2021 年5 月，国际益生菌和益生元科学协会发表了后生元（postbiotics）的共识声明：后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂[1]。后生元是益生菌经热处理、物理性处理、高静水压处理、冷冻干燥、超声波振荡等加工方式处理后，仍保留与活菌相同活性成分的统称，包括菌体成分和代谢产物。后生元蕴含多种对机体有益的活性成分，如胞外多糖、短链脂肪酸、有机酸、维生素、抗菌肽以及菌体成分等，具有抗炎、抗过敏、抗氧化、调节免疫、预防或治疗代谢性疾病等作用，是一种卓越的健康效应因子[2]。除具有显著的益生功效外，后生元还具有益生菌无法比拟的优点：一方面，后生元更稳定，与活的益生菌相比，具有更长的保质期；另一方面，后生元安全性更高，对一些特殊人群如新生儿、敏感人群同样适用，而益生菌对这些敏感人群存在一定风险。后生元不受抗生素的干扰抑制，而益生菌却难以与抗生素同时使用，且有传递耐药基因风险；此外，后生元具有更广泛的作用靶点，不仅限于肠道，口腔、皮肤、泌尿生殖道或鼻咽等都可作为后生元的靶点，而且更易于被肠道吸收，提高利用率[3]。因此，后生元应用范围非常广，可以用于食品、化妆品、饲料、植物营养等多个行业中。目前，已发现后生元在抗炎、维护肠屏障、免疫调节、降血压、预防心血管疾病、抗菌、保肝、抗氧化等方面可发挥作用。
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种呈S型或者弧形弯曲的革兰氏阴性细菌，常寄生在胃黏膜组织中，感染后主要引起腹部疼痛、恶心、胀气、胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性萎缩性胃炎等疾病，同时，与胃黏膜相关的恶性淋巴瘤、胃癌等疾病的发生密切相关[4]。Hp 感染是一个长期且慢性的过程，感染后人体一般难以自发清除而导致终身感染，需要进行根除治疗[5]。目前，主要通过三联疗法来治疗Hp 感染，但是三联疗法需要频繁使用羟氨苄青霉素、庆大霉素、克拉霉素和阿莫西林等抗生素，易导致Hp 耐药性增加。并且，使用三联疗法治疗Hp 感染易导致腹痛、恶心和腹泻等严重的不良反应，使得治疗效果往往达不到预期[6]。因此，亟需找到一种能够有效治疗Hp 感染的药物或治疗方式，不增加Hp 耐药性的同时，在治疗过程中不会导致患者产生不良反应，以提高Hp 临床治疗的效果。目前文献报道的临床研究绝大多数使用活菌型的益生菌，灭活益生菌的相关临床及基础研究鲜见报道。有研究表明，灭活的罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DSM17648 具有一定的直接抑制Hp 的作用，其疏水率、自凝集率、与Hp 共聚结合率以及对胃、小肠黏膜上皮细胞黏附率均较高，显示出较强的黏附能力[7]。灭活的卷曲乳杆菌CCFM1118 制得的后生元CCFM1118-IB 可对Hp 产生直径为（12.25±0.29）mm 的抑菌圈，且对Hp 具有共聚集作用。同时临床测评显示，CCFM1118-IB 可显著降低受试者的13C-尿素呼气值、抑制PGⅠ/PⅡ升高，并影响拟杆菌属、瘤胃球菌等肠道菌的丰度，但CCFM1118-IB 并不会影响受试者的正常生理状态[8]。本文评估后生元Probio-Eco对Hp 的抑制和清除作用，以及对Hp 黏附胃上皮细胞AGS 和对Hp 诱导胃上皮细胞AGS 产生炎症因子白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的影响，以期为缓解幽门螺杆菌感染和根除幽门螺杆菌提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
大豆粉（食品级）：上海麦克林生化科技股份有限公司；脱脂乳（食品级）：新西兰恒天然集团；柠檬酸钠（食品级）：苏州如日化工科技有限公司；氯化钠、甲硝唑（均为分析纯）：杭州宝赛生物科技有限公司；胃上皮细胞AGS、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：美国R&D 公司；NaCl、NaHCO3、HCl（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；尿素、酚红、戊二醛溶液、固定液、磷酸、锇酸、无水乙醇、柠檬酸铅、Spurr 包埋剂、丙酮、醋酸双氧铀（均为分析纯）：武汉塞维尔生物科技有限公司。
商业菌株Pylopass（Limosilactobacillus reuteri DSM-17648）、Hp bio-73976、Hp bio-73975、Hp bio-73974：杭州宝赛生物科技有限公司；干酪乳酪杆菌Zhang、植物乳植杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室。
