阿魏酸（ferulic acid，FA），又名4-羟基-3-甲氧基肉桂酸[1]，是由阿魏酸酯酶（ferulic acid esterases，FAE）水解酯键产生的酚酸类物质，可通过微生物转化为高附加值芳香化合物[2-3]，常以游离态形式存在于植物中，与木质素和细胞壁中的其他聚合物共价连接[4-5]。阿魏酸在人体内易于吸收和代谢，具有抗氧化、抗菌、抗炎症、抗癌等多种生理功能[6-9]，因此被广泛应用于食品和药品行业[10-11]。目前，较为常见的制取阿魏酸的方法有3 种，微生物发酵法、化学合成法以及自然植物提取法[12]，此外，基于合成生物学实现对污染物的高效降解或转化，微生物合成代谢阿魏酸受到广泛关注[13]。
浓香型白酒凭借其独特的风味和文化属性，深受广大消费者青睐，而阿魏酸及其衍生物（香草醛、4-乙烯基愈创木酚和阿魏酸酯等）作为浓香型白酒中的功能因子，也对酒体风味发挥着特定的作用[14]。研究发现浓香型白酒酿造过程中，大曲中的阿魏酸含量最高[15]，但随着发酵进行，其在糟醅、酒体中含量呈现逐步衰减趋势[16]。因此，探索浓香型白酒中阿魏酸形成，对于大曲微生物的研究是关键。
浓香型白酒大曲主要原料为小麦[17]，是经开放式固态发酵，富集多种微生物后形成的多酶混合体系[18]。研究大曲中产阿魏酸酯酶微生物，对浓香型白酒的风味及功能特性调控具有重要意义[19]。同时，由于阿魏酸酯酶具有水解纤维素交联结构/释放游离阿魏酸的功能[20]，将对丢糟、秸秆等农林副产物的资源化利用产生极大价值[21]。目前，关于阿魏酸酯酶菌株的筛选及发酵优化的研究以土壤为自然样本居多[22-23]，对白酒酿造过程中大曲、糟醅和窖泥等阿魏酸代谢微生物研究相对较少[24-25]。
本文从浓香型白酒大曲中分离得到一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌（Pseudomonas），通过单因素试验与响应面设计试验得到优化的发酵培养基条件，并对该培养基条件下的假单胞菌产酶活力进行测定。该菌株属于目前浓香型白酒酿造过程中发酵优化后产阿魏酸酯酶酶活力最高的菌株[24-25]，以期为假单胞菌在白酒酿造工艺及其他食品发酵中的应用研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与培养基
大曲：宜宾某酒厂；小麦麸皮：市售；蛋白胨、酵母提取物：奥博星（北京）生物有限公司；氯化钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、可溶性淀粉、硫酸镁、蔗糖、硝酸钠、尿素、葡萄糖（均为分析纯）：科隆化学品（成都）有限公司；磷酸、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）]（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；N，N-二甲基甲酰胺、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯（均为分析纯）：阿拉丁（上海）生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱（1260 Infinity Ⅱ）：安捷伦（中国）科技有限公司；可见分光光度计（V-1000）：翱艺仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（TGL-25）：蜀科（成都）科技责任有限公司；pH 测定仪（pHS-3Cb）：越平科技（上海）有限责任公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（TC-96/G/H（b）C）：博日科技（杭州）责任有限公司；电泳仪（DYY-6D）：六一生物（北京）责任有限公司。
1.3 方法
1.3.1 高产阿魏酸酯酶菌株的筛选
1.3.1.1 培养基的制备
LB 培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、pH7.0、琼脂20.0 g/L。
筛选培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、琼脂20.0 g/L、pH7.0；冷却至70 ℃左右添加1.5% 的阿魏酸乙酯与N，N-二甲基甲酰胺混合溶液（0.1 g/mL）。
种子培养基：硝酸纳2.0 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L。
