曲酸（kojic acid，KA）化学名为5-羟基-2-羟甲基-1，4-吡喃酮，纯品为无色柱状晶体，是一种具有还原性的有机弱酸，与三价铁离子反应呈特殊红色[1]。其可作为一种强抗氧化剂，抑制酪氨酸酶的活性，消除色素沉着，根据这一特性，KA 被广泛应用于化妆品、农业、食品等行业[2-4]。此外，KA 及其衍生物还可作为杀菌剂广泛应用于医药领域[5]。天然曲酸是由微生物如黄曲霉、米曲霉等好氧发酵产生的一种次级代谢产物[6]。曲酸的市场需求量不断增加，20 世纪50 年代，通过14C 标记的同位素追踪，确定KA 的生物合成主要是由葡萄糖作为底物保留吡喃糖环结构的同时直接转化而来[7-8]。自1981 年研究者提出了3 种可能的KA 生物合成路线，有关曲酸合成途径的研究并未有新的突破[9]。因此，阐明KA 的生物合成途径，对提高其工业价值具有重要意义。
Terabayashi 等[10]首次在米曲霉中鉴定了两个参与曲酸生物合成的基因，分别为kojA 和kojT（分别包含黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的氧化还原酶和主要促进者超家族的基序）。随后的研究进一步确定了编码Zn（II）2Cys6 转录因子的kojR 基因（AO090113000137）在激活KA 生物合成基因kojA 和kojT 的转录中发挥关键作用，并且受到产物KA 的诱导[11]。kojA、kojR 和kojT 基因在曲霉基因组中形成了曲酸生物合成的基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）[12-13]。此外，目前已鉴定的一些基因，例如laeA、kpeA 和Aokap1 均直接或间接影响kojR 的表达，从而影响曲酸的合成[14-16]。这些有关KA 生物合成基因及其调控机制的研究将有助于提高KA 产量并进一步解释其合成机理。然而，次级代谢是一个十分复杂的过程，涉及多种酶、转录调控因子以及不同的生物合成反应[17]。随着基因测序技术的发展以及测序成本的降低，转录组测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）凭借高通量、高灵敏度、应用范围广等优势，已成为转录组研究的主要方法，且应用于丝状真菌的研究中，为明确基因功能及相关分子机制提供了非常有价值的信息[18]。然而，目前尚未有从转录水平分析曲酸生产机制的研究报道。
本研究以产曲酸的米曲霉3.042 为出发菌株，利用基因工程的手段过表达kojR 基因，获得曲酸高产菌株。基于RNA-Seq 技术对高产曲酸菌株T58 与菌株3.042 进行比较转录组分析，探究两者的基因转录差异，分析转录因子影响曲酸产量的可能机制，以期为研究丝状真菌米曲霉发酵生产曲酸提供一定的线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
米曲霉Aspergillusoryzae3.042（CGMCCNo.3.00951）：由天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究室保藏；A. oryzae T58（OEkojR）转化子：由天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究实验室构建。
1.1.2 培养基
斜面培养基：真菌完全生长培养基（complete medium，CM）（添加0.12%尿苷和0.12%尿嘧啶用于传代营养缺陷型）参照文献[19]配制；发酵培养基：9% 糊精、0.5%酵母粉、0.8%玉米芯粉、0.15% KH2PO4、0.08% MgSO4·7H2O。
1.1.3 主要试剂和仪器
无水葡萄糖、尿苷、尿嘧啶、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均为分析纯）：天津复科技术有限公司；糊精（分析纯）：河北润步生物科技有限公司；酵母粉（分析纯）：山东福旺嘉生物科技有限公司；100 目玉米芯粉（分析纯）：山东日照博源生化有限公司；30%过氧化氢（分析纯）：烟台健硕化工有限公司；Fungal RNA Kit 试剂盒：OMEGA 生物技术公司。
BS-1 型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；LRH-250A 生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；ZWYR-D2403 摇床：北京海天友诚科技有限公司；752 紫外-可见分光光度计：天津市华伟科技有限公司；Illumina HiSeqTM 2500 型测序仪：广州基迪奥生物有限公司
1.2 方法
1.2.1 孢子计数
分别将培养72 h 的米曲霉菌落，用同一取样器取3 个相同面积的菌落培养物，装入带有玻璃珠的无菌三角瓶内，加入一定量0.9% 生理盐水充分振荡30 min，经漏斗过滤后获得孢子悬液。稀释10 倍后，用血球计数板计算孢子浓度（W，个/mL）[20]，公式如下。
