的影响如图10 所示。
图10 反应时间对DPPH 自由基清除能力的影响
Fig.10 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging capacity
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图10 可知，随着反应时间的延长，DPPH 自由基清除能力先增大后减小，可知糖基化反应能够提高酶解物的抗氧化性。清除DPPH 的能力随反应时间的延长减弱，可能归因于具有抗氧化能力的糖基化中间化合物的降解，如羟甲基糠醛。另一方面，由于美拉德反应后期的一些氨基酸序列重排，所产生的产物可能会削弱清除DPPH 自由基的能力[30]。
2.9.3 反应时间对ABTS+自由基清除能力的影响
不同反应时间对ABTS+自由清除率的影响如图11 所示。
图11 反应时间对ABTS+自由基清除能力的影响
Fig.11 Effect of reaction time on ABTS+radical scavenging capacity
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图11 可知，糖基化能够显著提高ABTS+自由基清除率，随着反应时间的延长，ABTS+自由基清除力最高达到82.92%。HPPI 和G-HPPI 接枝物抗氧化能力的增强可能是由于PPI 的结构改变，打开并暴露了能够与氧化剂反应的活性氨基酸残基，此外糖基化反应生成的类黑素具有较强的自由基清除能力。Zhang等[7]也发现乳清蛋白水解物与半乳糖接枝产物的ABTS+自由基清除率高于乳清蛋白和乳清蛋白水解物，并随反应时间的延长，ABTS+自由基清除率整体呈逐渐增强趋势。
3 结论
通过有限酶解与糖基化反应相结合可以改变花生分离蛋白的结构及功能特性。经过复合改性后花生分离蛋白具有较高的接枝度，达到74.34%。通过紫外光谱可知，随反应时间的延长，紫外吸收强度逐渐增加，蛋白质肽链逐渐展开，芳香族氨基酸暴露；内源荧光强度随着反应时间的延长，荧光强度逐渐降低，表明花生分离蛋白的三级结构发生变化，接枝物处于更加亲水的环境中；红外光谱证实了糖基化反应的发生和蛋白质的空间结构发生了变化。通过酶解和糖基化改性，提高了花生分离蛋白的溶解度，乳化活性随着反应时间的延长先增加后降低，在4 h 达到最高，为61.08 m2/g。糖基化产物的抗氧化活性均明显提升，表面疏水性随着反应时间的延长逐渐降低，这与糖基化程度有关，随着接枝度的增加，表面疏水性逐渐降低。综上所述，本研究发现复合改性后的花生分离蛋白具有较高的溶解度、乳化活性和抗氧化性，是具有良好的两亲性和抗氧化活性的乳化剂，能够为花生蛋白作为理想乳化剂提供理论依据，同时为扩大花生蛋白在食品工业中的应用提供理论依据和技术支撑。
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