发酵培养基：麦麸10.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、KCl 0.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、K2HPO4 0.10 g/L。
1.3.1.2 菌株筛选及鉴定
1）初筛：将取自酒厂的大曲粉碎后称取10.0 g 加入LB 培养基培养22 h。将富集的菌液摇匀，加入无菌水进行梯度稀释。取10-3、10-4、10-5 3 个梯度各0.2 mL涂布于LB 培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养至平板上有单菌落长出，观察平板上的菌落情况。
2）复筛：将分离后的单菌落挑选至以阿魏酸乙酯为碳源的筛选培养基上，挑取有透明圈的单菌落在筛选培养基上划线并放于30 ℃培养1～3 d。
将具有阿魏酸酯酶活性的菌株接种于种子培养基中培养22 h，再以4% 接种量接种至发酵培养基，于30 ℃，180 r/min 条件下培养72 h，发酵结束后，在4 ℃下12 000 r/min 离心10 min，取上清液，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatograph，HPLC）法测定发酵液中的阿魏酸含量。
1.3.2 菌株生长曲线的绘制
将筛选出来的目标菌株在平板上划线活化，挑取生长良好的单菌落接种于装有100 mL 液体LB 培养基中，置于180 r/min、30 ℃摇床培养，每隔2 h 取种子液测定OD600 nm 值，作种子液生长曲线，设置3 个平行试验。
1.3.3 菌株耐受性
1）菌株对酒精度的耐受性：对目的菌株进行活化，将4%种子液接种于酒精度为1、2、3、4、5、6%vol 的液体LB 培养基中，30 ℃、180 r/min 振荡培养24 h，测定OD600 nm，每组平行3 次试验。
2）菌株对温度的耐受性：对目的菌株进行活化，将4% 种子液接种于温度为30、35、40、45、50、55、60、65 ℃的液体LB 培养基中，180 r/min 振荡培养24 h，测定OD600 nm 值，每组平行3 次试验。
1.3.4 菌株生理生化形态鉴定
1）形态学鉴定：将筛选得到的菌株在LB 固体培养基上涂布，观察形态特征，进行革兰氏染色以及扫描电镜分析。
2）生理生化特征：具体方法见参照《伯杰细菌鉴定手册》[26]及《常见细菌系统鉴定手册》[27]。
3）分子生物学鉴定：以基因组DNA 为模板，采用设计通用引物16S-R，16S-F，扩增16S rRNA 基因。PCR 产物送至成都擎科生物有限公司测序后，将测序结果在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上进行同源性比对，利用MEGA7.0.26 软件基于近邻相接法（Neighbor-Joining）最终构建系统发育树。
1.4 高产阿魏酸酯酶菌株发酵条件优化
1.4.1 单因素试验和最陡爬坡试验
1）单因素试验：采用1.3.1 中复筛发酵条件，将初始pH 值设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，探究pH 值对发酵酶活力的影响；将发酵温度设置为24、27、30、33、37、40 ℃，探究温度对发酵酶活力的影响；以10 g/L蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木聚糖、可溶性淀粉分别作为唯一碳源，探究不同碳源对发酵酶活力的影响；以10 g/L 蛋白胨、酵母提取物、尿素、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、大豆作为唯一氮源，探究不同氮源对发酵酶活力的影响；以5 g/L 小麦麸皮、粉碎的麦麸、去淀粉小麦麸皮、玉米粉作为诱导物，探究不同诱导物对发酵酶活力的影响。
2）最陡爬坡试验：分别将葡萄糖浓度设置为10、20、30、40、50 g/L、酵母提取物添加量为30、40、50、60、70 g/L，粉碎的麦麸添加量为10、20、30、40 g/L，来研究不同浓度碳源、氮源和诱导物对发酵产酶的影响。
1.4.2 响应面试验设计
采用软件Design Expert 8.0.6 进行Box-Behnken Design 设计响应面试验，根据爬坡试验结果，对葡萄糖浓度、酵母提取物添加量和粉碎的麦麸添加量作为变量，以酶活力为响应值，进行三因素三水平响应面试验设计，设计方案见表1。
表1 响应面因素水平
Table 1 Factor level coding in response surface design
因素水平-1 0 1 A 葡萄糖浓度/（g/L）20 30 40 B 酵母提取物添加量/（g/L）40 50 60 C 粉碎的麦麸添加量/（g/L）20 30 40