W=A/80×400×104×10
式中：A 为5 个中格中孢子数之和；80 为计数小格总数；400 为计数室所有方格总数；104 为大方格的体积0.1 mm3=0.1 μL；10 为稀释倍数。
1.2.2 转化子过氧化氢耐受性试验
取浓度为3.3×107个/mL 的米曲霉孢子悬液3 μL 点种至覆有直径6 mm 白色滤纸片的CM 培养基及分别添加10、15、20 mmol/L 过氧化氢的CM 培养基上，30 ℃培养72 h。观察菌株在过氧化氢胁迫下的生长特性。
1.2.3 摇瓶曲酸发酵
将米曲霉接种于CM 斜面培养基上，30 ℃下培养6 d 得到新鲜孢子，用无菌水洗涤获得孢子悬液，计数后按1×104 个/mL 浓度接种至60 mL 液体发酵培养基中，摇瓶发酵温度为33 ℃，转速250 r/min，发酵7 d。取发酵液上清液利用硫酸铁显色法测定曲酸产量[1]。
1.2.4 RNA 样品的制备
取发酵3 d 的米曲霉菌丝，无菌水离心洗涤3 次后，液氮研磨直至菌丝成白色细粉末状，将研磨好的粉末分装于1.5 mL 无菌EP 管中，按照Fungal RNA Kit试剂盒说明书的步骤进行菌体RNA 的提取[20]。
1.2.5 样品检测与文库构建
RNA 提 取 后，分 别 通 过Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100 等方法检测RNA 样品的纯度、浓度和完整性。样品检验通过后，再对其进行文库构建：以Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入Fragmentation Buffer 将mRNA 随机打断；以mRNA 为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成cDNA 链，并利用AMPure XP beads 纯化cDNA；纯化的双链cDNA 再进行末端修复、加A 尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads 进行片段大小选择；通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）富集得到cDNA 文库。文库构建完成后，分别使用Qubit2.0 和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小（insert size）进行检测，使用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，QPCR）方法对文库的有效浓度进行准确定量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling 后进行Illumina 测序，并产生150 bp 配对末端读数。
1.2.6 转录组数据数据质控与比对
测序片段经CASAVA 碱基识别转化为序列数据（reads），对原始数据进行过滤主要包括去除带接头、含N、低质量的reads。同时，还对clean data 进行了Q20、Q30 和GC 含量计算。后续所有研究都基于对clean data 所进行的高质量分析。在国家生物技术中心网站下载参考基因组和基因模型的注释文档。并通过HISAT2 v2.0.5 系统建立了参考基因组的索引，并将配对末端clean reads 和参考基因组比对[21]。
1.2.7 基因表达水平定量
FeatureCounts（1.5.0-p3）用于计算映射到每个基因的读数。根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。FPKM 指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量，是当前最常用于估计基因表达水平的方法。使用DESeq2软件（1.20.0）进行两个比较组合之间的差异表达分析。调整差异倍数对数的绝对值[|log2（FoldChange）|]≥1及矫正后的p 值（padj）≤0.05 的基因分配为差异表达基因。
1.2.8 转录组数据分析
通过clusterProfiler（3.8.1）软件实现差异表达基因的基因本体数据库（gene ontology，GO）富集分析，其中修正了基因长度偏差。padj≤0.05 的GO term 通过差异表达基因显著富集。以京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途径为单位，应用超几何检验，找出差异基因相对于所有注释基因显著富集的途径。
2 结果与分析
2.1 米曲霉T58 与出发菌株3.042 过氧化氢耐受性比较
曲酸作为一种抗氧化物可以缓解细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平过高导致的氧化还原状态失衡[20]。为了评估菌株T58 转化子的抗氧化能力，将菌株3.042 与T58 孢子悬液稀释后点种到分别添加10、15、20 mmol/L H2O2 CM 培养基上，以模拟氧化应激环境，30 ℃培养72 h 观察其在平板上的生长状态，结果如图1 所示。