1.2 主要仪器和设备
pHS-3C 型pH 计：上海雷磁技术有限公司；CTCCA001 型三气培养箱：无锡菩禾生物医药技术有限公司；SRH 60-70 型均质机：上海申鹿均质机有限公司；HWS28 型恒温水浴锅：上海智城分析仪器有限公司；NanoDrop One 微量紫外分光光度计、Multiskan SkyHigh全波长酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；HA-300MII1 型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；CP2202C 型分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；Hitachi H-7650 型透射电子显微镜、Hitachi S-3700N型扫描电子显微镜：苏州赛恩斯仪器有限公司；LEICA EM UC7 型超薄切片机：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司。
1.3 方法
1.3.1 后生元Probio-Eco 制备
将大豆粉、脱脂乳和柠檬酸钠与水充分混合15 min，并预热至55～60 ℃。在18～20 MPa 下均质后于95 ℃杀菌60 min。冷却至35 ℃后分别接种3 种益生菌（干酪乳酪杆菌Zhang、植物乳植杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9），恒温（35 ℃）搅拌发酵，pH 值至4.50～4.60时终止发酵过程。然后加入麦芽糊精，并将发酵液在75 ℃灭菌15 min，随后进行无菌均质（25～30 MPa）。以进风温度210 ℃、出风温度88 ℃的条件对发酵液进行喷雾干燥后得到后生元Probio-Eco，经检测符合关于污染物、真菌毒素以及微生物的限量标准。
1.3.2 Probio-Eco 对Hp 抑制作用的测定方法
利用牛津杯进行抑菌试验，使用浓度为8.5 g/L 的氯化钠溶液将制备好的Probio-Eco 稀释至菌体数（死菌）为1×108 CFU/g，得到Probio-Eco 稀释液；将商业菌株Pylopass 稀释至菌体数为1×108 CFU/g。试验分为阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、试验组和Pylopass 组，其中，阳性对照组使用甲硝唑溶液（0.025%），阴性对照组使用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS），空白对照组使用氯化钠溶液（8.5 g/L），试验组使用Probio-Eco 稀释液，Pylopass 组使用Pylopass 稀释液。将灭菌后的素琼脂（含15 g/L 琼脂的无菌水）倒入一次性平板，静置30 min 等待凝固，将灭菌的牛津杯放置在该平板上，将Hp bio-73976 的菌液按照1%的接种量接种于15 mL 含7%无菌绵羊血的哥伦比亚培养基中，混匀后倒入有牛津杯的平板，使混合物均匀覆盖平板表面且无气泡，静置30 min 等待凝固后用镊子将牛津杯取出，分别吸取100 μL 甲硝唑溶液、PBS 缓冲液、氯化钠溶液、Probio-Eco 稀释液和Pylopass 稀释液添加至牛津杯造成的圆孔中，将平板放置于三气培养箱中37 ℃静置培养48 h 和72 h，测量抑菌圈直径（mm）[9]。
1.3.3 Probio-Eco 降低Hp 对胃上皮细胞AGS 黏附率的测定方法
按照1.3.2 制备Probio-Eco 稀释液和Pylopass 稀释液；将Hp bio-73976、Hp bio-73975 和Hp bio-73974分别用PBS 缓冲液稀释至细胞浓度为1.5×107 CFU/mL制成菌悬液；将对数生长期的胃上皮细胞AGS 用PBS稀释至细胞浓度为5×105 个/mL，以每孔0.5 mL 接种至24 孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育24 h 后，吸弃上清液，将RPMI 1640 培养液以每孔0.5 mL 接种至24 孔细胞培养板中，随机分为空白对照组、模型组、试验组和Pylopass 组。