1.5 指标检测方法
1.5.1 阿魏酸酯酶酶活力测定
粗酶液的制备：取发酵结束后的发酵液1 mL 在10 000 r/min 离心15 min，取出上清液作为粗酶液。
酶反应试验：取0.25 mL 粗酶液加入0.75 mL0.004 mol/L 的阿魏酸甲酯溶液（溶解于0.05 mol/L Tris-HCl 溶液）。随后放入50 ℃恒温水浴锅中反应15 min，反应结束后立即放入沸水浴中灭活10 min，终止酶反应，于12 000 r/min 离心10 min，经0.22 μm 滤膜过滤后进行HPLC 检测分析。并用等量的Tris-HCl 缓冲液替换粗酶液作为空白组。
酶活力定义：在30 ℃、pH 自然条件下，水解阿魏酸甲酯每分钟生成1 μmol 阿魏酸所需的酶量为1 个酶活力单位（1 U）。
1.5.2 高效液相色谱条件
色谱条件：C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），紫外检测器，检测波长323 nm，柱温30 ℃，流速为1.000 mL/min，进样量5 μL，流动相为0.1% 磷酸溶液（A 相）、甲醇（B 相），流动相A∶流动相B=34∶66（体积比）。
1.6 数据处理
响应面试验采用Design-Expert 8.0.6 进行数据处理分析。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选结果
从大曲样本中初筛获得54 株菌，其中共5 株产生透明圈具体见图1，并分别命名为A4、A5、D7、W10、W11，这5 株菌产阿魏酸酯酶的酶活力结果见图2。
图1 初筛菌株
Fig.1 Primary screening of strains
图2 菌株产阿魏酸酯酶酶活力
Fig.2 Ferulic acid esterase activities of different strains
由图2 可知，W10 号菌株酶活力较高，将其命名为Aw10，在后续试验中均以Aw10 作为出发菌株。
2.2 菌株生长曲线
对Aw10 进行生长曲线的测定，每隔2 h 测定OD600 nm 值，结果见图3。
图3 菌株生长曲线
Fig.3 Strain growth curve
由图3 可知，菌株在0～6 h 为生长延滞期，菌群总数增长缓慢；6～18 h 为对数生长期，菌群总数呈几何级数快速升高；18～24 h 处于稳定生长期，菌群总数保持稳定；24 h 后开始进入衰亡期。
2.3 菌株酒精度耐受性试验
对Aw10 进行酒精度耐受性试验，测定不同酒精浓度下OD600 nm 值，结果见图4。
图4 酒精度耐受性试验
Fig.4 Alcohol tolerance
由图4 可知，随着酒精度的增加，菌株OD600 nm 逐渐降低，说明菌株生长情况逐渐变差，当酒精度达到6%vol 时OD600 nm 趋于0，可知该菌株的酒精度最大酒精度耐受性为6%vol。
2.4 菌株温度耐受性试验
对Aw10 进行温度耐受性试验，测定不同温度下OD600 nm 值，结果见图5。
图5 温度耐受性试验
Fig.5 Thermal tolerance
由图5 可知，菌株Aw10 随着温度的升高菌株生长能力呈现先增强后减弱的趋势，在30～55 ℃时菌株正常生长，并且在30～45 ℃时生长迅速，刘延波等[28]从张弓老酒的高温大曲中分离出一株能在最高温度45 ℃下生长的酵母菌，具有耐高温特性，董琪等[29]从浓香型大曲分离的菌株中NDY-06 性能最突出，可耐受42 ℃高温，研究结果说明Aw10 能够在中高温条件下正常生长，具有较好的耐高温特性。
2.5 菌株形态学鉴定
对Aw10 进行菌株形态学鉴定，结果见图6。
图6 菌落形态
Fig.6 Colony morphology
a.Aw10 透明圈；b.革兰氏染色结果；c.扫描电镜结果。
由图6 可知，菌株Aw10 在复筛培养基中培养24 h后，经过菌落形态观察发现，菌落表面湿润隆起、边缘不整齐，形状较规则，黏稠度较低，容易被挑起，菌落不透明。革兰氏染色为阴性，细胞形态呈杆状，与扫描电镜结果一致。
2.5.1 生理生化特征
对Aw10 进行生理生化特征试验，结果见表2、表3。
表2 菌株Aw10 生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Aw10
注：+表示反应结果为阳性；-表示反应结果为阴性。
检测项目甲基红试验吲哚试验VP 试验淀粉水解试验过氧化氢酶试验结果-+--+
表3 菌株Aw10 糖的利用情况
Table 3 Sugar utilization of strain Aw10
注：+表示反应结果为产酸不产气；-表示反应结果为不产酸产气。
检测项目葡萄糖蔗糖山梨醇D-阿拉伯糖乳糖纤维素二糖木糖醇结果+++---+