图1 H2O2 胁迫下菌株的表型
Fig.1 Phenotypes of strains under H2O2 stress
A.T58 与3.042 在含有不同浓度H2O2 平板上培养各时间点的菌落形态；B.培养至72 h 时的菌落直径。*表示在0.01＜p＜0.05 水平差异显著；**表示在0.001＜p＜0.01 水平差异显著；***表示在p＜0.001水平差异显著；****表示在p＜0.000 1 水平差异显著。
由图1 可知，随着H2O2 浓度的增加，菌株3.042的生长能力逐渐下降，菌丝向外发散菌落呈圆形，气生菌丝较多，边缘白色菌丝致密，在含有20 mmol/L H2O2的平板上培养72 h 后仍无法萌发。同时，菌株T58 的菌落直径随着H2O2 浓度的增加逐渐减小，白色气生菌丝变得更加致密和蓬松，菌落形态较菌株3.042 相似，但孢子颜色更黄。两株菌受到H2O2 的胁迫后生长状况均下降，但在相同的培养时间，菌株3.042 菌株生长受到H2O2 的抑制作用均大于菌株T58。48 h 时菌株3.042 在浓度为15～20 mmol/L 的H2O2 环境中几乎看不到生长迹象，而菌株T58 的菌落直径明显大于菌株3.042，说明过表达kojR 增强了米曲霉抵御氧化应激的能力。
2.2 米曲霉T58 与出发菌株3.042 摇瓶发酵曲酸
将米曲霉菌株3.042 和菌株T58 号菌株按照方法1.2.3 进行曲酸发酵，每隔1 d 取样进行测定，结果如图2 所示。
图2 米曲霉3.042 和T58 号菌株发酵产曲酸分析
Fig.2 Kojic acid production by fermentation of Aspergillus oryzae strains 3.042 and T58
由图2 可知，菌株3.042 曲酸产量从第3 天起随着发酵时间延长持续上升直至接近发酵结束时略有下降，在发酵第6 天时产酸最高，为15.14 g/L；菌株T58仅在发酵第1 天就检测到少量曲酸，并且在第2～5 天时产量持续上升，在第5 天达到峰值为29.54 g/L，此时较菌株3.042 的10.12 g/L 高出191.9%，在随后的5～7 d产量逐渐下降。以上结果说明kojR 过表达后的菌株T58 号不仅曲酸的生物合成较对照提前约48 h 检测出，其曲酸产量在整个发酵周期均高于菌株3.042。因此，可作为一株曲酸高产菌与对照菌株进行下一步转录组测序，分析其转录特征。
2.3 米曲霉T58 与出发菌株3.042 的转录组差异分析
2.3.1 显著差异基因分析
与出发菌株3.042 的曲酸生产能力相比，菌株T58的产酸能力更强，发酵过程中产酸水平均高于出发菌株，且在发酵第3 天时产酸速率最高达到0.50 g/（L·h），发酵第4 天产酸速率降低到0.41 g/（L·h），说明第3 天的菌株T58 曲酸合成效率最高，而菌株3.042 才刚开始产酸，故选取发酵第3 天的菌体进行RNA 转录组的分析，分别命名为OER3d、WT3d。转录组测序后与米曲霉基因组进行比对，对所有差异基因进行比较分析，将两株菌的转录组数据，按照表达量差异倍数对数[log2（Foldchange）]的绝对值大于1 以及矫正后的表达差异显著性padj＜0.05 确定差异转录基因，绘制火山图和韦恩图，结果见图3。
图3 差异基因火山图和韦恩图
Fig.3 Volcano map and Wayne diagram of differential genes
A.差异基因火山图；B.差异基因韦恩图。
由图3A 可知，共有2 450 个显著性差异转录基因，其中包括1 203 个显著上调表达，1 247 个基因显著下调表达。由图3B 可知，OER3d 样品共检测到10 335个基因表达，而WT3d 样品共计10 287 个基因表达，其中两个样品间共同表达的基因为9 777 个。OER3d 样品特异表达的基因为558 个，WT3d 样品特异表达的基因为510 个。该结果表明，菌株T58 与3.042 相比，部分基因的转录模式发生改变。
2.3.2 T58 显著高表达基因分析
为了更进一步分析曲酸高产菌株的转录水平特征，根据log2（Foldchange）值统计了上调基因中表达差异倍数排序前20 个基因，结果见表1。
表1 OER3d 与WT3d 上调表达差异最显著的前20 个基因（OER3d FPKM＜1 000 舍去）
Table 1 Top 20 genes with the most significant differences in upregulated expression in OER3d and WT3d（OER3d FPKM＜1 000 rounded）