空白对照组和模型组的孔中加入50 μL PBS，试验组和Pylopass 组的孔中分别加入50 μL Probio-Eco 稀释液和Pylopass 稀释液后，置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育2 h；孵育结束后，在空白对照组中加入PBS，模型组、试验组和Pylopass 组的孔中加入50 μL 的Hp bio-73976、Hp bio-73975 和Hp bio-73974 菌悬液，置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育2 h；孵育结束后，使用PBS 缓冲液将每孔洗涤3 次去除未黏附的Hp，随后在4 组的孔中加入500 μL 脲酶试剂（含110 mmol/L 尿素和10 mg/L 酚红的7 mmol/L、pH6.8 的PBS），置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育1 h。最后使用酶标仪测定4 组的孔在560 nm 波长处的吸光度（OD 值），黏附率（m，%）的计算公式如下[10]。
式中：Dn 为试验组的OD560 值；D0 为空白对照组的OD560 值；Dy 为模型组的OD560 值。
1.3.4 Probio-Eco 对Hp 黏附胃上皮细胞AGS 分泌炎症因子IL-8 的影响
按1.3.3 方法制备包含50 μL PBS 缓冲液、Hp bio-73976、Hp bio-73975 和Hp bio-73974 的空白对照组、模型组、试验组和Pylopass 组的24 孔培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育24 h。孵育结束后，收集4 组的细胞上清液，用ELISA 试剂盒检测IL-8 的分泌[11]。
1.3.5 Probio-Eco 与Hp 交互凝集能力的测试方法
Probio-Eco 和Hp 制备菌悬液，用酶标仪调节OD600 为0.50±0.05 后，取等量的Probio-Eco 和Hp 菌悬液混合于灭菌的1.5 mL 离心管中，振荡5 min，室温静置培养，分别在静置1、2、3、4、5、6、24 h 和48 h 后吸取上层液体，测试600 nm 处的吸光度，计算交互凝集率（y，%），公式如下[12]。
式中：Ax 为交互凝集前Probio-Eco 的OD600 值；Ay为交互凝集前Hp 的OD600 值；Amin 为静置t h 后混合菌液的OD600 值。
1.3.6 后生元对Hp 超微结构的影响测试方法
将样品置于2.5% 的戊二醛溶液中，4 ℃固定过夜；倒掉固定液，用0.1 mol/L pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品3 次，每次15 min；用1% 的锇酸溶液固定样品1～2 h，小心取出锇酸废液，用0.1 mol/L pH7.0 的磷酸缓冲液漂洗样品3 次，每次15 min[13]。用梯度浓度（30%、50%、70%、80%、90% 和95%）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min；再用无水乙醇处理20 min 后，将样品放置于新的无水乙醇里，结束前处理。临界点干燥后镀膜，用扫描电子显微镜观察。
将样品固定后用梯度浓度（30%、50%、70% 和80%）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再过渡到90% 和95% 的丙酮溶液中，分别处理15 min。最后用纯丙酮处理2 次，每次20 min[14]；用Spurr 包埋剂与丙酮的混合液（体积比为1∶1）处理样品1 h；用Spurr 包埋剂与丙酮的混合液（体积比为3∶1）处理样品3 h；室温下，纯包埋剂处理样品过夜。最后将处理过的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品；样品在超薄切片机中切片，获得70～90 nm 的切片；切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5～10 min，在透射电子显微镜中观察。
1.4 数据处理
数据经过Excel 整理，SPSS22.0 进行数据分析，最后通过Origin Lab 2024 作图。
2 结果与分析
2.1 Probio-Eco 对Hp 的抑制作用结果
Probio-Eco 对Hp 的抑制作用结果见表1。
表1 Probio-Eco 对Hp 生长情况的影响
Table 1 Effect of Probio-Eco on growth of Hp
组别试验组阳性对照组阴性对照组空白对照组Pylopass 组抑菌圈直径/mm 48 h 16.53±3.55 10.35±2.46 72 h 18.41±3.12 13.49±2.36 0 0 0 0 13.46±1.93 15.23±1.38