由表2、表3 可知，Aw10 的吲哚试验和过氧化氢酶试验为阳性，甲基红试验、VP 试验和淀粉水解试验为阴性；该菌可以利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇和木糖醇产酸不产气，不能利用D-阿拉伯糖、乳糖和纤维素二糖产酸不产气。
2.5.2 分子生物学鉴定
对Aw10 进行分子生物学鉴定，结果见图7。
图7 菌株Aw10 系统发育树
Fig.7 Phylogenetic tree of strain Aw10
由图7 可知，以细菌16S rDNA 基因扩增的通用引物为上下游引物扩增16S rDNA，扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证。将测序的结果序列利用SanpGene完成拼接，并利用NCBI 数据库进行序列比对可知，菌株Aw10 与多种假单胞菌菌株同源性可达99%以上，并利用MEGA 7.0.26 软件构建系统发育树，经过分析基本确定所筛选的菌株为假单胞菌（Pseudomonas）。
2.6 阿魏酸的测定
对Aw10 发酵液用HPLC测定阿魏酸及阿魏酸标准品，结果见图8。
图8 阿魏酸及其标准品高效液相色谱图
Fig.8 High performance liquid chromatogram of ferulic acid and its standards
a.粗酶液；b.FA 标准品。
由图8a 可知，Aw10 发酵液离心后的上清液中阿魏酸出峰时间在14.12 min；由图8b 可知，阿魏酸标准品出峰时间在14.35 min，结合HPLC 结果可知Aw10发酵液中含有阿魏酸酯酶，并且能够代谢阿魏酸甲酯生成阿魏酸。
2.7 单因素试验及发酵条件优化
2.7.1 初始pH 值和发酵温度对发酵产酶活力的影响
初始pH 值和发酵温度对产酶活力的影响见图9。
图9 初始pH 值和发酵温度对产酶活力的影响
Fig.9 Effects of initial pH and fermentation temperature on enzyme production
由图9 可知，菌株Aw10 在pH 值为4.0～6.0 时酶活力迅速升高，pH 值达到6.0 以后迅速降低，可知最适pH 值为6.0；发酵温度在24～30 ℃，酶活力逐渐增大，而后随着温度的升高，酶活力逐渐降低，可知最适发酵温度为30 ℃。
2.7.2 不同碳源、氮源和诱导物对发酵产酶活力的影响
对Aw10 进行不同碳源、氮源和诱导物的单因素试验，结果见图10。
图10 碳源、氮源和诱导物对酶活力影响
Fig.10 Effects of carbon source，nitrogen source，and inducer on enzyme production
由图10 可知，葡萄糖作为唯一碳源时酶活力达到最高值，其次是果糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖，可溶性淀粉与木聚糖酶活力较低；不同的氮源中，酵母提取物的产酶活力效果最好，其次是蛋白胨、大豆和尿素，硝酸钠与硝酸铵效果较差；由于阿魏酸酯酶是一种诱导酶，小麦麸皮含有阿魏酸酯键可以诱导产生阿魏酸酯酶，从而可以提高酶活力，在不同的诱导物中，粉碎的麦麸的酶活力效果较好，其次是去淀粉小麦麸皮与小麦麸皮，采用玉米粉时效果较差。
2.8 最陡爬坡试验结果
对Aw10 单因素试验中的酶活力效果最好的碳源、氮源和诱导物进行爬坡试验，结果见图11。
图11 爬坡试验
Fig.11 Results obtained with path of steepest ascent method
由图11 可知，当葡萄糖浓度在10～30 g/L 时，酶活力呈现明显上升趋势，当葡萄糖浓度为30～50 g/L 时，酶活力呈现下降趋势，说明葡萄糖浓度30 g/L 时酶活力效果最好；当酵母提取物添加量在30～50 g/L 时，酶活力呈现上升趋势，当酵母提取物添加量在50～70 g/L 时，酶活力呈现下降趋势，说明酵母提取物添加量50 g/L 时酶活力效果最好；当粉碎的麦麸添加量在10～30 g/L时，酶活力呈上升趋势，当粉碎的麦麸添加量在30～40 g/L 时，酶活力开始下降，说明粉碎的麦麸添加量30 g/L 时酶活力效果最好。
2.9 响应面试验设计及验证试验
根据爬坡试验结果，对葡萄糖浓度、酵母提取物添加量和粉碎的麦麸添加量做三因素三水平共17 个试验的响应面分析试验，设计方案及酶活力结果见表4，回归模型方差分析见表5。
表4 响应面试验结果分析
Table 4 Results of response surface test