基因ID 5988140 5988139 5995325 5997790 5996459 5988440 OER3d FPKM 值3 549.88 1 326.26 10 736.18 6 393.06 24 448.18 17 929.01 WT3d FPKM 值2.93 1.43 13.17 10.61 46.32 37.90差异倍数对数值10.24 9.82 9.67 9.23 9.04 8.88 5998928 22 480.79 69.86 8.33基因描述*Quinone oxidoreductase-Hydroxylase/desaturase Probable hydrolase Trans-enoyl reductase NAD（P）H-dependent FMN reductase GMC oxidoreductase
续表1 OER3d 与WT3d 上调表达差异最显著的前20 个基因（OER3d FPKM＜1000 舍去）
Continue table 1 Top 20 genes with the most significant differences in up-regulated expression in OER3d and WT3d（OER3d FPKM＜1 000 rounded）
注：*均为在其它菌种中的注释；-表示该基因功能未知。
基因ID 5990659 OER3d FPKM 值4 326.31 WT3d FPKM 值22.54差异倍数对数值7.59 5997509 5989327 5994181 5988587 5988852 5990817 5991048 1 979.07 20 011.46 9 989.11 16 835.50 17 805.35 44 680.25 8 174.79 10.80 110.95 66.95 112.82 119.39 306.58 66.26 7.53 7.50 7.22 7.22 7.22 7.19 6.95 5999536 6 525.42 56.67 6.85 5989271 1 347.86 12.21 6.79 5999745 5993569 novel.182 9 144.45 2 312.61 6 296.94 104.21 33.91 103.53 6.45 6.08 5.93基因描述*NAD dependent epimerase/dehydratase ATPase family Trans-enoyl reductase NmrA-like family NmrA-like family NmrA-like family NmrA-like family Zinc-type alcohol dehydrogenase Alpha/beta hydrolase family Zinc-type alcohol dehydrogenase Putative nitroreductase Siderophore transporter NmrA-like family
如表1 所示，除1 个未被描述的基因（ID 号5988139）外，上调差异倍数最大的基因大部分被标记为氧化还原酶、水解酶和羟化酶，且表达量均为对照的60 倍以上，说明这些编码酶的基因在曲酸的生物合成中起着十分重要的作用。曲酸合成是葡萄糖经分解后直接合成，其代谢过程具有一系列脱氢氧化反应，上述差异高表达的酶基因可能参与葡萄糖转化为曲酸的生理生化反应中，但目前未见相关的报道，因此，关于该类基因的研究值得进一步挖掘。此外，图1 结果表明高产KA 菌株T58 的H2O2 耐受性明显增强，推测这些提高的酶类基因参与菌体清除活性氧的过程。
由表1 可知，5 个注释为NmrA（nitrogen metabolism repress）家族的基因比对照上调了60～149 倍。这是一种氮源代谢调控的抑制因子，其与AreA 协同作用参与菌体氮源的代谢，同时AreA 作为丝状真菌氮代谢中的关键转录因子，在真菌响应外界氮源、生长发育、次级代谢及抗逆过程中发挥了重要作用[22-23]。当存在优势氮源时，NmrA 结合到AreA 的C 末端使其失活，从而抑制其他与非优势氮源吸收和利用相关基因的表达[24]。在米曲霉中，该类基因在氮源代谢调控网络过程中的独立功能还不是很清楚，因此需要深入的研究。
2.3.3 T58 显著低表达基因分析
根据差异倍数排序统计了曲酸高产菌株较对照转录水平显著下调的前20 个基因，结果见表2。
表2 OER3d 与WT3d 下调表达差异最显著的前20 个基因（WT3d FPKM＜1 000 舍去）
Table 2 ant differences in down-regulated expression in OER3d and WT3d（WT3d FPKM＜1 000 rounded）
注：*均为在其它菌种中的注释；-表示该基因功能未知。