如表1 所示，培养48 h 时，Probio-Eco 对Hp 的抑菌圈直径达（16.53±3.55）mm；培养72 h 时，抑菌圈直径可达（18.41±3.12）mm，且抑制效果优于阳性对照组和Pylopass 组，阴性对照组和空白对照组中未出现抑菌圈，说明对Hp 无抑制作用。
2.2 Probio-Eco 降低Hp 对胃上皮细胞AGS 黏附率的结果
Probio-Eco 降低Hp 对胃上皮细胞AGS 黏附率的结果见图1。
图1 Probio-Eco 降低Hp 对胃上皮细胞AGS 黏附率的影响
Fig.1 Effect of Probio-Eco in reducing Hp adhesion on human gastric adenocarcinoma cell AGS
*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
如图1 所示，与模型组相比，试验组的Probio-Eco能够有效抑制Hp 对胃上皮细胞AGS 的黏附[Hp bio-73976、Hp bio-73975 和Hp bio-73974 的黏附率分别为（70.25±2.25）%、（64.22±3.12）%、（63.97±2.35）%]，与模型组相比，均差异显著（P＜0.05）；Pylopass 组也能够抑制Hp 对胃上皮细胞AGS 的黏附[Hp bio-73976、Hp bio-73975 和Hp bio-73974 的黏附率分别为（74.54±1.89）%、（79.92±3.65）%、（72.13±2.19）%]，但是抑制Hp 黏附胃上皮细胞AGS 的效果不如试验组的Probio-Eco。
2.3 Probio-Eco 对Hp 黏附胃上皮细胞AGS 分泌炎症因子IL-8 的影响结果
Probio-Eco 对Hp 黏附胃上皮细胞AGS 分泌炎症因子IL-8 的影响结果见图2。
图2 Probio-Eco 对炎症因子IL-8 分泌量的影响
Fig.2 Effect of Probio-Eco on secretion volume of inflammatory factor IL-8
**表示差异极显著（P＜0.01）。
如图2 所示，与空白对照组相比，模型组的炎症因子分泌量[Hp bio-73976、Hp bio-73975、Hp bio-73974分别为（964.34±17.35）、（916.35±20.54）、（978.25±17.36）pg/mL]明显增加，表明对本试验的Hp 刺激有效；与模型组相比，试验组的Probio-Eco 能显著抑制Hp 诱导AGS 分泌的IL-8 炎症因子[Hp bio-73976、Hp bio-73975、Hp bio-73974 分别为（649.23±21.34）、（629.75±19.35）、（660.32±18.43）pg/mL]，与模型组比较均差异极显著（P＜0.01）；Pylopass 组也能抑制Hp 诱导AGS 分泌IL-8 炎症因子[Hp bio-73976、Hp bio-73975、Hp bio-73974 分别为（685.73±18.74）、（632.46±22.45）、（690.93±19.46）pg/mL]，但是抑制效果弱于试验组的后生元。
2.4 Probio-Eco 与Hp 交互凝集能力测定结果
Probio-Eco 与Hp 交互凝集能力测定结果见表2。
表2 Probio-Eco 与Hp 的交互凝集率
Table 2 Interagglutination rate between Probio-Eco and Hp %
1 h 75.27±2.06 2 h 81.63±2.87 3 h 83.79±3.12 4 h 84.74±3.33 5 h 87.16±2.61 6 h 86.90±3.21 24 h 91.74±3.99 48 h 91.99±4.02
交互凝集能力是指细胞之间的黏附作用，通过对幽门螺杆菌的黏附，可以干预Hp 在宿主体内菌落的形成，有利于清除Hp，对宿主胃肠道的保护有重要意义[12]。由表2 可知，随静置时间延长，Probio-Eco 与Hp的交互凝集力逐渐增强。静置24 h 后，Probio-Eco 交互凝集率达到90.0% 以上。综上，Probio-Eco 具有较稳定的清除Hp 能力，将Probio-Eco 用于后续评价。
2.5 Probio-Eco 对Hp 超微结构的影响
2.5.1 扫描电子显微镜观察结果
经电子显微镜观察样品后的结果见图3。
图3 Probio-Eco 与Hp 扫描电子显微镜图
Fig.3 Scanning electron microscope image of Probio-Eco and Hp
a.Hp；b.Probio-Eco；c.Probio-Eco 处理Hp 4 h 后。