编号因素A 葡萄糖浓度B 酵母提取物添加量C 粉碎的麦麸添加量123456 00101-1 010-01-100 1111 Y 酶活力/（U/L）84.3 66.4 64.9 55.1 69.5 66.8
续表4 响应面试验结果分析
Continue table 4 Results of response surface test
因素编号B 酵母提取物添加量C 粉碎的麦麸添加量7891 0 A 葡萄糖浓度0-1 000-11 12 13 14 15 16 17 100010-1 01110-1 10--1 100--1 0 11-11 100 Y 酶活力/（U/L）70.3 60.6 59.3 59.5 76.8 54.8 57.8 80.1 62.5 55.9 72.5
表5 回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance of the regression model
注：**表示影响极显著（p＜0.01）。
方差来源模型自由度ABCA B AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差平方和1 123.20 4.06 61.61 32.40 2.56 0.022 10.89 137.40 677.78 112.22 142.78 14.90 127.88 9111111111734均方124.80 4.06 61.61 32.40 2.56 0.022 10.89 137.40 677.78 112.22 20.40 4.97 31.97 F 值6.12 0.20 3.02 1.59 0.13 0.25 0.53 6.74 33.23 5.50 p 值＜0.000 1**0.668 9 0.125 8 0.247 9 0.087 3 0.157 3 0.488 7＜0.000 1**＜0.000 1**0.000 3**0.16 0.084 5
经多元二次回归拟合后，建立阿魏酸酯酶发酵条件优化模型，回归方程为：Y=78.60+0.71A+2.78B+2.01C-0.80AB+0.075AC+1.65BC-6.61A2-13.59B2-6.06C2。
通过对回归方程模型的分析，菌株Aw10 产FAE 最优条件为葡萄糖浓度30 g/L、酵母提取物添加量60 g/L、粉碎的麦麸添加量30 g/L，此时FAE 酶活力预测值为76.8 U/L。在此条件下，重复3 次发酵试验，得到FAE酶活力为73.5 U/L，该结果与预测值接近，证明试验得到的模型可以较好地预测菌株Aw10 发酵后FAE 酶活力。
由表5 可知，模型p＜0.01，达到极显著水平，说明模型的预测值与实际值非常吻合。失拟项p=0.084 5＞0.05，失拟项不显著，证明模型与试验拟合程度较好，具有统计学意义[30]。模型中一次项A、B、C 对酶活力的影响极显著，一次项影响因子的主次顺序为酵母提取物＞粉碎的麦麸＞葡萄糖。
葡萄糖浓度、酵母提取物添加量和粉碎的麦麸添加量3 个因素在发酵过程中相互作用见图12。
图12 因素间交互作用对发酵产酶的影响
Fig.12 Effects of interactions between independent variables on the yield of ferulic acid esterase
由图12 可知，响应面图中曲面的坡度直接反映各交互因素对酶活的影响程度，坡度较为平缓代表该交互因素对结果影响程度较小，而坡度陡峭则说明影响程度较大。酵母提取物添加量、葡萄糖浓度和粉碎的麦麸添加量交互作用的响应曲面坡度均较为陡峭且等高线密集，呈椭圆形，表明交互作用显著；葡萄糖浓度和酵母提取物添加量交互作用的响应曲面坡度均较为平缓，等高线稀疏，接近圆形，表明交互作用不显著，可知3 个因素两两之间相互影响的主次关系为BC＞AB＞AC。
3 结论
本研究从浓香型大曲中分离一株具有耐高温特性的假单胞菌（Pseudomonas），在单因素试验基础上，通过响应面试验设计，对该菌株进行液态发酵培养基优化，结果表明最佳优化培养基配方：葡萄糖浓度30 g/L、酵母提取物添加量60 g/L、粉碎的麦麸添加量30 g/L、KCl 0.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、K2HPO4 0.10 g/L，pH6.0。在此优化培养基条件下该菌株摇瓶发酵的最大酶活力可达73.5 U/L 相比优化前得到的酶活力（25.5 U/L），提升约3 倍。本研究不仅为以后高产阿魏酸酯酶基因工程菌的构建提供了出发菌株，而且为研究浓香型白酒酿造中阿魏酸生成机制做了铺垫；同时还可以将改良菌株用于酿酒生产时废料二次处理，有利于环保。
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