基因ID 基因描述*5996967 35119698 5988082 5987825 OER3d FPKM 值52.95 64.82 59.63 111.73 WT3d FPKM 值9 988.57 3 126.98 2 190.80 3 490.77差异倍数对数值-7.56-5.60-5.20-4.96 5999355 5992948 5988083 5992331 5998089 5999879 48.11 84.12 458.67 97.21 133.81 111.61 1 180.67 1 834.82 9 571.17 1 816.51 2 280.55 1 787.97-4.61-4.45-4.38-4.23-4.09-4.00 5990549 179.52 2 659.24-3.89 5994242 5996215 5987673 281.56 340.08 311.61 4 111.39 4 177.00 3 738.95-3.87-3.62-3.59 5999865 5997279 5999684 5989967 114.26 107.53 762.39 175.32 1 370.55 1 232.09 8 560.68 1 908.31-3.58-3.52-3.49-3.45 5997026 5998234 290.79 668.25 3 087.66 6 527.33-3.41-3.29 Fungal hydrophobin Nitrate reductase Nitrate transporter Oligopeptide transporter protein MAC/Perforin domain Aspergillopepsin-2 Nitrite reductase-Ferric reductase Probable peptide transporter 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase-Copper transport protein Major Facilitator Superfamily Amino-acid permease Alpha-glucosidase Formate dehydrogenase BrlA regulator of conidiophore Cysteine dioxygenase Allantoinase
如表2 所示，下调基因的差异倍数分别为对照的9.78～188.71 倍。说明除了表1 所示的该类上调基因参与曲酸生物合成，米曲霉发酵生产曲酸的过程还涉及到一些基因的沉默或低表达。下调倍数最高的为一个真菌疏水性蛋白，除该蛋白外，还有几个的具体功能在数据库中未被明确注释的基因，关于这些基因的功能还需进一步挖掘。由表2 可知，3 个有关硝酸还原及转运和2 个氨基酸利用相关基因的转录水平均显著下调，推测该类基因与氮源的吸收利用有关，结合表1中上调的5 个NmrA 家族基因，说明曲酸的发酵过程与菌体的氮代谢水平紧密相关。有研究表明，相对于碳源，氮源的种类和数量对于曲酸产量的影响更为显著[6]。此外，调节分生孢子发育的brlA 基因的转录水平较对照下调了约10.93 倍，这与先前的研究结果一致，即曲酸产量与brlA 基因表达水平负相关[15-16]。
2.3.4 过氧化氢酶基因转录差异分析
过氧化氢酶（catalase，CAT）作为H2O2 的消除酶广泛存在于原核和真核生物中，其对于维持生物体正常氧化还原水平具有重要的生物学意义。CAT 的转录水平受到严格调控，正常条件下维持菌体内适当浓度的H2O2 水平以促进生物体的生长发育，在胁迫条件下则会平衡过多的氧自由基等氧化物带来的损害[25]。结合图1 结果可知菌株T58 的H2O2 耐受性较菌株3.042显著提高，将转录组中标记为过氧化氢酶的基因列表，如表3 所示。
表3 OER3d 与WT3d 过氧化氢酶基因（OER3d FPKM＜1 000舍去）
Table 3 Catalase genes in OER3d and WT3d（OER3d FPKM＜1 000 rounded）
注：*均为在其它菌种中的注释。
基因ID 5995093 5999806 5996092 5998261 OER3d FPKM 值1 0052.65 15 043.12 9 962.65 4 031.30 WT3d FPKM 值2 420.69 6 478.19 5 132.94 2 522.56差异倍数对数值2.05 1.22 0.96 0.68基因描述Catalase A*Catalase-peroxidase Catalase B Peroxisomal catalase*
由表3 可知，菌株T58 中4 个编码CAT 的基因分别为对照的1.60～4.14 倍，并且不同类型CAT 的FPKM 值均为4 000 以上。以上结果表明，菌株T58的H2O2 耐受性增强归因于CAT 基因的高水平转录。
2.4 差异表达基因的聚类分析
2.4.1 显著差异基因的GO 分析
GO 是描述基因功能的综合性数据库，可分为分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC）和生物过程（biological process，BP）3 个部分。GO 功能富集对显著差异基因进行富集，并依次按MF、CC 和BP 的顺序选取各功能类中最显著的10 个条目绘制散点图进行分析展示，如图4 所示。
图4 GO 富集分析散点图
Fig.4 Scatter plot of GO enrichment analysis