由图3 可以看出，未与Probio-Eco 共培养的Hp，菌体呈弯曲杆状，形态完好，形状饱满；用Probio-Eco处理Hp 4 h 后，可以明显看出Hp 细胞内物质出现了泄漏，出现凹陷、破裂等明显形态结构变化，破碎的细胞和流出的细胞质聚集在一起。说明Probio-Eco 可以作用于Hp 菌体，对其具有破坏作用，进而起到抑制作用。
2.5.2 透射电子显微镜观察结果
经透射电镜观察样品后的结果见图4。
图4 Probio-Eco 与Hp 透射电子显微镜图
Fig.4 Transmission electron microscope image of Probio-Eco and Hp
a.Hp；b.Probio-Eco；c.Probio-Eco 处理Hp 4 h 后。
由图4 可以看出，未与Probio-Eco 共培养的Hp，菌体排列整齐呈现椭圆扁平状，未见明显内容物泄漏；Probio-Eco 处理Hp 4 h 后，菌体染色加深，Hp 出现菌体破裂、塌陷、变形等现象，细菌正常形态受到破坏，造成内容物的流失。说明Probio-Eco 对Hp 菌体具有破坏作用，可对其进行抑制。
3 讨论
Hp 感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素[15]。1994 年世界卫生组织/国际癌症研究机构将Hp 定为Ⅰ类致癌原。在2012 年，世界卫生组织国际癌症研究机构已将Hp 列为一类致癌物，认为78% 的胃癌可归因于其造成的慢性感染[16]。除了胃癌，Hp 还能引起多种胃病。随抗生素耐药性的增加导致根治率下降，被世界卫生组织列入研发新抗生素的优先病原体名单[17]。Hp 感染率在非洲、拉丁美洲和西亚地区相对较高[18]。由此可知，Hp 是全球性的健康难题。本研究探究了Probio-Eco 对Hp 的抑制和清除作用，以及对Hp 黏附胃上皮细胞AGS 和抑制Hp 诱导胃上皮细胞AGS 产生炎症因子IL-8 的影响。发现Probio-Eco 能够有效抑制Hp的生长及降低Hp 对胃上皮细胞AGS 的黏附率；还可抑制Hp 诱导胃上皮细胞AGS 产生炎症因子IL-8，并对Hp 菌体有破坏作用，在预防或治疗Hp 感染及由Hp 感染引起的相关疾病中极具应用前景。
本研究发现，Probio-Eco 对Hp 的抑菌作用效果明显，远优于阳性对照组使用的甲硝唑。相关研究显示，单独使用后生元Postbiocare®针对Hp 的抑菌圈直径能达到20 mm，是市面常见抗Hp 产品的2 倍[19-20]。以上结论与本研究结果相符合。OneHealth 研发团队在自有菌株库中筛选了700 株罗伊氏粘液乳杆菌，发现了能与Hp 实现特异性结合的菌株Pylopass™，即罗伊氏粘液乳杆菌DSMZ17648 [21-24]。郭怡麟[25]从非特异性及特异性黏附角度探究ZDY2013 和WBIN03 拮抗Hp 对人胃腺癌细胞（AGS 细胞系）黏附率与相关细胞因子的相对表达水平的影响。Dajani 等[26]研究表明NCUH062005 能抑制Hp 诱导GES-1 细胞分泌促炎因子（IL-8）。四联疗法联合益生菌用于Hp 感染患者中能降低炎症介质水平，且药物安全性较高[27]。另有研究表明，Hp 以多种不同的方式黏附于胃上皮细胞。高浓度的Hp 可使体外培养的胃上皮细胞发生明显病变：微绒毛丢失与胞浆内出现空泡样变等。反之，胃上皮细胞也可作用于Hp，除了使其发生球形变和空泡样变外，还可将它吞噬降解，且共同孵育时间越长，作用越明显[28]。有研究表明，益生菌对Hp 黏附GES-1 细胞的抑制能力：嗜酸乳杆菌＞保加利亚乳杆菌＞婴儿双歧杆菌＞长双歧杆菌＞唾液乳杆菌[29]。以上研究均表明益生菌对Hp 具有抑制作用且效果显著。目前，针对后生元抑制Hp 研究较少。杨成海[7]研究了灭活L.reuteri DSM17648 对Hp 的抑制作用：疏水率为（89.32±2.76）%，对胃黏膜上皮细胞及小肠黏膜上皮细胞黏附率分别为（36.16±2.97）%和（31.32±1.84）%，交互凝集能力在6 h 时达到最高的93.78%，24 h 时为91.21%；与Hp 共聚结合率在24 h 时达到最高的79.91%。
4 结论
本文探究后生元Probio-Eco 对Hp 的抑菌和清除作用，降低Hp 对胃上皮细胞AGS 的黏附率和抑制Hp诱导胃上皮细胞AGS 产生炎症因子IL-8 的影响。结果表明Probio-Eco 能够显著抑制Hp 的生长及Hp 对胃上皮细胞的黏附率，还能够有效清除和破坏宿主体内定植的Hp，在预防和/或治疗Hp 感染及由Hp 感染引起的相关疾病中极具应用前景。
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