图4 中注释为分子功能的10 个二级条目中的差异基因显著性最强，远大于其余2 项。说明该类条目下的基因在曲酸生物合成中起着十分重要的作用。其中，转运活性与辅酶结合二级条目下的显著基因差异性最大，数目最多，推测该类条目下的差异基因分别与曲酸的生物合成以及转运密切相关。
2.4.2 菌株T58 转运蛋白差异基因表达分析
菌株T58 相比出发菌株具有较强的产曲酸能力，其中曲酸的转运是其关键因素之一，因此将GO 分析结果中转运活性条目下log2（Foldchange）值前10 的上调基因进行分析，结果见表4。
表4 OER3d 与WT3d 转运蛋白上调表达差异最显著的前10 个基因
Table 4 Top 10 genes with the most significant differences in upregulated transporter proteins of OER3d and WT3d
注：*均为在其它菌种中的注释。
基因描述*Fungal trichothecene efflux pump ZIP Zinc transporter ZIP Zinc transporter Major intrinsic protein ABC-transporter N-terminal ABC transporter transmembrane Na_H_Exchanger ZIP Zinc transporter High-affinity glucose transporter ZIP Zinc transporter基因ID 5993569 OER3d FPKM 值2 312.61 WT3d FPKM 值33.91差异倍数对数值6.08 5993077 5989097 5992512 5995055 372.87 4 916.02 553.64 9 720.13 9.26 269.09 60.51 1 327.49 5.33 4.19 3.19 2.87 5988162 397.35 62.42 2.67 5994388 5998756 5991889 11 222.60 4 593.89 3 454.42 2 074.42 992.27 864.98 2.44 2.21 2.00 5990374 2 836.41 804.99 1.82
如表4 所示，10 个上调的编码转运蛋白的基因分别为对照的3.52～68.20 倍。其中包括4 个锌铁转运蛋白（zinc-regulated transporter，iron-regulated transporterlike protein，ZIP）家族的锌调节转运蛋白，2 个ATP 结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白，二者均属典型的转运蛋白超家族。ZIP 家族的转运蛋白在生物体中普遍存在，平衡Zn 和Fe 等具有催化和结构作用的金属离子的吸收和利用，ZIP 蛋白参与金属稳态、酶活性、次生代谢物产生和应激反应等一系列生物过程[26]。目前还不清楚锌/铁调控的转运蛋白对米曲霉曲酸生产的影响。ABC 转运蛋白通过水解ATP 获得能量从而实现底物的跨膜运输等功能，在植物中，该类转运蛋白可以平衡次级代谢产物如生物碱的浓度，以保护细胞免受伤害[26]。此外，研究表明ABC转运蛋白还参与真菌氨基酸、糖类等物质的运输，但目前关于该类转运蛋白家族在米曲霉曲酸发酵中的功能还尚不明确。菌株T58 中表达量最高的转运蛋白注释为钠/氢离子转运体，这类蛋白的转运过程依赖于离子交换。其在曲酸高产菌株中的高水平表达说明，该转运蛋白可能直接参与曲酸及其中间体的转运。一个高效葡萄糖转运蛋白HGT1 在菌株T58 中表达量显著提高，有研究表明在黑曲霉中，该蛋白的高水平表达有助于提高菌体对葡萄糖的利用率，从而提高柠檬酸的产量[27]。目前没有研究报道该转运蛋白是否影响米曲霉的KA 合成，但葡萄糖作为KA 生物合成的底物，提高其利用率可能直接导致目标产物KA 产量的提升。相关研究亟待开展。
3 结论
本研究对OEkojR 的T58 米曲霉转化子与对照进行了过氧化氢耐受性比较、摇瓶发酵曲酸和RNA-Seq转录组分析，以考察不同曲酸产量的米曲霉在转录组水平的内在差异。结果显示，菌株T58 的抗氧化能力增强，过氧化氢酶转录水平显著提高。其KA 合成较对照提前约48 h 检测出，在发酵第5 天产量为对照的191.9%。测序结果表明，菌株T58 的基因转录模式与3.042 存在明显的差异，编码氧化还原酶的基因转录水平较对照大幅上调，可能参与曲酸生物合成过程中间体的生理生化反应，但与氮源利用相关基因的转录水平下降，说明米曲霉的曲酸发酵与其氮代谢水平密切相关。GO 分析发现，菌株T58 转运蛋白与对照的差异性最大且数目最多，推测该类转运蛋白参与了KA的合成过程。本研究结果为了解丝状真菌米曲霉曲酸生物合成的内在机制及其影响提供了一些线索。研究中大部分高表达基因和显著差异表达基因的功能在米曲霉中并不明确，表明与曲酸有关的部分关键基因及其功能还比较欠缺，值得进一步研究。
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